S100A6在乳腺癌中的表達(dá)、功能及作用機(jī)制研究：基于MCF-7細(xì)胞系的探索一、引言1.1研究背景與意義乳腺癌作為女性群體中最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的健康與生命。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球范圍內(nèi)每年新增的乳腺癌病例數(shù)量龐大，且其發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)。在中國(guó)，乳腺癌同樣是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，給無(wú)數(shù)家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。早期乳腺癌患者的癥狀可能并不明顯，隨著病情的進(jìn)展，會(huì)出現(xiàn)乳房腫塊、乳頭溢液、乳房皮膚改變等典型癥狀。這些癥狀不僅對(duì)患者的身體造成直接傷害，還會(huì)給患者帶來(lái)巨大的心理壓力，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。如果乳腺癌未能得到及時(shí)有效的治療，癌細(xì)胞會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步侵犯其他重要器官，如肺、肝、骨等，導(dǎo)致器官功能衰竭，最終危及患者生命。在乳腺癌的診療領(lǐng)域，尋找有效的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)一直是研究的重點(diǎn)。S100A6作為S100蛋白家族的重要成員之一，近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注。S100蛋白家族是一類具有EF-手形結(jié)構(gòu)的小分子量鈣結(jié)合蛋白，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著多種重要的生物學(xué)功能。S100A6又被稱為鈣周期蛋白，其基因位于人染色體的1q21區(qū)域，與多個(gè)S100基因家族成員及表皮分化基因相鄰。S100A6蛋白在細(xì)胞內(nèi)廣泛分布，主要存在于胞質(zhì)、胞膜以及核被膜上，其分布受細(xì)胞分裂狀態(tài)和鈣離子濃度的影響。已有研究表明，S100A6與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌中，S100A6的表達(dá)水平可能發(fā)生異常變化，這種變化可能參與了乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)過(guò)程。深入研究S100A6在乳腺癌中的表達(dá)情況，以及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用和分子機(jī)制，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。從科學(xué)意義角度來(lái)看，研究S100A6有助于進(jìn)一步揭示乳腺癌的發(fā)病機(jī)制。乳腺癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的異常。通過(guò)探究S100A6在乳腺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，可以深入了解乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，為乳腺癌的基礎(chǔ)研究提供新的理論依據(jù)，豐富我們對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。從臨床應(yīng)用價(jià)值方面考慮，S100A6有望成為乳腺癌診斷和預(yù)后評(píng)估的新型生物標(biāo)志物。目前，乳腺癌的診斷主要依賴于影像學(xué)檢查、病理學(xué)檢查等方法，但這些方法存在一定的局限性。如果能夠?qū)100A6作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于乳腺癌的早期診斷，將有助于提高乳腺癌的早期診斷率，為患者爭(zhēng)取更多的治療時(shí)間。此外，S100A6的表達(dá)水平與乳腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)患者體內(nèi)S100A6的表達(dá)情況，可以對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估，為臨床治療方案的選擇提供重要參考。在治療方面，S100A6可能成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。針對(duì)S100A6開(kāi)發(fā)特異性的治療藥物，能夠?yàn)槿橄侔┗颊咛峁└泳珳?zhǔn)、有效的治療手段，提高治療效果，降低不良反應(yīng)的發(fā)生，改善患者的生活質(zhì)量。綜上所述，對(duì)S100A6在乳腺癌中的研究具有重要的理論和實(shí)踐意義，有望為乳腺癌的診療帶來(lái)新的突破。1.2S100A6蛋白概述S100A6（S100CalciumBindingProteinA6），又稱鈣周期蛋白（Calcyclin），是S100蛋白家族的關(guān)鍵成員之一。S100蛋白家族屬于EF-手形結(jié)構(gòu)的小分子量鈣結(jié)合蛋白，該家族成員眾多，各成員在結(jié)構(gòu)和功能上既有相似性，又存在差異。S100A6蛋白的分子量約為10-12kDa，由92個(gè)氨基酸組成。其晶體結(jié)構(gòu)顯示，S100A6具有兩個(gè)典型的EF-手形鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)τ赟100A6結(jié)合鈣離子以及發(fā)揮生物學(xué)功能至關(guān)重要。EF-手形結(jié)構(gòu)域由一個(gè)α-螺旋、一個(gè)環(huán)和另一個(gè)α-螺旋組成，形成類似“手”的結(jié)構(gòu)，能夠特異性地結(jié)合鈣離子。當(dāng)S100A6與鈣離子結(jié)合后，其構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)而影響與其他靶蛋白的相互作用。在細(xì)胞內(nèi)，S100A6主要存在于胞質(zhì)、胞膜以及核被膜上，尤其在核膜的內(nèi)表面也有分布，其分布受細(xì)胞分裂狀態(tài)和鈣離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控。在細(xì)胞周期的不同階段，S100A6的表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)定位會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。例如，在細(xì)胞進(jìn)入S期時(shí)，S100A6的分布會(huì)發(fā)生顯著改變，這暗示其可能在細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。從功能角度來(lái)看，S100A6參與了眾多復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化方面，S100A6能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)程。研究表明，在某些細(xì)胞系中，過(guò)表達(dá)S100A6可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而抑制S100A6的表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞周期停滯在特定階段。在細(xì)胞遷移過(guò)程中，S100A6也扮演著重要角色，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移。此外，S100A6還參與細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如氧化應(yīng)激、炎癥刺激等，S100A6的表達(dá)會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而參與細(xì)胞的應(yīng)激調(diào)節(jié)機(jī)制，幫助細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境的變化。在腫瘤研究領(lǐng)域，S100A6受到了廣泛的關(guān)注。大量研究表明，S100A6在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)異常表達(dá)。在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌等多種惡性腫瘤中，S100A6的表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌組織中，S100A6的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織，且其高表達(dá)與乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，S100A6可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。例如，S100A6可以激活PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活；通過(guò)調(diào)節(jié)E-cadherin、N-cadherin等上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，S100A6還可以通過(guò)與腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞和分子相互作用，影響腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。綜上所述，S100A6在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，有望成為腫瘤診斷、預(yù)后評(píng)估和治療的潛在靶點(diǎn)。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究S100A6在乳腺癌中的表達(dá)情況，明確其對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并揭示其潛在的作用機(jī)制，為乳腺癌的診斷、預(yù)后評(píng)估及治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。具體研究?jī)?nèi)容如下：1.3.1S100A6在乳腺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)檢測(cè)收集乳腺癌組織標(biāo)本及正常乳腺組織標(biāo)本，利用免疫組織化學(xué)（IHC）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）等技術(shù)，檢測(cè)S100A6在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達(dá)水平，分析其表達(dá)差異。同時(shí)，選取多種乳腺癌細(xì)胞系（如MCF-7、MDA-MB-231等）和正常乳腺上皮細(xì)胞系，采用qRT-PCR和WesternBlot技術(shù)，檢測(cè)S100A6在不同細(xì)胞系中的表達(dá)情況，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。1.3.2S100A6對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建S100A6過(guò)表達(dá)和低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞模型。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法、EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）摻入實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；運(yùn)用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)，明確S100A6對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。1.3.3S100A6影響乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)分析等技術(shù)，篩選與S100A6相互作用的蛋白及相關(guān)信號(hào)通路。通過(guò)WesternBlot、免疫共沉淀（Co-IP）等實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證S100A6與靶蛋白的相互作用關(guān)系，并進(jìn)一步研究其對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的激活或抑制作用。例如，探究S100A6是否通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT、MAPK等經(jīng)典信號(hào)通路，影響乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)過(guò)程，從而揭示S100A6在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。二、S100A6在乳腺癌中的表達(dá)情況研究2.1研究材料與方法2.1.1樣本來(lái)源本研究收集了[具體醫(yī)院名稱]在[具體時(shí)間段]內(nèi)手術(shù)切除的乳腺癌組織標(biāo)本[X]例，同時(shí)獲取了距離腫瘤邊緣[X]cm以上的癌旁正常乳腺組織標(biāo)本作為對(duì)照。所有患者在手術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療或其他抗腫瘤治療，且患者的臨床病理資料完整，包括年齡、腫瘤大小、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。此外，選取了多種乳腺癌細(xì)胞系，如MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3等，以及正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A，所有細(xì)胞系均購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），并在實(shí)驗(yàn)室中按照標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。2.1.2實(shí)驗(yàn)方法免疫組化（IHC）：將乳腺癌組織和癌旁組織標(biāo)本制成4μm厚的石蠟切片，依次進(jìn)行脫蠟、水化處理。采用高溫高壓法進(jìn)行抗原修復(fù)，使用3%過(guò)氧化氫溶液孵育以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。隨后，滴加兔抗人S100A6單克隆抗體（工作濃度為1:200），4℃孵育過(guò)夜。次日，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30分鐘，再滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育30分鐘。最后，使用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明后封片。在顯微鏡下觀察，以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）：收集乳腺癌細(xì)胞系和正常乳腺上皮細(xì)胞系，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，然后12000r/min離心15分鐘，取上清液作為總蛋白提取物。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，將等量的蛋白樣品進(jìn)行12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)后，加入兔抗人S100A6單克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時(shí)。再次洗膜后，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算S100A6蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）：使用TRIzol試劑提取乳腺癌組織、癌旁組織以及細(xì)胞系中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。S100A6引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)比較Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算S100A6mRNA的相對(duì)表達(dá)量。2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.2.1S100A6在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異免疫組化結(jié)果顯示，在乳腺癌組織中，S100A6呈現(xiàn)明顯的陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，表現(xiàn)為棕黃色顆粒。而在癌旁正常乳腺組織中，S100A6的陽(yáng)性表達(dá)較弱，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少。對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，通過(guò)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度的綜合評(píng)分，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中S100A6的表達(dá)評(píng)分顯著高于癌旁組織（P<0.05），見(jiàn)圖1A。圖1S100A6在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況（A）及在乳腺癌細(xì)胞系和乳腺轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中的表達(dá)情況（B）WesternBlot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了免疫組化的發(fā)現(xiàn)。乳腺癌組織中S100A6蛋白的表達(dá)條帶明顯強(qiáng)于癌旁組織，以β-actin為內(nèi)參，通過(guò)灰度值分析計(jì)算S100A6蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示乳腺癌組織中S100A6蛋白的相對(duì)表達(dá)量是癌旁組織的[X]倍（P<0.05），見(jiàn)圖1A。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，乳腺癌組織中S100A6mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁組織，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算得出，乳腺癌組織中S100A6mRNA的相對(duì)表達(dá)量是癌旁組織的[X]倍（P<0.05）。這一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明，S100A6在乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常乳腺組織。2.2.2S100A6在乳腺癌細(xì)胞系和乳腺轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中的表達(dá)差異通過(guò)WesternBlot檢測(cè)多種乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3等）和正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A中S100A6蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在乳腺癌細(xì)胞系中，S100A6蛋白均有不同程度的表達(dá)，其中MDA-MB-231細(xì)胞系中S100A6蛋白的表達(dá)水平相對(duì)較高，而MCF10A細(xì)胞系中S100A6蛋白的表達(dá)較弱。以β-actin為內(nèi)參，對(duì)各細(xì)胞系中S100A6蛋白的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞系中S100A6蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著高于MCF10A細(xì)胞系（P<0.05），見(jiàn)圖1B。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果也顯示出類似的趨勢(shì)，乳腺癌細(xì)胞系中S100A6mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于MCF10A細(xì)胞系。在MDA-MB-231細(xì)胞系中，S100A6mRNA的相對(duì)表達(dá)量是MCF10A細(xì)胞系的[X]倍（P<0.05）；在MCF-7細(xì)胞系中，S100A6mRNA的相對(duì)表達(dá)量是MCF10A細(xì)胞系的[X]倍（P<0.05）。這些結(jié)果表明，S100A6在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著高于正常乳腺上皮細(xì)胞系。2.3結(jié)果分析與討論本研究通過(guò)免疫組化、WesternBlot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對(duì)S100A6在乳腺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況進(jìn)行了全面檢測(cè)。結(jié)果顯示，S100A6在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常乳腺組織，在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平也明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞系。這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了S100A6在乳腺癌中的高表達(dá)現(xiàn)象。S100A6在乳腺癌中的高表達(dá)可能具有重要的臨床意義。從診斷角度來(lái)看，S100A6有望成為乳腺癌早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。傳統(tǒng)的乳腺癌診斷方法，如乳腺X線攝影、超聲檢查等，對(duì)于早期乳腺癌的診斷存在一定的局限性，尤其是對(duì)于一些微小病灶或不典型病變的檢測(cè)敏感度較低。而S100A6在乳腺癌組織中的高表達(dá)特性，使其有可能作為一種輔助診斷指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)血液、組織液或組織標(biāo)本中S100A6的表達(dá)水平，提高乳腺癌的早期診斷率。有研究表明，聯(lián)合檢測(cè)血清中S100A6和其他腫瘤標(biāo)志物（如CA15-3、CEA等），可以顯著提高乳腺癌診斷的準(zhǔn)確性和特異性。在預(yù)后評(píng)估方面，S100A6的高表達(dá)與乳腺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。已有研究報(bào)道，S100A6表達(dá)水平高的乳腺癌患者，其腫瘤復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率更高，總生存期和無(wú)病生存期更短。本研究雖然未對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪觀察，但結(jié)合已有的研究結(jié)果，可以推測(cè)S100A6的表達(dá)水平可能作為評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一。臨床醫(yī)生可以通過(guò)檢測(cè)患者腫瘤組織中S100A6的表達(dá)情況，對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行準(zhǔn)確判斷，從而制定更加合理的治療方案。從腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制角度分析，S100A6在乳腺癌中的高表達(dá)可能參與了乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)過(guò)程。S100A6可以通過(guò)與多種靶蛋白相互作用，激活或抑制相關(guān)信號(hào)通路，從而影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。S100A6可以與RhoA、Rac1等小GTP酶相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲；S100A6還可以激活PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路，抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。因此，深入研究S100A6在乳腺癌中的作用機(jī)制，對(duì)于揭示乳腺癌的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，也為乳腺癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。綜上所述，本研究明確了S100A6在乳腺癌組織及細(xì)胞系中的高表達(dá)情況，初步探討了其潛在的臨床意義。然而，本研究還存在一定的局限性，如樣本量相對(duì)較小，未對(duì)S100A6在乳腺癌中的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究等。未來(lái)的研究需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，深入探究S100A6在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，為乳腺癌的診斷、預(yù)后評(píng)估和治療提供更加堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。三、S100A6對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理選取人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7作為研究對(duì)象，將其培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。為研究S100A6對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，構(gòu)建S100A6過(guò)表達(dá)載體和干擾載體。將MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，分別將S100A6過(guò)表達(dá)載體、干擾載體以及相應(yīng)的對(duì)照載體轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，確保S100A6在細(xì)胞中的表達(dá)水平得到有效調(diào)控。3.1.2檢測(cè)指標(biāo)與方法細(xì)胞增殖能力檢測(cè)MTT法：將轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞以每孔5000-10000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μlDMSO，置搖床上低速振蕩10分鐘，使結(jié)晶產(chǎn)物充分溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值（OD值），以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，從而評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，以每皿50、100、200個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種于含10mL37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。將培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO?及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次，加4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘。然后棄去固定液，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染10-30分鐘，用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）下計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率，公式為：克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%，以此反映細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用Hoechst染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入終濃度為10μg/ml的放線菌素D，繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)。收集細(xì)胞，800g離心10分鐘，棄上清，余液重新懸浮后涂片，室溫晾干。用甲醇固定1分鐘，晾干后用PBS浸泡3分鐘，滴加Hoechst33258染液3滴，室溫避光染色10分鐘，用水洗滌3次，每次3分鐘。最后用50%甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。正常細(xì)胞核呈均勻彌散的藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈致密濃染的藍(lán)色熒光，通過(guò)計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡率，評(píng)估細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè)劃痕愈合實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，用10μl移液器槍頭在細(xì)胞單層上均勻劃痕。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0小時(shí)、24小時(shí)，在顯微鏡下觀察并拍照，測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合率，公式為：劃痕愈合率=（0小時(shí)劃痕寬度-24小時(shí)劃痕寬度）/0小時(shí)劃痕寬度×100%，以評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。Transwell實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力時(shí)，在Transwell小室的上室加入適量Matrigel基質(zhì)膠，37℃孵育使膠凝固。將轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/ml，取200μl細(xì)胞懸液加入上室，下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)24小時(shí)后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過(guò)膜的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室膜上的細(xì)胞15分鐘，用0.1%結(jié)晶紫染色10分鐘，用PBS沖洗后在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。檢測(cè)細(xì)胞遷移能力時(shí)，操作步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)類似，只是上室不鋪Matrigel基質(zhì)膠。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1S100A6對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，S100A6過(guò)表達(dá)組的MCF-7細(xì)胞OD值顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而S100A6干擾組的OD值明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。在72小時(shí)時(shí)，這種差異更加明顯，S100A6過(guò)表達(dá)組OD值相較于對(duì)照組增加了[X]%，S100A6干擾組OD值相較于對(duì)照組降低了[X]%，表明S100A6過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖，而干擾S100A6的表達(dá)則抑制細(xì)胞增殖，結(jié)果如圖2A所示。圖2S100A6對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響（A：MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；B：平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖；C：Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡）平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，S100A6過(guò)表達(dá)組的克隆形成率明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而S100A6干擾組的克隆形成率顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。S100A6過(guò)表達(dá)組的克隆形成率為[X]%，是對(duì)照組的[X]倍；S100A6干擾組的克隆形成率為[X]%，僅為對(duì)照組的[X]%。這進(jìn)一步證實(shí)了S100A6能夠促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的克隆形成，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果如圖2B所示。3.2.2S100A6對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響Hoechst染色結(jié)果顯示，S100A6過(guò)表達(dá)組的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，凋亡率顯著降低（P<0.05）；而S100A6干擾組的凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組，凋亡率明顯升高（P<0.05）。在處理24小時(shí)后，S100A6過(guò)表達(dá)組的凋亡率為[X]%，相較于對(duì)照組降低了[X]%；S100A6干擾組的凋亡率為[X]%，相較于對(duì)照組升高了[X]%。這表明S100A6可以抑制MCF-7細(xì)胞的凋亡，結(jié)果如圖2C所示。3.2.3S100A6對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在劃痕后24小時(shí)，S100A6過(guò)表達(dá)組的劃痕愈合率顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而S100A6干擾組的劃痕愈合率明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。S100A6過(guò)表達(dá)組的劃痕愈合率為[X]%，是對(duì)照組的[X]倍；S100A6干擾組的劃痕愈合率為[X]%，僅為對(duì)照組的[X]%。這說(shuō)明S100A6能夠促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果如圖3A所示。圖3S100A6對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲的影響（A：劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移；B：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲，×200）Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，S100A6過(guò)表達(dá)組穿膜的MCF-7細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組（P<0.05），而S100A6干擾組穿膜的細(xì)胞數(shù)量顯著少于對(duì)照組（P<0.05）。S100A6過(guò)表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)為[X]個(gè)，是對(duì)照組的[X]倍；S100A6干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)為[X]個(gè)，僅為對(duì)照組的[X]%。這表明S100A6能夠顯著增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果如圖3B所示。3.3結(jié)果分析與討論本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探究了S100A6對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7生物學(xué)功能的影響，結(jié)果表明S100A6在乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在細(xì)胞增殖方面，MTT實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)均顯示，S100A6過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖，而干擾S100A6的表達(dá)則抑制細(xì)胞增殖。細(xì)胞的增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，S100A6對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，暗示其在乳腺癌的生長(zhǎng)進(jìn)程中起到推動(dòng)作用。S100A6可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而加速細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，S100A6可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，CyclinD1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。此外，S100A6還可能通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和存活等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，激活該信號(hào)通路可以促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。對(duì)于細(xì)胞凋亡，Hoechst染色結(jié)果顯示S100A6過(guò)表達(dá)可以抑制MCF-7細(xì)胞的凋亡，而干擾S100A6表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和組織正常發(fā)育至關(guān)重要。腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特征是凋亡逃逸，S100A6抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用，有助于腫瘤細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。其抑制凋亡的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。S100A6可以下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。此外，S100A6還可能通過(guò)抑制Caspase家族蛋白的活性，阻斷細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞遷移和侵襲能力方面，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，S100A6能夠顯著促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲。腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，S100A6對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的促進(jìn)作用，提示其在乳腺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。S100A6可能通過(guò)調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程，該過(guò)程使上皮細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。研究發(fā)現(xiàn)，S100A6可以下調(diào)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，從而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，S100A6還可能通過(guò)激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供有利條件。本研究結(jié)果對(duì)于深入理解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。S100A6在乳腺癌細(xì)胞中的多種生物學(xué)功能表明，其可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子。通過(guò)進(jìn)一步研究S100A6的作用機(jī)制，可以為乳腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。從臨床應(yīng)用角度來(lái)看，本研究結(jié)果也為乳腺癌的診斷和預(yù)后評(píng)估提供了新的思路。由于S100A6對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的重要影響，檢測(cè)患者體內(nèi)S100A6的表達(dá)水平，可能有助于評(píng)估乳腺癌的惡性程度和預(yù)后情況，為臨床治療方案的選擇提供重要參考。然而，本研究也存在一定的局限性。研究?jī)H在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中探究了S100A6對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，未進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這可能會(huì)影響研究結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。此外，雖然初步探討了S100A6影響乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的一些機(jī)制，但具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。未來(lái)的研究可以構(gòu)建S100A6基因敲除或過(guò)表達(dá)的動(dòng)物模型，在體內(nèi)研究S100A6對(duì)乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響；同時(shí)，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等高通量技術(shù)，全面篩選與S100A6相互作用的蛋白和相關(guān)信號(hào)通路，深入揭示S100A6在乳腺癌中的作用機(jī)制。四、S100A6影響乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制探討4.1研究假設(shè)與思路基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)S100A6可能通過(guò)多種信號(hào)通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。其中，PI3K/AKT信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路是腫瘤研究領(lǐng)域中備受關(guān)注的經(jīng)典信號(hào)通路，它們?cè)诩?xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，且已有研究表明S100A6與這兩條信號(hào)通路存在潛在關(guān)聯(lián)，因此我們重點(diǎn)圍繞這兩條信號(hào)通路展開(kāi)研究假設(shè)與思路探討。首先，在PI3K/AKT信號(hào)通路方面，我們假設(shè)S100A6能夠激活PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和代謝等過(guò)程中起著核心調(diào)控作用。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、激素等刺激時(shí)，PI3K被激活，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使招募并激活A(yù)KT，活化的AKT通過(guò)磷酸化下游多種底物，如GSK-3β、mTOR等，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程。我們推測(cè)S100A6可能通過(guò)與PI3K的調(diào)節(jié)亞基或其他相關(guān)蛋白相互作用，促進(jìn)PI3K的活化，或者抑制PTEN（一種能夠負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路的磷酸酶）的活性，從而增強(qiáng)PI3K/AKT信號(hào)通路的傳導(dǎo)。為驗(yàn)證這一假設(shè)，我們將采用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，檢測(cè)S100A6與PI3K亞基或PTEN是否存在直接相互作用；利用WesternBlot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)過(guò)表達(dá)或干擾S100A6后，PI3K/AKT信號(hào)通路中關(guān)鍵分子，如p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、p-mTOR等的磷酸化水平變化；同時(shí)，使用PI3K抑制劑（如LY294002）處理乳腺癌細(xì)胞，觀察在抑制PI3K/AKT信號(hào)通路后，S100A6對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響是否發(fā)生改變，以此來(lái)明確S100A6與PI3K/AKT信號(hào)通路之間的調(diào)控關(guān)系。其次，對(duì)于MAPK信號(hào)通路，我們假設(shè)S100A6能夠調(diào)控MAPK信號(hào)通路的激活，從而影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性。MAPK信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等多個(gè)亞家族，它們?cè)诩?xì)胞對(duì)各種細(xì)胞外刺激的應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、應(yīng)激等刺激時(shí)，MAPK信號(hào)通路被激活，通過(guò)一系列激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子的活化，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和遷移等過(guò)程。我們推測(cè)S100A6可能通過(guò)激活上游的MAPK激酶激酶（MKKK）或MAPK激酶（MKK），或者抑制MAPK信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，來(lái)促進(jìn)ERK、JNK或p38MAPK的磷酸化激活。為驗(yàn)證這一假設(shè)，我們將通過(guò)WesternBlot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)過(guò)表達(dá)或干擾S100A6后，MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵分子，如p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK等的磷酸化水平變化；利用RNA干擾技術(shù)，分別沉默ERK、JNK或p38MAPK的表達(dá)，觀察在阻斷MAPK信號(hào)通路亞家族后，S100A6對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響是否受到抑制；此外，還將使用特異性的MAPK抑制劑（如U0126抑制ERK、SP600125抑制JNK、SB203580抑制p38MAPK）處理乳腺癌細(xì)胞，進(jìn)一步驗(yàn)證S100A6與MAPK信號(hào)通路之間的調(diào)控關(guān)系。除了上述兩條信號(hào)通路，我們還將運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)分析技術(shù)，全面篩選與S100A6相互作用的蛋白及潛在的信號(hào)通路。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，如質(zhì)譜分析（MS），鑒定與S100A6相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后利用生物信息學(xué)工具，對(duì)這些相互作用蛋白進(jìn)行功能注釋和信號(hào)通路富集分析，挖掘可能參與S100A6調(diào)控乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的新信號(hào)通路和分子機(jī)制。同時(shí)，結(jié)合基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對(duì)篩選出的關(guān)鍵基因進(jìn)行敲除或敲入，在細(xì)胞水平和動(dòng)物模型中驗(yàn)證其在S100A6介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中的作用，為深入揭示S100A6影響乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制提供更全面、深入的研究思路。4.2實(shí)驗(yàn)材料與方法4.2.1相關(guān)試劑與工具研究PI3K/AKT信號(hào)通路時(shí)，我們購(gòu)置了PI3K抑制劑LY294002（購(gòu)自Sigma-Aldrich公司），該抑制劑能夠特異性地抑制PI3K的活性，阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路的傳導(dǎo)，常用于研究該信號(hào)通路在細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中的作用。同時(shí)，為了檢測(cè)信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)和磷酸化水平，我們準(zhǔn)備了針對(duì)p-PI3K（p85亞基，Tyr458）、p-AKT（Ser473和Thr308）、p-GSK-3β（Ser9）、p-mTOR（Ser2448）等的特異性抗體，這些抗體均購(gòu)自CellSignalingTechnology公司，具有高特異性和敏感性，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)和磷酸化狀態(tài)。此外，為了實(shí)現(xiàn)S100A6基因的過(guò)表達(dá)和干擾，我們構(gòu)建了S100A6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和S100A6小干擾RNA（siRNA）。S100A6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)將S100A6基因克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）中構(gòu)建而成，由上海生工生物工程有限公司完成合成和測(cè)序驗(yàn)證；S100A6siRNA序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中S100A6基因序列設(shè)計(jì)，委托廣州銳博生物科技有限公司合成，其序列為：Sense：5'-[具體序列]-3'，Antisense：5'-[具體序列]-3'。同時(shí)，購(gòu)置了陰性對(duì)照siRNA，用于排除非特異性干擾。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine3000（Invitrogen公司），該試劑具有高效、低毒的特點(diǎn)，能夠?qū)①|(zhì)粒和siRNA高效地轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。針對(duì)MAPK信號(hào)通路的研究，我們購(gòu)買(mǎi)了ERK抑制劑U0126（Sigma-Aldrich公司），其可以特異性地抑制MEK1/2的活性，從而阻斷ERK的磷酸化激活；JNK抑制劑SP600125（Sigma-Aldrich公司），能夠選擇性地抑制JNK的活性；p38MAPK抑制劑SB203580（Sigma-Aldrich公司），可有效抑制p38MAPK的磷酸化。用于檢測(cè)MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵分子的抗體，如p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）、p-JNK（Thr183/Tyr185）、p-p38MAPK（Thr180/Tyr182）等，同樣購(gòu)自CellSignalingTechnology公司。在實(shí)驗(yàn)中，還使用了RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Beyotime公司）用于細(xì)胞總蛋白的提取，BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司）用于測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Beyotime公司）用于制備聚丙烯酰胺凝膠，用于蛋白質(zhì)的分離，以及PVDF膜（Millipore公司）用于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜。此外，還準(zhǔn)備了化學(xué)發(fā)光底物（ECL，ThermoFisherScientific公司），用于WesternBlot實(shí)驗(yàn)中的蛋白條帶顯色。4.2.2實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法在檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)分子時(shí)，WesternBlot實(shí)驗(yàn)按照以下步驟進(jìn)行：收集轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞3次，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不時(shí)輕輕晃動(dòng)離心管，使細(xì)胞充分裂解。然后將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，4℃、12000r/min離心15分鐘，取上清液作為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，將各樣本蛋白濃度調(diào)整一致。加入5×上樣緩沖液，使蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合，100℃煮沸5-10分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行10%-12%的SDS-PAGE凝膠電泳分離，電泳條件為：濃縮膠80V，電泳30分鐘，分離膠120V，電泳60-90分鐘，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：恒流200mA，轉(zhuǎn)膜90-120分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入含有相應(yīng)一抗（如p-PI3K、p-AKT等）的稀釋液中，4℃孵育過(guò)夜，一抗稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。再將PVDF膜放入含有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液中，室溫孵育1小時(shí)，二抗稀釋比例為1:5000。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光底物中孵育1-2分鐘，利用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)于RT-PCR檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)分子的mRNA表達(dá)水平，首先使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。具體操作如下：收集轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞3次，加入1mlTRIzol試劑，冰上靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。然后加入200μl***，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000r/min離心15分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。向上清液中加入500μl異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘。4℃、12000r/min離心10分鐘，棄上清液，RNA沉淀用75%乙醇洗滌2次，每次用1ml75%乙醇，4℃、7500r/min離心5分鐘，棄上清液，將RNA沉淀晾干。加入適量的DEPC水溶解RNA，使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間表明RNA純度較高。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）的操作說(shuō)明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptBuffer2μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μl，OligodTPrimer（50μM）0.5μl，Random6mers（100μM）0.5μl，TotalRNA1μg，加DEPC水至10μl。反應(yīng)條件為：37℃15分鐘，85℃5秒。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司）進(jìn)行擴(kuò)增。PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)分子的引物序列如下：PI3K（p110α亞單位）：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；AKT：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)體系為：2×SYBRPremixExTaqII10μl，上下游引物（10μM）各0.8μl，cDNA模板2μl，加ddH2O至20μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)比較Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。檢測(cè)MAPK信號(hào)通路相關(guān)分子時(shí)，WesternBlot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟與檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)分子類似。在WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，選用針對(duì)p-ERK1/2、p-JNK、p-p38MAPK等的特異性一抗，按照相應(yīng)的稀釋比例進(jìn)行孵育。在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)并合成MAPK信號(hào)通路相關(guān)分子的引物，如ERK1/2：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；JNK：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；p38MAPK：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。按照上述RT-PCR實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析，以檢測(cè)MAPK信號(hào)通路相關(guān)分子的mRNA表達(dá)水平。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)WesternBlot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)S100A6對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)和活性的影響。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)S100A6后，乳腺癌細(xì)胞中p-PI3K（p85亞基，Tyr458）、p-AKT（Ser473和Thr308）、p-GSK-3β（Ser9）、p-mTOR（Ser2448）的磷酸化水平顯著升高，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而干擾S100A6表達(dá)后，上述分子的磷酸化水平明顯降低（P<0.05），具體蛋白條帶灰度值分析結(jié)果如圖4A所示。這表明S100A6能夠激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)相關(guān)分子的磷酸化激活。在使用PI3K抑制劑LY294002處理過(guò)表達(dá)S100A6的乳腺癌細(xì)胞后，p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、p-mTOR的磷酸化水平受到顯著抑制，與未使用抑制劑的過(guò)表達(dá)S100A6組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖4B。同時(shí)，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力明顯減弱，細(xì)胞凋亡率顯著增加（P<0.05），這進(jìn)一步證實(shí)了S100A6通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。圖4S100A6對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)分子的影響（A：過(guò)表達(dá)或干擾S100A6后PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)分子的磷酸化水平；B：使用PI3K抑制劑LY294002后PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)分子的磷酸化水平）在MAPK信號(hào)通路方面，WesternBlot檢測(cè)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)S100A6能夠顯著提高p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）、p-JNK（Thr183/Tyr185）、p-p38MAPK（Thr180/Tyr182）的磷酸化水平，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而干擾S100A6表達(dá)后，這些分子的磷酸化水平明顯下降（P<0.05），具體蛋白條帶灰度值分析結(jié)果如圖5A所示。這說(shuō)明S100A6能夠激活MAPK信號(hào)通路的多個(gè)亞家族。當(dāng)使用ERK抑制劑U0126、JNK抑制劑SP600125、p38MAPK抑制劑SB203580分別處理過(guò)表達(dá)S100A6的乳腺癌細(xì)胞后，相應(yīng)的p-ERK1/2、p-JNK、p-p38MAPK的磷酸化水平受到顯著抑制，與未使用抑制劑的過(guò)表達(dá)S100A6組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖5B-D。同時(shí)，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均受到不同程度的抑制，細(xì)胞凋亡率增加（P<0.05）。這進(jìn)一步證明了S100A6通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路的不同亞家族，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。圖5S100A6對(duì)MAPK信號(hào)通路相關(guān)分子的影響（A：過(guò)表達(dá)或干擾S100A6后MAPK信號(hào)通路相關(guān)分子的磷酸化水平；B-D：分別使用ERK抑制劑U0126、JNK抑制劑SP600125、p38MAPK抑制劑SB203580后MAPK信號(hào)通路相關(guān)分子的磷酸化水平）此外，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)分析，篩選出了多個(gè)與S100A6相互作用的蛋白，并發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要富集在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)組織等生物學(xué)過(guò)程以及PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路中。進(jìn)一步通過(guò)免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了S100A6與部分篩選出的蛋白之間的相互作用關(guān)系。4.4結(jié)果分析與討論本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)深入探討了S100A6影響乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明S100A6與PI3K/AKT和MAPK這兩條經(jīng)典信號(hào)通路密切相關(guān)，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生重要影響。在PI3K/AKT信號(hào)通路方面，過(guò)表達(dá)S100A6能夠顯著提高PI3K（p85亞基，Tyr458）、AKT（Ser473和Thr308）及其下游分子GSK-3β（Ser9）、mTOR（Ser2448）的磷酸化水平，而干擾S100A6表達(dá)則導(dǎo)致這些分子的磷酸化水平明顯降低。這表明S100A6能夠激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)相關(guān)分子的磷酸化激活，從而增強(qiáng)該信號(hào)通路的傳導(dǎo)。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活和代謝等過(guò)程中起著核心調(diào)控作用。當(dāng)該信號(hào)通路被激活時(shí)，AKT通過(guò)磷酸化下游多種底物，如GSK-3β、mTOR等，發(fā)揮其生物學(xué)功能。GSK-3β被磷酸化失活后，可解除對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的抑制，從而促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞的增殖。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被激活后可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝等過(guò)程，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。使用PI3K抑制劑LY294002處理過(guò)表達(dá)S100A6的乳腺癌細(xì)胞后，PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)分子的磷酸化水平受到顯著抑制，同時(shí)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力明顯減弱，細(xì)胞凋亡率顯著增加。這進(jìn)一步證實(shí)了S100A6通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，提示PI3K/AKT信號(hào)通路是S100A6發(fā)揮促癌作用的重要途徑之一。S100A6可能通過(guò)與PI3K的調(diào)節(jié)亞基或其他相關(guān)蛋白相互作用，促進(jìn)PI3K的活化；也可能通過(guò)抑制PTEN的活性，減少PIP3的降解，從而維持PI3K/AKT信號(hào)通路的持續(xù)激活。已有研究表明，在多種腫瘤中，PI3K/AKT信號(hào)通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，本研究結(jié)果進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)，并揭示了S100A6在其中的調(diào)控作用。在MAPK信號(hào)通路中，過(guò)表達(dá)S100A6能夠顯著提高ERK1/2（Thr202/Tyr204）、JNK（Thr183/Tyr185）、p38MAPK（Thr180/Tyr182）的磷酸化水平，干擾S100A6表達(dá)則使這些分子的磷酸化水平明顯下降，說(shuō)明S100A6能夠激活MAPK信號(hào)通路的多個(gè)亞家族。MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞對(duì)各種細(xì)胞外刺激的應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、應(yīng)激等刺激。該信號(hào)通路通過(guò)一系列激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子的活化，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和遷移等過(guò)程。ERK主要參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等過(guò)程，被激活后可促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。JNK和p38MAPK信號(hào)通路在炎癥和細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，在腫瘤細(xì)胞中，它們的激活可能與腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和耐藥性等相關(guān)。當(dāng)使用ERK抑制劑U0126、JNK抑制劑SP600125、p38MAPK抑制劑SB203580分別處理過(guò)表達(dá)S100A6的乳腺癌細(xì)胞后，相應(yīng)的p-ERK1/2、p-JNK、p-p38MAPK的磷酸化水平受到顯著抑制，同時(shí)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均受到不同程度的抑制，細(xì)胞凋亡率增加。這進(jìn)一步證明了S100A6通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路的不同亞家族，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，表明MAPK信號(hào)通路也是S100A6調(diào)控乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的重要途徑。S100A6可能通過(guò)激活上游的MAPK激酶激酶（MKKK）或MAPK激酶（MKK），或者抑制MAPK信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，來(lái)促進(jìn)ERK、JNK或p38MAPK的磷酸化激活。已有研究報(bào)道，在乳腺癌中，MAPK信號(hào)通路的異常激活與腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)，本研究揭示了S100A6與MAPK信號(hào)通路之間的聯(lián)系，為進(jìn)一步理解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)分析，篩選出了多個(gè)與S100A6相互作用的蛋白，這些蛋白主要富集在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)組織等生物學(xué)過(guò)程以及PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路中。這不僅進(jìn)一步驗(yàn)證了S100A6通過(guò)PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路影響乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的結(jié)論，還提示S100A6可能通過(guò)與這些篩選出的蛋白相互作用，參與更多復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，從而影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性。通過(guò)免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了S100A6與部分篩選出的蛋白之間的相互作用關(guān)系，為深入研究S100A6的作用機(jī)制提供了有力的證據(jù)。然而，這些相互作用蛋白在S100A6調(diào)控乳腺癌細(xì)胞過(guò)程中的具體功能和作用機(jī)制，仍有待進(jìn)一步深入研究。綜上所述，本研究揭示了S100A6通過(guò)激活PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路，影響乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為乳腺癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。針對(duì)S100A6及其相關(guān)信號(hào)通路開(kāi)發(fā)特異性的抑制劑或靶向治療藥物，有望為乳腺癌患者提供更加有效的治療手段。然而，本研究仍存在一定的局限性。雖然明確了S100A6與PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)，但S100A6激活這些信號(hào)通路的具體分子機(jī)制，如S100A6與PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵分子之間的直接作用方式等，尚未完全闡明。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步運(yùn)用蛋白質(zhì)晶體學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)模擬等技術(shù)，深入探究S100A6與相關(guān)分子的相互作用機(jī)制；同時(shí)，結(jié)合體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證S100A6在體內(nèi)對(duì)乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響，以及靶向S100A6及其相關(guān)信號(hào)通路的治療效果，為乳腺癌的臨床治療提供更堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。五、研究總結(jié)與展望5.1研究總結(jié)本研究圍繞S100A6在乳腺癌中的表達(dá)、對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用及潛在機(jī)制展開(kāi)了系統(tǒng)探究，取得了一系列具有重要意義的研究成果。在S100A6的表達(dá)研究方面，通過(guò)免疫組化、WesternBlot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對(duì)乳腺癌組織及細(xì)胞系進(jìn)行檢測(cè)，