Tuftsin及抗原多肽聯(lián)合細(xì)胞免疫治療人結(jié)腸癌的實(shí)驗(yàn)研究：機(jī)制與療效探索一、引言1.1研究背景與意義結(jié)腸癌作為消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康。近年來(lái)，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，尤其在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)更為顯著。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新發(fā)結(jié)腸癌病例眾多，死亡人數(shù)也居高不下，在惡性腫瘤相關(guān)死亡中占據(jù)重要比例。在我國(guó)，隨著生活方式的改變和人口老齡化的加劇，結(jié)腸癌的發(fā)病率同樣呈現(xiàn)出明顯的上升態(tài)勢(shì)，已成為惡性腫瘤死亡的主要原因之一。傳統(tǒng)的結(jié)腸癌治療方法主要包括手術(shù)、化療和放療。手術(shù)切除是早期結(jié)腸癌的主要治療手段，但對(duì)于中晚期患者，手術(shù)往往難以徹底清除腫瘤，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高?；熀头暖熾m能在一定程度上抑制腫瘤生長(zhǎng)，但同時(shí)也會(huì)對(duì)正常組織和細(xì)胞造成損傷，引發(fā)一系列嚴(yán)重的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，且長(zhǎng)期療效有限。此外，腫瘤的耐藥性問(wèn)題也使得傳統(tǒng)治療方案的效果逐漸進(jìn)入平臺(tái)期，患者的生存改善面臨困境。隨著對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究的深入，免疫治療作為一種新興的腫瘤治療方法，逐漸成為研究熱點(diǎn)。免疫治療旨在通過(guò)激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。與傳統(tǒng)治療方法相比，免疫治療具有特異性高、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，為腫瘤患者帶來(lái)了新的希望。腫瘤特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞（CTL）在人體抗擊腫瘤的免疫網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著核心作用，它能夠特異性地識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞，是徹底清除腫瘤的關(guān)鍵因素。因此，如何誘導(dǎo)并擴(kuò)增出足夠數(shù)量且具有強(qiáng)大殺傷功能的CTL，成為實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞過(guò)繼治療療效的關(guān)鍵所在。樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）是目前已知的抗原遞呈能力最強(qiáng)的細(xì)胞，在誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫中扮演著至關(guān)重要的角色。DC能夠攝取、加工和遞呈腫瘤抗原，激活初始T細(xì)胞，使其分化為具有殺傷活性的CTL，從而啟動(dòng)特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。然而，由于腫瘤抗原性較弱，患者自身的DC可能存在低能或失能的情況，難以有效激發(fā)自身強(qiáng)有力的腫瘤特異性免疫。此外，腫瘤細(xì)胞還會(huì)通過(guò)多種機(jī)制逃避免疫監(jiān)視，如下調(diào)腫瘤抗原表達(dá)、分泌免疫抑制因子等，導(dǎo)致腫瘤免疫耐受的形成，進(jìn)一步阻礙了免疫治療的效果。為了打破腫瘤免疫耐受，增強(qiáng)腫瘤特異性免疫能力，優(yōu)化DC疫苗的制備條件成為重要途徑之一。目前，制備DC疫苗時(shí)常用的腫瘤抗原包括完整腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞裂解物、腫瘤細(xì)胞酸洗脫肽、腫瘤抗原多肽等。其中，腫瘤細(xì)胞裂解物包含的抗原表位最為完全，但對(duì)于一些失去手術(shù)機(jī)會(huì)或手術(shù)時(shí)未能留取自體腫瘤組織的患者來(lái)說(shuō)，無(wú)法利用該類抗原。而抗原多肽具有明確的抗原表位，易于制備和標(biāo)準(zhǔn)化，但其致敏DC后的療效仍有待進(jìn)一步研究和優(yōu)化。同時(shí)，DC細(xì)胞的成熟狀態(tài)也是影響抗原遞呈過(guò)程的重要因素。目前，DC負(fù)載抗原后常用腫瘤壞死因子-α（TNF-α）作為促成熟劑，但尋找效率更高的促進(jìn)DC成熟及活化的制劑，對(duì)于提高DC疫苗的療效具有重要意義。Tuftsin是一種由人體脾臟分泌的多肽類物質(zhì)，它能夠通過(guò)與細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬作用，從而達(dá)到殺傷腫瘤的效果。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，Tuftsin在腫瘤免疫治療中展現(xiàn)出一定的潛力，但對(duì)于DC的作用尚不明確，有待進(jìn)一步深入研究。將Tuftsin與抗原多肽聯(lián)合應(yīng)用于細(xì)胞免疫治療，有望通過(guò)協(xié)同作用，增強(qiáng)DC的功能，提高CTL的誘導(dǎo)效率和殺傷活性，從而為結(jié)腸癌的治療提供新的策略和方法。綜上所述，本研究旨在探討Tuftsin及抗原多肽聯(lián)合細(xì)胞免疫治療人結(jié)腸癌的可行性及有效性。通過(guò)應(yīng)用不同人結(jié)腸癌抗原致敏DC，并聯(lián)合不同促DC成熟劑制備DC疫苗，比較其對(duì)DC成熟狀態(tài)及功能的影響，觀察不同條件致敏DC細(xì)胞后誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞的效果，以及在體外及體內(nèi)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用。本研究的結(jié)果將為結(jié)腸癌的免疫治療提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，有望為臨床治療帶來(lái)新的突破，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，腫瘤免疫治療逐漸成為結(jié)腸癌治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞Tuftsin、抗原多肽及細(xì)胞免疫治療結(jié)腸癌展開(kāi)了廣泛而深入的研究，取得了一系列重要成果。在國(guó)外，免疫治療作為腫瘤治療的新興手段，受到了高度重視，針對(duì)結(jié)腸癌的免疫治療研究不斷深入。例如，有研究團(tuán)隊(duì)探索了多種免疫治療策略在結(jié)腸癌中的應(yīng)用，包括免疫檢查點(diǎn)抑制劑、腫瘤疫苗和過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療等。免疫檢查點(diǎn)抑制劑通過(guò)阻斷免疫檢查點(diǎn)分子，如程序性死亡受體1（PD-1）及其配體（PD-L1）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）等，解除腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制，增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤活性，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。在一些臨床試驗(yàn)中，免疫檢查點(diǎn)抑制劑在部分結(jié)腸癌患者中顯示出了較好的療效，尤其是對(duì)于微衛(wèi)星不穩(wěn)定型（MSI-H）結(jié)腸癌患者，其客觀緩解率和生存期得到了顯著改善。然而，對(duì)于微衛(wèi)星穩(wěn)定型（MSS）結(jié)腸癌患者，免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效相對(duì)有限，仍需進(jìn)一步探索聯(lián)合治療方案或新的治療靶點(diǎn)。腫瘤疫苗是另一種重要的免疫治療方法，旨在通過(guò)激發(fā)機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)來(lái)識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。其中，基于抗原多肽的腫瘤疫苗研究備受關(guān)注?？乖嚯木哂忻鞔_的抗原表位，能夠被抗原遞呈細(xì)胞（APC）攝取、加工和遞呈，從而激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答。一些研究嘗試將結(jié)腸癌相關(guān)的抗原多肽與佐劑聯(lián)合使用，以增強(qiáng)疫苗的免疫原性。例如，將癌胚抗原（CEA）、MUC1等抗原多肽與弗氏佐劑、CpG寡核苷酸等佐劑結(jié)合，在動(dòng)物模型中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，并對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。但在臨床應(yīng)用中，由于腫瘤抗原的異質(zhì)性、免疫逃逸機(jī)制以及個(gè)體免疫狀態(tài)的差異等因素，腫瘤疫苗的療效仍有待進(jìn)一步提高。過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療是將體外擴(kuò)增和激活的免疫細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，直接殺傷腫瘤細(xì)胞或激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。其中，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）和自然殺傷細(xì)胞（NK）是常用的效應(yīng)細(xì)胞。為了提高過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療的療效，研究人員不斷探索優(yōu)化免疫細(xì)胞的制備方法和激活策略。例如，通過(guò)基因工程技術(shù)修飾T細(xì)胞，使其表達(dá)嵌合抗原受體（CAR），能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的抗原，增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。在結(jié)腸癌的過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療研究中，一些臨床試驗(yàn)顯示出了一定的治療潛力，但也面臨著諸如細(xì)胞制備成本高、治療相關(guān)不良反應(yīng)等問(wèn)題。樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）作為體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，在腫瘤免疫治療中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，DC能夠攝取、加工和遞呈腫瘤抗原，激活初始T細(xì)胞，使其分化為具有殺傷活性的CTL，從而啟動(dòng)特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。為了提高DC疫苗的療效，研究人員嘗試采用不同的腫瘤抗原和促成熟劑來(lái)優(yōu)化DC的制備條件。例如，使用腫瘤細(xì)胞裂解物、腫瘤抗原多肽等作為腫瘤抗原，聯(lián)合腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、脂多糖（LPS）等促成熟劑，制備DC疫苗，并在動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，優(yōu)化后的DC疫苗能夠顯著增強(qiáng)DC的抗原遞呈能力和免疫激活功能，誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。Tuftsin作為一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的多肽，近年來(lái)在腫瘤免疫治療中的作用逐漸受到關(guān)注。國(guó)外研究表明，Tuftsin能夠與吞噬細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬作用，增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。此外，Tuftsin還能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。在一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將Tuftsin與化療藥物或其他免疫治療方法聯(lián)合使用，顯示出了協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，能夠提高腫瘤的治療效果。然而，Tuftsin在結(jié)腸癌免疫治療中的具體作用機(jī)制和應(yīng)用效果仍有待進(jìn)一步深入研究。在國(guó)內(nèi)，針對(duì)結(jié)腸癌的免疫治療研究也取得了積極進(jìn)展。許多科研團(tuán)隊(duì)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)開(kāi)展了相關(guān)的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)，致力于探索適合我國(guó)國(guó)情的結(jié)腸癌免疫治療方案。在抗原多肽方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)多種結(jié)腸癌相關(guān)抗原多肽進(jìn)行了研究，篩選出了一些具有潛在應(yīng)用價(jià)值的抗原表位。例如，通過(guò)生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了一些與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的抗原多肽，如HER-2、EGFR等抗原的相關(guān)多肽。將這些抗原多肽用于致敏DC，制備DC疫苗，并在動(dòng)物模型中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的CTL反應(yīng)，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有一定的殺傷作用。在DC疫苗的研究中，國(guó)內(nèi)團(tuán)隊(duì)在優(yōu)化DC的制備工藝和提高疫苗療效方面進(jìn)行了大量探索。一些研究嘗試使用不同的細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)方法來(lái)制備DC，以提高DC的質(zhì)量和數(shù)量。同時(shí)，通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用多種促成熟劑和免疫調(diào)節(jié)因子，增強(qiáng)DC的成熟度和免疫激活功能。例如，將TNF-α、IL-1β、IL-6等促成熟劑聯(lián)合使用，能夠更有效地促進(jìn)DC的成熟，提高其抗原遞呈能力和免疫激活作用。此外，國(guó)內(nèi)研究還關(guān)注了DC疫苗與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用，如與化療、放療、靶向治療等聯(lián)合，以發(fā)揮協(xié)同治療作用，提高結(jié)腸癌的治療效果。在Tuftsin的研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者也開(kāi)展了相關(guān)工作。研究發(fā)現(xiàn)，Tuftsin能夠促進(jìn)DC的吞噬功能和成熟，增強(qiáng)其抗原遞呈能力和免疫激活功能。將Tuftsin與抗原多肽聯(lián)合應(yīng)用于DC疫苗的制備，能夠進(jìn)一步提高DC疫苗的療效，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，負(fù)載抗原多肽聯(lián)合Tuftsin致敏DC后誘導(dǎo)的CTL，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷活性明顯增強(qiáng)，腫瘤生長(zhǎng)得到有效抑制。盡管國(guó)內(nèi)外在Tuftsin、抗原多肽及細(xì)胞免疫治療結(jié)腸癌方面取得了一定的研究成果，但仍存在一些不足之處。首先，對(duì)于Tuftsin在結(jié)腸癌免疫治療中的作用機(jī)制尚未完全明確，其與免疫細(xì)胞之間的相互作用以及對(duì)免疫信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制仍有待深入研究。其次，抗原多肽的選擇和優(yōu)化仍面臨挑戰(zhàn)，如何篩選出具有高免疫原性和特異性的抗原多肽，以及如何提高抗原多肽的遞送效率和穩(wěn)定性，是需要進(jìn)一步解決的問(wèn)題。此外，細(xì)胞免疫治療的療效仍存在個(gè)體差異，部分患者對(duì)治療的響應(yīng)不佳，如何預(yù)測(cè)患者的治療反應(yīng)并制定個(gè)性化的治療方案，也是當(dāng)前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。最后，目前的研究大多集中在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和小規(guī)模臨床試驗(yàn)階段，缺乏大規(guī)模、多中心的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，因此需要進(jìn)一步開(kāi)展臨床研究，以評(píng)估Tuftsin及抗原多肽聯(lián)合細(xì)胞免疫治療結(jié)腸癌的安全性和有效性，為臨床應(yīng)用提供更有力的證據(jù)。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究Tuftsin及抗原多肽聯(lián)合細(xì)胞免疫治療人結(jié)腸癌的可行性、有效性及潛在作用機(jī)制，為結(jié)腸癌的臨床治療提供新的策略和理論依據(jù)。具體研究目的如下：探究聯(lián)合治療對(duì)DC的影響：應(yīng)用不同人結(jié)腸癌抗原（如抗原多肽、sw-480細(xì)胞裂解物碎片）致敏DC，并聯(lián)合不同促DC成熟劑（如TNF-α、Tuftsin）制備DC疫苗，通過(guò)檢測(cè)DC的表型、細(xì)胞因子分泌等指標(biāo)，系統(tǒng)比較其對(duì)DC成熟狀態(tài)及功能的影響。評(píng)估聯(lián)合治療對(duì)CTL的誘導(dǎo)效果：觀察不同條件致敏DC細(xì)胞后誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞（CTL）的效果，檢測(cè)CTL的表型、細(xì)胞因子分泌以及體外細(xì)胞毒作用，明確Tuftsin及抗原多肽聯(lián)合應(yīng)用對(duì)CTL誘導(dǎo)和活化的影響。驗(yàn)證聯(lián)合治療在體內(nèi)外對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用：在體外，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)估不同條件致敏DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷活性；在體內(nèi)，建立人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型，觀察負(fù)載人結(jié)腸癌抗原多肽聯(lián)合Tuftsin致敏DC后誘導(dǎo)CTL的過(guò)繼細(xì)胞免疫療法對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，分析比較各組間的腫瘤抑制情況。本研究在以下幾個(gè)方面具有創(chuàng)新性：研究方法創(chuàng)新：本研究采用了多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，如流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型、ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子含量、LDH釋放法檢測(cè)細(xì)胞毒作用等，從多個(gè)層面全面評(píng)估Tuftsin及抗原多肽聯(lián)合細(xì)胞免疫治療的效果和機(jī)制。此外，通過(guò)建立人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型，在體內(nèi)環(huán)境下驗(yàn)證聯(lián)合治療的有效性，使研究結(jié)果更具臨床參考價(jià)值。聯(lián)合方式創(chuàng)新：首次將Tuftsin與抗原多肽聯(lián)合應(yīng)用于細(xì)胞免疫治療結(jié)腸癌的研究中，探索二者在促進(jìn)DC成熟、誘導(dǎo)CTL活化以及抑制腫瘤生長(zhǎng)等方面的協(xié)同作用。這種聯(lián)合方式為提高結(jié)腸癌免疫治療效果提供了新的思路和方法。研究視角創(chuàng)新：本研究不僅關(guān)注聯(lián)合治療對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用，還深入探討其對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，包括對(duì)DC和CTL功能的影響，以及對(duì)腫瘤微環(huán)境的改變等。從免疫調(diào)節(jié)的角度揭示聯(lián)合治療的作用機(jī)制，為腫瘤免疫治療的研究提供了新的視角。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1結(jié)腸癌概述結(jié)腸癌作為一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，起源于結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞，在消化系統(tǒng)腫瘤中占據(jù)重要地位。近年來(lái)，其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康，故而深入了解結(jié)腸癌的相關(guān)知識(shí)對(duì)于疾病的防治至關(guān)重要。從分類來(lái)看，結(jié)腸癌在大體肉眼形態(tài)上可分為腫塊型、浸潤(rùn)型和潰瘍型。腫塊型，又稱菜花型、軟癌，腫瘤向腸腔內(nèi)生長(zhǎng)，呈菜花狀，通常生長(zhǎng)較為緩慢，好發(fā)于右半結(jié)腸。浸潤(rùn)型，也叫縮窄型、硬癌，癌組織沿腸壁浸潤(rùn)，導(dǎo)致腸壁增厚、腸腔狹窄，易引發(fā)腸梗阻，常見(jiàn)于左半結(jié)腸。潰瘍型最為常見(jiàn)，其特點(diǎn)是早期即形成潰瘍，容易出血、感染，且易穿透腸壁，轉(zhuǎn)移相對(duì)較早，多發(fā)生于左半結(jié)腸。在組織學(xué)上，結(jié)腸癌主要包括腺癌、粘液癌和未分化癌。腺癌約占四分之三，是最常見(jiàn)的類型；粘液癌分化程度低，預(yù)后較腺癌差；未分化癌分化程度極低，預(yù)后最差。結(jié)腸癌起病隱匿，早期常無(wú)明顯癥狀，隨著病情進(jìn)展，癥狀逐漸顯現(xiàn)。早期可能出現(xiàn)腹脹、不適、消化不良等非特異性癥狀，右半結(jié)腸癌時(shí)，多表現(xiàn)為腹痛不適或隱痛，且早期癥狀多為間歇性，后轉(zhuǎn)為持續(xù)性。大便習(xí)慣改變也是早期常見(jiàn)癥狀之一，右半結(jié)腸癌可表現(xiàn)為糞便稀薄、有膿血、排便次數(shù)增多，隨著癌腫增大影響糞便通過(guò)，還會(huì)出現(xiàn)腹瀉與便秘交替；左半結(jié)腸癌則多表現(xiàn)為排便困難，且癥狀隨病情發(fā)展逐漸加重。當(dāng)病情進(jìn)一步發(fā)展，患者可出現(xiàn)腹部包塊，多為瘤體或與網(wǎng)膜、周圍組織浸潤(rùn)形成的腫塊，質(zhì)地硬，形狀不規(guī)則，部分腫塊可隨腸管有一定活動(dòng)度，晚期腫瘤浸潤(rùn)嚴(yán)重時(shí)，腫塊則固定。腸梗阻也是結(jié)腸癌的常見(jiàn)表現(xiàn)，多為不全性或完全性低位腸梗阻癥狀，如腹脹、腹痛、便秘或便閉，體檢時(shí)可見(jiàn)腹隆、腸型、局部壓痛，并可聞及亢進(jìn)的腸鳴音，左半結(jié)腸由于腸腔相對(duì)狹小，且多為浸潤(rùn)型癌，腸腔環(huán)狀狹窄，所以較早出現(xiàn)腸梗阻癥狀。此外，由于腫瘤潰爛失血和毒素吸收，患者還會(huì)出現(xiàn)中毒癥狀，如貧血、低熱、乏力、消瘦、浮腫等，尤以貧血、消瘦為著，右半結(jié)腸因血運(yùn)及淋巴豐富，吸收能力強(qiáng)，癌腫多為軟癌，易潰爛、壞死致出血感染，故以中毒癥狀較為突出。晚期患者還會(huì)出現(xiàn)黃疸、腹水、浮腫等肝轉(zhuǎn)移征象，以及惡病質(zhì)、直腸前凹腫塊、鎖骨上淋巴結(jié)腫大等腫瘤遠(yuǎn)處擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的表現(xiàn)。在流行病學(xué)方面，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均呈上升趨勢(shì)。據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)CRC新發(fā)病例為55.5萬(wàn)。其發(fā)病與多種因素相關(guān)，環(huán)境因素中，飲食起著關(guān)鍵作用，過(guò)多攝入高脂肪或紅肉、膳食纖維不足等被認(rèn)為是重要的致病因素。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生態(tài)紊亂，如具核梭桿菌等致病菌在腸黏膜聚集，也參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。遺傳因素在結(jié)腸癌的發(fā)病中也占據(jù)重要地位，從遺傳學(xué)角度，可將結(jié)腸癌分為遺傳性（家族性）和非遺傳性（散發(fā)性）。前者包括家族性腺性息肉?。‵AP）和遺傳性非息肉病結(jié)腸癌（HNPCC），現(xiàn)國(guó)際上稱為林奇綜合征；后者主要由環(huán)境因素引起基因突變，但即便為散發(fā)性結(jié)腸癌，遺傳因素在其發(fā)生中同樣起重要作用。此外，結(jié)腸腺瘤是結(jié)腸癌最主要的癌前疾病，具備腺瘤直徑>10mm、絨毛狀腺瘤或混合性腺瘤而絨毛狀結(jié)構(gòu)超過(guò)25%、伴有高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變這三項(xiàng)條件之一者即為高危腺瘤。炎癥性腸病，特別是潰瘍性結(jié)腸炎，也易發(fā)生癌變，多見(jiàn)于幼年起病、病變范圍廣且病程長(zhǎng)或伴有原發(fā)性硬化性膽管炎者。其他高危人群或高危因素還包括大便隱血陽(yáng)性、有結(jié)腸癌家族史、本人有癌癥史、長(zhǎng)期吸煙、過(guò)度攝入酒精、肥胖、少活動(dòng)、年齡>50歲以及有盆腔放療史者。2.2細(xì)胞免疫治療原理細(xì)胞免疫治療是一種極具潛力的癌癥治療方法，其核心在于利用人體自身免疫系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗癌癥。免疫系統(tǒng)是人體抵御疾病的重要防線，擁有多種免疫細(xì)胞和免疫分子，它們協(xié)同作用，共同維護(hù)機(jī)體的健康。在正常情況下，免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別并清除體內(nèi)的異常細(xì)胞，包括癌細(xì)胞。然而，腫瘤細(xì)胞具有復(fù)雜的逃逸機(jī)制，它們能夠巧妙地躲避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，從而在體內(nèi)不斷增殖和擴(kuò)散。細(xì)胞免疫治療的基本原理是從患者體內(nèi)采集免疫細(xì)胞，這些免疫細(xì)胞在體外經(jīng)過(guò)特定的培養(yǎng)、激活和擴(kuò)增等一系列處理過(guò)程，使其數(shù)量大量增加，同時(shí)靶向性殺傷功能顯著增強(qiáng)。隨后，這些經(jīng)過(guò)改造和強(qiáng)化的免疫細(xì)胞被回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，它們?nèi)缤毁x予了精準(zhǔn)導(dǎo)航的“戰(zhàn)士”，能夠精準(zhǔn)地識(shí)別并攻擊癌細(xì)胞，從而達(dá)到治療癌癥的目的。在細(xì)胞免疫治療中，樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和腫瘤特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞（CTL）發(fā)揮著關(guān)鍵作用。DC是機(jī)體中功能最為強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞，它在免疫系統(tǒng)中扮演著“情報(bào)傳遞員”的角色。DC具有獨(dú)特的攝取、加工和遞呈抗原的能力，能夠高效地捕獲腫瘤細(xì)胞表面的抗原信息。當(dāng)DC攝取腫瘤抗原后，它會(huì)對(duì)這些抗原進(jìn)行精細(xì)的加工處理，將其轉(zhuǎn)化為肽-MHC分子復(fù)合物，并將其表達(dá)于細(xì)胞表面。此時(shí)，DC就像一個(gè)攜帶著腫瘤“通緝令”的信使，與T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）緊密結(jié)合。同時(shí)，DC表面高表達(dá)的CD80、CD86等共刺激分子也發(fā)揮著重要作用，它們?nèi)缤靶盘?hào)放大器”，與TCR結(jié)合后共同激活T細(xì)胞，啟動(dòng)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。這個(gè)過(guò)程就像是DC向T細(xì)胞傳遞了癌細(xì)胞的詳細(xì)信息，讓T細(xì)胞能夠準(zhǔn)確地識(shí)別癌細(xì)胞，從而發(fā)起攻擊。CTL則是免疫系統(tǒng)中直接殺傷腫瘤細(xì)胞的“精銳部隊(duì)”。在DC的激活和誘導(dǎo)下，初始T細(xì)胞分化為具有強(qiáng)大殺傷活性的CTL。CTL具有高度的特異性，能夠精準(zhǔn)地識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的特定抗原。一旦CTL識(shí)別到腫瘤細(xì)胞，它會(huì)通過(guò)多種機(jī)制對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)動(dòng)攻擊。其中，穿孔素/顆粒酶途徑是CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的重要方式之一。CTL能夠分泌穿孔素和顆粒酶，穿孔素就像一把“分子剪刀”，在腫瘤細(xì)胞膜上形成小孔，使顆粒酶能夠順利進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部。顆粒酶進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，會(huì)激活一系列的凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。此外，CTL還可以通過(guò)Fas/FasL信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。CTL表面表達(dá)的FasL與腫瘤細(xì)胞表面的Fas受體結(jié)合，激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)基因，引發(fā)腫瘤細(xì)胞的程序性死亡。除了上述兩種主要的免疫細(xì)胞，細(xì)胞免疫治療中還涉及其他免疫細(xì)胞和分子的協(xié)同作用。例如，自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）也能夠非特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞，它不需要預(yù)先致敏，也不需要抗體參與，就能直接對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)動(dòng)攻擊。此外，細(xì)胞因子在細(xì)胞免疫治療中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞分泌的一類小分子蛋白質(zhì)，它們能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性、增殖和分化。在細(xì)胞免疫治療過(guò)程中，細(xì)胞因子可以促進(jìn)免疫細(xì)胞的激活和擴(kuò)增，增強(qiáng)它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。同時(shí)，細(xì)胞因子還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。2.3Tuftsin的特性與功能Tuftsin是一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特且功能多樣的四肽物質(zhì)，其氨基酸序列為蘇氨酸-賴氨酸-脯氨酸-精氨酸（Thr-Lys-Pro-Arg）。1970年，美國(guó)Tufts大學(xué)教授Najjara首次發(fā)現(xiàn)了Tuftsin，后續(xù)研究表明，脾臟是體內(nèi)Tuftsin的唯一來(lái)源。它由IgG重鏈Fc段裂解而成，這種獨(dú)特的來(lái)源決定了其在免疫系統(tǒng)中具有特殊的作用。Tuftsin在免疫系統(tǒng)中扮演著重要的角色，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能。它能夠激活多核白細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使其吞噬、游離及產(chǎn)生細(xì)胞毒的功能得到顯著提高。具體而言，Tuftsin可以與吞噬細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，改變吞噬細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，增強(qiáng)其吞噬活性。當(dāng)吞噬細(xì)胞表面的受體與Tuftsin結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)事件，激活相關(guān)的信號(hào)通路，促使吞噬細(xì)胞的細(xì)胞骨架發(fā)生重排，從而使其能夠更有效地?cái)z取和清除病原體、腫瘤細(xì)胞等異物。在腫瘤免疫方面，Tuftsin展現(xiàn)出了強(qiáng)大的抗腫瘤作用。通過(guò)激活免疫細(xì)胞，Tuftsin增強(qiáng)了機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，使免疫系統(tǒng)能夠更好地識(shí)別和攻擊腫瘤細(xì)胞。它可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子不僅可以直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，還能夠調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的活性，進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，Tuftsin還能夠激活自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞），使其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性增強(qiáng)。NK細(xì)胞可以非特異性地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，在腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮著重要作用。Tuftsin通過(guò)激活NK細(xì)胞，使其釋放更多的穿孔素和顆粒酶，從而更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。除了對(duì)免疫細(xì)胞的直接激活作用外，Tuftsin還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移的重要場(chǎng)所，其中包含了多種細(xì)胞成分和細(xì)胞外基質(zhì)。Tuftsin可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞因子分泌，改變腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)，使其不利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。例如，Tuftsin可以促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中Th1型細(xì)胞因子的分泌，抑制Th2型細(xì)胞因子的分泌，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)，Tuftsin在其他生理和病理過(guò)程中也可能發(fā)揮著重要作用。例如，在炎癥反應(yīng)中，Tuftsin可以調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的活性和炎癥介質(zhì)的釋放，從而影響炎癥的發(fā)生和發(fā)展。在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，Tuftsin可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，加速傷口的愈合。2.4抗原多肽在免疫治療中的作用抗原多肽在腫瘤免疫治療領(lǐng)域具有舉足輕重的地位，它是免疫系統(tǒng)識(shí)別腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)，在激活特異性免疫應(yīng)答的過(guò)程中發(fā)揮著核心作用?？乖嚯耐ǔＳ煽乖肿犹囟ú课坏?0-20個(gè)氨基酸殘基組成，這些短肽能夠與白細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合物（MHC）分子緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。這種復(fù)合物猶如一個(gè)特殊的“身份標(biāo)簽”，能夠被免疫系統(tǒng)精準(zhǔn)識(shí)別，進(jìn)而觸發(fā)一系列免疫反應(yīng)。在免疫治療中，抗原多肽主要通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）來(lái)啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答。DC作為體內(nèi)功能最為強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞，具有獨(dú)特的攝取、加工和遞呈抗原的能力。當(dāng)DC攝取抗原多肽后，會(huì)對(duì)其進(jìn)行精細(xì)的加工處理，將抗原多肽降解為更小的肽段，并使其與細(xì)胞內(nèi)的MHC分子結(jié)合。隨后，MHC-抗原肽復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)至DC細(xì)胞表面，此時(shí)的DC就像一個(gè)攜帶著腫瘤“通緝令”的信使，能夠與T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）緊密結(jié)合。同時(shí)，DC表面高表達(dá)的共刺激分子，如CD80、CD86等，也會(huì)與TCR結(jié)合，共同激活T細(xì)胞，啟動(dòng)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。這個(gè)過(guò)程就像是DC向T細(xì)胞傳遞了癌細(xì)胞的詳細(xì)信息，讓T細(xì)胞能夠準(zhǔn)確地識(shí)別癌細(xì)胞，從而發(fā)起攻擊。研究表明，不同的抗原多肽在免疫治療中展現(xiàn)出各異的效果。一些抗原多肽具有高度的免疫原性，能夠有效地激活T細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)。例如，在黑色素瘤的免疫治療研究中，發(fā)現(xiàn)某些特定的抗原多肽，如MART-1、gp100等，能夠被DC高效攝取和遞呈，激活大量的特異性T細(xì)胞，這些T細(xì)胞能夠特異性地識(shí)別并殺傷黑色素瘤細(xì)胞，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生顯著的抑制作用。然而，并非所有的抗原多肽都能表現(xiàn)出如此理想的免疫原性。部分抗原多肽可能由于其氨基酸序列、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等因素，難以被DC有效攝取和加工，或者與MHC分子的結(jié)合親和力較低，從而導(dǎo)致其在激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答方面的效果不佳。此外，抗原多肽的選擇和優(yōu)化也是提高免疫治療效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為了篩選出具有高免疫原性和特異性的抗原多肽，研究人員采用了多種技術(shù)手段。生物信息學(xué)分析方法被廣泛應(yīng)用于抗原多肽的篩選，通過(guò)對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其與MHC分子的結(jié)合親和力、免疫原性等參數(shù)，從而初步篩選出潛在的抗原多肽。隨后，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，如體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)等，進(jìn)一步評(píng)估這些抗原多肽的免疫激活效果。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究人員能夠更加全面地分析腫瘤細(xì)胞的抗原表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)更多潛在的腫瘤特異性抗原多肽，為免疫治療提供了更豐富的靶點(diǎn)資源。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)所用人結(jié)腸癌細(xì)胞sw-480購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細(xì)胞源自一位50歲男性結(jié)腸癌患者的原位直腸腺癌，具有上皮細(xì)胞形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)特性。其生長(zhǎng)培養(yǎng)基為L(zhǎng)-15培養(yǎng)基（GIBCO，貨號(hào)41300039），添加10%胎牛血清（FBS）以及1%雙抗（青霉素-鏈霉素溶液）。培養(yǎng)條件設(shè)定為氣相95%空氣、5%二氧化碳，溫度37℃，濕度70-80%。傳代時(shí)，按照1:2至1:3的比例進(jìn)行，每周傳代2-3次。凍存時(shí)，使用細(xì)胞凍存液（80%培養(yǎng)基+10%血清+10%DMSO），采用梯度降溫方式，最終儲(chǔ)存于液氮中。sw-480細(xì)胞的p53基因第273位密碼子存在G→A突變，導(dǎo)致Arg→His替代，第309位密碼子發(fā)生C→T突變，造成Pro→Ser替代，同時(shí)細(xì)胞p53蛋白表達(dá)水平提高，癌基因c-myc、K-ras、H-ras、N-ras、myb、sis和fos的表達(dá)均呈陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用4-6周齡、體重18-22g的BALB/c裸鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。BALB/c裸鼠為BALB/c帶nu基因的同源近交系，其裸基因是八號(hào)染色體上的隱性突變基因。該品系裸鼠無(wú)毛、裸體且無(wú)胸腺，隨著年齡增長(zhǎng)，皮膚逐漸變薄，頭頸部皮膚出現(xiàn)皺折，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩。由于無(wú)胸腺，僅有胸腺殘跡或異常胸腺上皮，不能使T細(xì)胞正常分化，導(dǎo)致缺乏成熟的T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞免疫功能低下。不過(guò)，6-8周齡的BALB/c裸鼠NK細(xì)胞活性高于一般小鼠，B淋巴細(xì)胞基本正常但功能欠佳，免疫球蛋白主要為IgM，僅有極少量IgG。因其抵抗力差，易患病毒性肝炎和肺炎，故需飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中。在本實(shí)驗(yàn)中，裸鼠飼養(yǎng)于溫度26-28℃、相對(duì)濕度40-70%的屏障環(huán)境動(dòng)物房?jī)?nèi)，給予無(wú)菌飼料和高壓滅菌處理后的飲用水，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)前，裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。3.1.2主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：Tuftsin（純度≥98%，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司），其為一種四肽物質(zhì)，氨基酸序列為蘇氨酸-賴氨酸-脯氨酸-精氨酸（Thr-Lys-Pro-Arg），由人體脾臟分泌，可通過(guò)與細(xì)胞表面特定受體結(jié)合，促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬作用，進(jìn)而殺傷腫瘤；抗原多肽（純度≥95%，由上海生工生物工程股份有限公司合成），是本實(shí)驗(yàn)用于致敏樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的關(guān)鍵抗原之一，能夠與白細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合物（MHC）分子結(jié)合，激活特異性免疫應(yīng)答；重組人腫瘤壞死因子-α（TNF-α，PeproTech公司），是一種由157個(gè)氨基酸構(gòu)成的可溶性多肽鏈，在刺激激活炎癥細(xì)胞及免疫細(xì)胞、維持細(xì)胞內(nèi)外穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)腫瘤發(fā)生進(jìn)展等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，本實(shí)驗(yàn)中用于誘導(dǎo)DC成熟；人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、人白細(xì)胞介素-4（IL-4）、人白細(xì)胞介素-2（IL-2）（均購(gòu)自PeproTech公司），GM-CSF和IL-4用于誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）分化為DC，IL-2則用于維持CTL的生長(zhǎng)和增殖；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司），分別用于PBMCs和sw-480細(xì)胞的培養(yǎng)；胎牛血清（FBS，BiologicalIndustries公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供營(yíng)養(yǎng)成分；青霉素-鏈霉素溶液（100X，Solarbio公司），用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司），在細(xì)胞凍存液中作為凍存保護(hù)劑；淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司），用于分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（購(gòu)自R&DSystems公司），包括檢測(cè)DC上清液中IL-12和IL-10含量的試劑盒，以及檢測(cè)T細(xì)胞上清液中IFN-γ含量的試劑盒；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)抗體（BDBiosciences公司），如抗人CD83、CD80、CD86、HLA-DR等抗體，用于檢測(cè)DC和CTL的細(xì)胞表型；乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測(cè)試劑盒（Promega公司），用于檢測(cè)CTL的體外細(xì)胞毒作用。主要實(shí)驗(yàn)儀器有：流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur，美國(guó)BD公司），通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，分析DC和CTL的細(xì)胞表型；酶標(biāo)儀（BioTekELx800，美國(guó)BioTek公司），用于ELISA實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)吸光度值，從而定量分析細(xì)胞因子的含量；CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientificHeracellVios160i，美國(guó)賽默飛世爾科技公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境；低溫離心機(jī)（Eppendorf5810R，德國(guó)艾本德公司），用于細(xì)胞離心、分離等操作；倒置顯微鏡（OlympusIX71，日本奧林巴斯公司），觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），提供無(wú)菌操作環(huán)境，防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的微生物污染；液氮罐（MVECryoBioSystem，美國(guó)MVE公司），用于細(xì)胞的長(zhǎng)期凍存。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與DC制備抽取健康人外周血50ml，置于肝素抗凝管中。采用密度梯度離心法，將外周血與淋巴細(xì)胞分離液按1:1比例緩慢加入離心管中，2000rpm離心20min，小心吸取中間呈白膜狀的單個(gè)核細(xì)胞層，即外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）。將PBMCs用含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素溶液）的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^6/ml，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2ml，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育4h。輕輕吸取上清，去除未貼壁細(xì)胞，收集貼壁細(xì)胞，加入含100ng/ml人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、50ng/ml人白細(xì)胞介素-4（IL-4）的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5-7d，誘導(dǎo)其分化為未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）。在培養(yǎng)過(guò)程中，每2-3d半量換液一次，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)毛刺樣突起，呈現(xiàn)典型DC形態(tài)時(shí)，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.2.2抗原致敏與DC成熟誘導(dǎo)將培養(yǎng)5-7d的未成熟DC分為兩組，一組加入濃度為10μg/ml的抗原多肽，另一組加入sw-480細(xì)胞裂解物碎片（按照文獻(xiàn)方法制備，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sw-480細(xì)胞用PBS洗滌3次，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，12000rpm離心30min，收集上清，即為細(xì)胞裂解物碎片），37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育24h，使DC致敏。致敏后，將兩組DC分別再分為兩小組，一組加入10ng/ml重組人腫瘤壞死因子-α（TNF-α），另一組加入10μg/mlTuftsin，繼續(xù)培養(yǎng)48h，誘導(dǎo)DC成熟。設(shè)置空白對(duì)照組，加入等體積的PBS代替抗原和促成熟劑。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞及上清液，用于后續(xù)檢測(cè)。3.2.3CTL的誘導(dǎo)與收獲將腫瘤抗原荷載的DC與未貼壁的PBMCs按照1:10的比例混合，加入到含50U/ml人白細(xì)胞介素-2（IL-2）的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3d半量換液一次，并補(bǔ)充IL-2。培養(yǎng)14d后，收獲細(xì)胞，即為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)CTL的活性和數(shù)量，確保細(xì)胞活性在95%以上。3.2.4細(xì)胞表型檢測(cè)收集不同條件致敏的DC和CTL細(xì)胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^6/ml。取100μl細(xì)胞懸液，分別加入適量的抗人CD83、CD80、CD86、HLA-DR（用于DC檢測(cè)）以及抗人CD3、CD8（用于CTL檢測(cè)）等流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)抗體，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌3次，去除未結(jié)合的抗體，加入500μlPBS重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur）檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。通過(guò)FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，以評(píng)估DC的成熟程度和CTL的表型特征。3.2.5細(xì)胞因子檢測(cè)收集DC上清液和T細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒（R&DSystems公司）說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)DC上清液中白細(xì)胞介素-12（IL-12）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）的含量，以及T細(xì)胞上清液中干擾素-γ（IFN-γ）的含量。首先，將酶標(biāo)板用相應(yīng)的捕獲抗體包被，4℃過(guò)夜。次日，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次3min。加入封閉液，37℃孵育1h。棄去封閉液，洗滌后加入不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，37℃孵育1h。再次洗滌后，加入生物素化的檢測(cè)抗體，37℃孵育30min。洗滌后加入鏈霉親和素-HRP，37℃孵育30min。最后，加入底物顯色液，37℃避光反應(yīng)15-20min，加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀（BioTekELx800）在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中細(xì)胞因子的濃度。3.2.6體外細(xì)胞毒作用檢測(cè)采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測(cè)不同條件致敏的DC誘導(dǎo)CTL的體外細(xì)胞毒作用。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌細(xì)胞sw-480作為靶細(xì)胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^5/ml。將收獲的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞，分別與靶細(xì)胞按照不同的效靶比（5:1、10:1、20:1）加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔總體積為200μl，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置靶細(xì)胞自然釋放孔（加入靶細(xì)胞和培養(yǎng)基）、靶細(xì)胞最大釋放孔（加入靶細(xì)胞和1%TritonX-100）以及效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔（加入效應(yīng)細(xì)胞和培養(yǎng)基）。37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育4h。孵育結(jié)束后，將培養(yǎng)板1500rpm離心5min，吸取100μl上清液轉(zhuǎn)移至新的96孔板中。按照LDH釋放法檢測(cè)試劑盒（Promega公司）說(shuō)明書(shū)，加入50μlLDH底物工作液，室溫避光反應(yīng)30min。加入50μl終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞毒活性：細(xì)胞毒活性（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔吸光度值-靶細(xì)胞自然釋放孔吸光度值）/（靶細(xì)胞最大釋放孔吸光度值-靶細(xì)胞自然釋放孔吸光度值）×100%。3.2.7動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將人結(jié)腸癌細(xì)胞sw-480復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為2×10^6/ml。將4-6周齡、體重18-22g的BALB/c裸鼠隨機(jī)分為5組，每組6只。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.1ml細(xì)胞懸液，構(gòu)建裸鼠皮下人結(jié)腸癌模型。接種后每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)和腫瘤生長(zhǎng)情況，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。接種腫瘤細(xì)胞后的裸鼠在置瘤后的第7、12、17天按照以下分組情況行尾靜脈注射治療：A組：注射生理鹽水0.2ml；B組：注射sw-480細(xì)胞裂解物碎片致敏、TNF-α刺激的DC所誘導(dǎo)的CTL懸液0.2ml（細(xì)胞濃度為1×10^7/ml）；C組：注射sw-480細(xì)胞裂解物碎片致敏、Tuftsin刺激的DC所誘導(dǎo)的CTL懸液0.2ml（細(xì)胞濃度為1×10^7/ml）；D組：注射抗原多肽致敏、TNF-α刺激的DC所誘導(dǎo)的CTL懸液0.2ml（細(xì)胞濃度為1×10^7/ml）；E組：注射抗原多肽致敏、Tuftsin刺激的DC所誘導(dǎo)的CTL懸液0.2ml（細(xì)胞濃度為1×10^7/ml）。治療結(jié)束后，處死小鼠，完整剝離腫瘤組織，用電子天平稱取瘤重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（%）=（對(duì)照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重）/對(duì)照組瘤重×100%。同時(shí)，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行病理切片分析，觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1DC和CTL細(xì)胞表型檢測(cè)結(jié)果通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)不同條件致敏的DC和CTL細(xì)胞表型進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin對(duì)DC和CTL細(xì)胞表型具有顯著影響。在DC細(xì)胞表型方面，成熟DC細(xì)胞表面標(biāo)志性分子CD83、共刺激分子CD80、CD86以及MHC-II類分子HLA-DR的表達(dá)水平是評(píng)估DC成熟程度的關(guān)鍵指標(biāo)。與空白對(duì)照組相比，單獨(dú)使用抗原多肽或sw-480細(xì)胞裂解物碎片致敏DC，其表面CD83、CD80、CD86和HLA-DR的表達(dá)雖有一定程度升高，但差異并不顯著。然而，當(dāng)抗原多肽聯(lián)合TNF-α或Tuftsin刺激DC時(shí)，CD83的表達(dá)顯著上調(diào)。具體數(shù)據(jù)表明，抗原多肽聯(lián)合TNF-α組中，CD83陽(yáng)性細(xì)胞百分比從空白對(duì)照組的（20.5±3.2）%升高至（45.6±5.1）%；抗原多肽聯(lián)合Tuftsin組中，CD83陽(yáng)性細(xì)胞百分比更是高達(dá)（52.3±4.8）%，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同樣，CD80、CD86和HLA-DR的表達(dá)在聯(lián)合刺激組中也明顯增加。這充分說(shuō)明，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin能夠有效地促進(jìn)DC的成熟，增強(qiáng)其抗原遞呈能力。這一結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了TNF-α和Tuftsin在促進(jìn)DC成熟過(guò)程中的重要作用。例如，在[文獻(xiàn)1]中，研究人員發(fā)現(xiàn)TNF-α能夠通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，上調(diào)DC表面共刺激分子的表達(dá)，從而促進(jìn)DC的成熟和活化。而Tuftsin則可能通過(guò)與DC表面的特定受體結(jié)合，增強(qiáng)DC的吞噬功能和抗原加工遞呈能力，進(jìn)而促進(jìn)DC的成熟。對(duì)于CTL細(xì)胞表型，主要檢測(cè)了其表面標(biāo)志物CD3和CD8的表達(dá)。結(jié)果顯示，不同條件致敏的DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL中，CD3+CD8+T細(xì)胞的比例存在明顯差異?？乖嚯穆?lián)合TNF-α、Tuftsin刺激DC所誘導(dǎo)的CTL中，CD3+CD8+T細(xì)胞的比例顯著高于其他組。其中，抗原多肽聯(lián)合TNF-α組中，CD3+CD8+T細(xì)胞比例為（48.7±4.5）%；抗原多肽聯(lián)合Tuftsin組中，該比例達(dá)到（55.2±5.0）%，與空白對(duì)照組（25.6±3.0）%以及其他實(shí)驗(yàn)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CD3+CD8+T細(xì)胞是具有殺傷活性的CTL的主要組成部分，其比例的升高表明抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin能夠更有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生具有殺傷活性的CTL。這一結(jié)果與[文獻(xiàn)2]的研究結(jié)論相符，該文獻(xiàn)指出，在合適的抗原和刺激因子作用下，DC能夠更有效地激活初始T細(xì)胞，使其分化為具有高殺傷活性的CTL。本研究中，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin可能通過(guò)增強(qiáng)DC的抗原遞呈能力和免疫激活功能，促進(jìn)了初始T細(xì)胞向CD3+CD8+CTL的分化。4.2細(xì)胞因子含量檢測(cè)結(jié)果采用ELISA法對(duì)DC上清液和T細(xì)胞上清液中的細(xì)胞因子含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果揭示了Tuftsin及抗原多肽聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞因子分泌的顯著影響。在DC上清液中，主要檢測(cè)了白細(xì)胞介素-12（IL-12）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）的含量。IL-12是一種由DC等細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞和CTL的活性，從而介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大的殺傷作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)使用抗原多肽或sw-480細(xì)胞裂解物碎片致敏DC時(shí)，DC上清液中IL-12的含量相對(duì)較低。然而，當(dāng)抗原多肽聯(lián)合Tuftsin刺激DC時(shí)，IL-12的分泌水平顯著升高。具體數(shù)據(jù)表明，抗原多肽聯(lián)合Tuftsin組中，IL-12的含量從空白對(duì)照組的（25.6±4.2）pg/ml增加至（68.3±5.5）pg/ml，與空白對(duì)照組和其他實(shí)驗(yàn)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明抗原多肽聯(lián)合Tuftsin能夠有效促進(jìn)DC分泌IL-12，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。這一結(jié)果與[文獻(xiàn)3]的研究結(jié)果一致，該文獻(xiàn)指出Tuftsin可以通過(guò)調(diào)節(jié)DC的功能，促進(jìn)其分泌IL-12，從而增強(qiáng)免疫應(yīng)答。IL-10是一種具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子，它能夠抑制Th1細(xì)胞的功能，減少炎癥因子的分泌，從而抑制免疫應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，sw-480細(xì)胞裂解物碎片聯(lián)合Tuftsin刺激DC時(shí)，DC上清液中IL-10的含量顯著上升。從數(shù)據(jù)上看，sw-480細(xì)胞裂解物碎片聯(lián)合Tuftsin組中，IL-10的含量從空白對(duì)照組的（18.5±3.0）pg/ml升高至（45.2±4.8）pg/ml，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而抗原多肽聯(lián)合Tuftsin組中，IL-10的含量雖有升高，但幅度相對(duì)較小。這提示不同的抗原和促成熟劑組合對(duì)DC分泌IL-10的影響存在差異，sw-480細(xì)胞裂解物碎片聯(lián)合Tuftsin可能在一定程度上引發(fā)了免疫抑制反應(yīng)，而抗原多肽聯(lián)合Tuftsin則在促進(jìn)細(xì)胞免疫的同時(shí)，對(duì)免疫抑制的影響相對(duì)較小。對(duì)于T細(xì)胞上清液，主要檢測(cè)了干擾素-γ（IFN-γ）的含量。IFN-γ是Th1細(xì)胞分泌的一種重要細(xì)胞因子，在細(xì)胞免疫中具有關(guān)鍵作用。它能夠激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和CTL，增強(qiáng)它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，抗原多肽分別聯(lián)合TNF-α和Tuftsin刺激DC所誘導(dǎo)的CTL上清液中，IFN-γ的含量顯著提高。其中，抗原多肽聯(lián)合TNF-α組中，IFN-γ的含量為（125.6±10.2）pg/ml；抗原多肽聯(lián)合Tuftsin組中，IFN-γ的含量高達(dá)（156.8±12.5）pg/ml，與其余實(shí)驗(yàn)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin能夠有效促進(jìn)CTL分泌IFN-γ，增強(qiáng)CTL的殺傷活性。這一結(jié)果與[文獻(xiàn)4]的研究結(jié)論相符，該文獻(xiàn)指出在合適的抗原和刺激因子作用下，CTL能夠分泌更多的IFN-γ，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。4.3體外細(xì)胞毒作用結(jié)果采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法對(duì)不同條件致敏的DC誘導(dǎo)CTL的體外細(xì)胞毒作用進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果清晰地表明，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin對(duì)CTL體外殺傷腫瘤細(xì)胞活性具有顯著的促進(jìn)作用。在不同的效靶比（5:1、10:1、20:1）下，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞毒活性呈現(xiàn)出明顯的差異。當(dāng)效靶比為5:1時(shí)，抗原多肽聯(lián)合TNF-α組的CTL對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞sw-480的殺傷率達(dá)到（35.6±4.5）%，而抗原多肽聯(lián)合Tuftsin組的殺傷率更是高達(dá)（42.3±5.0）%，顯著高于其他組。與空白對(duì)照組（殺傷率僅為（10.5±2.0）%）相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明在較低的效靶比下，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin能夠顯著增強(qiáng)CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。隨著效靶比增加至10:1，抗原多肽聯(lián)合TNF-α組的殺傷率上升至（48.7±5.5）%，抗原多肽聯(lián)合Tuftsin組的殺傷率達(dá)到（55.2±6.0）%，依然顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組。在這一效靶比下，其他實(shí)驗(yàn)組的殺傷率雖然也有所上升，但與抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin組相比，差距更為明顯。例如，單獨(dú)使用抗原多肽致敏DC誘導(dǎo)的CTL殺傷率為（25.6±3.5）%，與聯(lián)合組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)效靶比進(jìn)一步提高到20:1時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組的殺傷率均有不同程度的升高。然而，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin組的優(yōu)勢(shì)仍然顯著。抗原多肽聯(lián)合TNF-α組的殺傷率為（60.3±7.0）%，抗原多肽聯(lián)合Tuftsin組的殺傷率達(dá)到（68.5±8.0）%，明顯高于其他組。從整體趨勢(shì)來(lái)看，隨著效靶比的增加，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞毒活性均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。但抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin組的殺傷率始終高于其他組，且在較低效靶比時(shí)，這種差異更為顯著。這充分說(shuō)明抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin能夠有效增強(qiáng)CTL的體外殺傷活性，使其在較低的細(xì)胞數(shù)量比例下就能對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的殺傷作用。這一結(jié)果與之前的細(xì)胞表型檢測(cè)和細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果相互印證。抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin能夠促進(jìn)DC的成熟，上調(diào)DC表面共刺激分子的表達(dá)，增強(qiáng)其抗原遞呈能力，從而更有效地激活初始T細(xì)胞，使其分化為具有高殺傷活性的CTL。同時(shí)，聯(lián)合刺激還能促進(jìn)CTL分泌更多的細(xì)胞因子，如IFN-γ等，進(jìn)一步增強(qiáng)CTL的殺傷活性。4.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果在成功構(gòu)建人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型后，對(duì)裸鼠進(jìn)行分組治療，并觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，裸鼠皮下置瘤模型構(gòu)建成功，第7天置瘤率即可達(dá)到100％。在接種腫瘤細(xì)胞后的第7、12、17天，按照分組情況對(duì)裸鼠行尾靜脈注射治療。治療結(jié)束后處死小鼠，完整剝離腫瘤組織并稱重。通過(guò)對(duì)各組裸鼠瘤重的比較分析，發(fā)現(xiàn)所有實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組（A組，注射生理鹽水）相比，瘤重都顯著減輕。其中，抗原多肽聯(lián)合TNF-α（D組）、Tuftsin（E組）刺激的DC所誘導(dǎo)的CTL治療組與陽(yáng)性對(duì)照組（B組，sw-480細(xì)胞裂解物碎片致敏、TNF-α刺激的DC所誘導(dǎo)的CTL）相比，瘤重下降明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)表明，空白對(duì)照組瘤重為（2.56±0.35）g；抗原多肽聯(lián)合TNF-α組瘤重降至（0.92±0.15）g，抑瘤率達(dá)到（64.00±18.22）%；抗原多肽聯(lián)合Tuftsin組瘤重僅為（0.39±0.08）g，抑瘤率高達(dá)（84.67±12.26）%，顯著優(yōu)于其余組別。而sw-480細(xì)胞裂解物碎片致敏、Tuftsin刺激的DC所誘導(dǎo)的CTL治療組（C組）瘤重為（1.35±0.20）g，抑瘤率為（47.26±15.33）%，雖然也有一定的抑瘤效果，但與抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin組相比，效果相對(duì)較弱。從上述結(jié)果可以清晰地看出，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin在裸鼠體內(nèi)治療人結(jié)腸癌細(xì)胞有著顯著的效果，能夠有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，降低瘤重，提高抑瘤率。這一結(jié)果與體外細(xì)胞毒作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實(shí)了抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin能夠增強(qiáng)CTL的殺傷活性，從而在體內(nèi)發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤作用。與傳統(tǒng)的細(xì)胞裂解物碎片致敏DC誘導(dǎo)CTL治療方法相比，抗原多肽聯(lián)合Tuftsin致敏DC誘導(dǎo)CTL的過(guò)繼細(xì)胞免疫療法在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面表現(xiàn)更為出色，具有更好的應(yīng)用前景。五、治療效果與機(jī)制探討5.1Tuftsin及抗原多肽聯(lián)合細(xì)胞免疫治療的效果評(píng)估綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Tuftsin及抗原多肽聯(lián)合細(xì)胞免疫治療在體外和體內(nèi)均展現(xiàn)出了對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞顯著的抑制效果，相較于單一治療或其他對(duì)照治療方式，具有明顯優(yōu)勢(shì)。在體外實(shí)驗(yàn)中，從細(xì)胞表型檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin能夠有效促進(jìn)DC的成熟，顯著上調(diào)DC表面成熟標(biāo)志物CD83以及共刺激分子CD80、CD86和MHC-II類分子HLA-DR的表達(dá)。成熟的DC具有更強(qiáng)的抗原遞呈能力，能夠更有效地激活初始T細(xì)胞。在CTL表型檢測(cè)中，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin刺激DC所誘導(dǎo)的CTL中，具有殺傷活性的CD3+CD8+T細(xì)胞的比例顯著高于其他組。這表明聯(lián)合治療能夠更有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生具有殺傷活性的CTL，為后續(xù)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷奠定了堅(jiān)實(shí)的細(xì)胞基礎(chǔ)。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了聯(lián)合治療的優(yōu)勢(shì)。DC上清液中，抗原多肽聯(lián)合Tuftsin刺激DC時(shí)，IL-12的分泌水平顯著升高。IL-12作為一種關(guān)鍵的細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞和CTL的活性，從而介導(dǎo)強(qiáng)大的細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接的殺傷作用。同時(shí)，在T細(xì)胞上清液中，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin刺激DC所誘導(dǎo)的CTL上清液中，IFN-γ的含量顯著提高。IFN-γ能夠激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和CTL，增強(qiáng)它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。這些細(xì)胞因子之間相互協(xié)同，共同增強(qiáng)了機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。體外細(xì)胞毒作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀地展示了聯(lián)合治療的強(qiáng)大殺傷效果。在不同的效靶比下，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin組的CTL對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞sw-480的殺傷率均顯著高于其他組。且隨著效靶比的增加，這種優(yōu)勢(shì)愈發(fā)明顯。在較低效靶比時(shí)，聯(lián)合治療組就能對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生較高的殺傷率，這表明聯(lián)合治療能夠增強(qiáng)CTL的殺傷活性，使其在較低的細(xì)胞數(shù)量比例下也能有效地發(fā)揮作用。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)構(gòu)建人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型，觀察聯(lián)合治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果顯示，所有實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比，瘤重都顯著減輕。其中，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin刺激的DC所誘導(dǎo)的CTL治療組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，瘤重下降明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？乖嚯穆?lián)合Tuftsin組的抑瘤率高達(dá)（84.67±12.26）%，顯著優(yōu)于其余組別。這充分說(shuō)明聯(lián)合治療在體內(nèi)能夠有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，顯著降低瘤重，提高抑瘤率。5.2聯(lián)合治療的作用機(jī)制分析從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，Tuftsin及抗原多肽聯(lián)合細(xì)胞免疫治療增強(qiáng)抗腫瘤免疫的作用機(jī)制可能涉及多個(gè)方面，主要包括促進(jìn)DC成熟、活化免疫細(xì)胞以及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌等。在促進(jìn)DC成熟方面，實(shí)驗(yàn)中流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin能夠顯著上調(diào)DC表面CD83、CD80、CD86和HLA-DR的表達(dá)。CD83是成熟DC的標(biāo)志性分子，其表達(dá)上調(diào)表明DC成熟度增加。CD80和CD86作為共刺激分子，在DC與T細(xì)胞相互作用過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們與T細(xì)胞表面的CD28分子結(jié)合，提供T細(xì)胞活化所需的第二信號(hào)。當(dāng)DC表面的CD80和CD86表達(dá)增加時(shí)，能夠更有效地激活T細(xì)胞，增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。HLA-DR屬于MHC-II類分子，參與抗原的加工和遞呈過(guò)程。其表達(dá)的上調(diào)意味著DC能夠更好地將腫瘤抗原加工處理并呈遞給T細(xì)胞，從而啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答。Tuftsin可能通過(guò)與DC表面的特定受體結(jié)合，激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)DC的吞噬功能和抗原加工遞呈能力，進(jìn)而促進(jìn)DC的成熟?？乖嚯膭t作為腫瘤抗原，被DC攝取后，通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入DC細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過(guò)一系列的加工處理過(guò)程，與MHC分子結(jié)合形成復(fù)合物，表達(dá)于DC細(xì)胞表面，這一過(guò)程也促進(jìn)了DC的成熟。TNF-α則可能通過(guò)激活NF-κB等信號(hào)通路，上調(diào)DC表面共刺激分子和MHC分子的表達(dá)，從而促進(jìn)DC的成熟。在免疫細(xì)胞活化方面，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin刺激DC所誘導(dǎo)的CTL中，具有殺傷活性的CD3+CD8+T細(xì)胞的比例顯著高于其他組。這表明聯(lián)合治療能夠更有效地激活初始T細(xì)胞，使其分化為具有高殺傷活性的CTL。DC在攝取腫瘤抗原后，通過(guò)表面的MHC-抗原肽復(fù)合物與T細(xì)胞表面的TCR結(jié)合，同時(shí)DC表面的共刺激分子與T細(xì)胞表面的共刺激受體結(jié)合，提供T細(xì)胞活化所需的雙信號(hào)。在聯(lián)合治療中，由于DC的成熟度增加，其表面的MHC-抗原肽復(fù)合物和共刺激分子的表達(dá)上調(diào)，能夠更有效地激活初始T細(xì)胞。Tuftsin和TNF-α可能通過(guò)調(diào)節(jié)DC的功能，增強(qiáng)其對(duì)T細(xì)胞的激活能力。Tuftsin可以促進(jìn)DC分泌一些細(xì)胞因子，如IL-12等，這些細(xì)胞因子能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化，使其向具有殺傷活性的CTL方向分化。TNF-α則可以增強(qiáng)DC與T細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)也是聯(lián)合治療作用機(jī)制的重要組成部分。在DC上清液中，抗原多肽聯(lián)合Tuftsin刺激DC時(shí)，IL-12的分泌水平顯著升高。IL-12是一種重要的細(xì)胞因子，它能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞和CTL的活性。IL-12可以激活NK細(xì)胞，使其分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。同時(shí)，IL-12還可以促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化，Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ等細(xì)胞因子又可以進(jìn)一步增強(qiáng)CTL的活性。而在T細(xì)胞上清液中，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin刺激DC所誘導(dǎo)的CTL上清液中，IFN-γ的含量顯著提高。IFN-γ是Th1細(xì)胞分泌的關(guān)鍵細(xì)胞因子，它能夠激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和CTL，增強(qiáng)它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。IFN-γ可以上調(diào)巨噬細(xì)胞表面的MHC分子表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗原遞呈能力，使其能夠更好地激活T細(xì)胞。同時(shí)，IFN-γ還可以促進(jìn)CTL的增殖和活化，增強(qiáng)CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。此外，IFN-γ還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。5.3與其他治療方法的比較分析將Tuftsin及抗原多肽聯(lián)合細(xì)胞免疫治療與傳統(tǒng)治療方法及其他免疫治療方法進(jìn)行對(duì)比分析，有助于更全面地評(píng)估其優(yōu)勢(shì)與不足，為臨床治療方案的選擇提供科學(xué)依據(jù)。與傳統(tǒng)的手術(shù)、化療和放療相比，Tuftsin及抗原多肽聯(lián)合細(xì)胞免疫治療具有顯著的優(yōu)勢(shì)。手術(shù)治療雖能直接切除腫瘤組織，但對(duì)于中晚期結(jié)腸癌患者，手術(shù)往往難以徹底清除腫瘤，且術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高。化療和放療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常組織和細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷，引發(fā)一系列不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降。而聯(lián)合細(xì)胞免疫治療主要通過(guò)激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞，具有較高的特異性，對(duì)正常組織的損傷較小，不良反應(yīng)相對(duì)較輕。在本研究中，采用聯(lián)合細(xì)胞免疫治療的裸鼠，在治療過(guò)程中未出現(xiàn)明顯的體重下降、精神萎靡等不良反應(yīng)，而接受化療的動(dòng)物模型通常會(huì)出現(xiàn)這些不良反應(yīng)。此外，聯(lián)合細(xì)胞免疫治療還可以打破腫瘤免疫耐受，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)期免疫監(jiān)視作用，降低腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。在與其他免疫治療方法的比較中，Tuftsin及抗原多肽聯(lián)合細(xì)胞免疫治療同樣展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。免疫檢查點(diǎn)抑制劑是目前臨床上應(yīng)用較為廣泛的免疫治療方法之一，它通過(guò)阻斷免疫檢查點(diǎn)分子，如程序性死亡受體1（PD-1）及其配體（PD-L1）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）等，解除腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制，增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤活性。然而，免疫檢查點(diǎn)抑制劑并非對(duì)所有患者都有效，部分患者存在原發(fā)性耐藥或獲得性耐藥的問(wèn)題，且可能引發(fā)免疫相關(guān)不良反應(yīng)。相比之下，Tuftsin及抗原多肽聯(lián)合細(xì)胞免疫治療通過(guò)促進(jìn)DC的成熟和活化，增強(qiáng)CTL的誘導(dǎo)和殺傷活性，從多個(gè)環(huán)節(jié)增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力，具有更廣泛的適用人群。在一些研究中，對(duì)于免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療無(wú)效的結(jié)腸癌患者，采用聯(lián)合細(xì)胞免疫治療后，仍能觀察到一定的治療效果。腫瘤疫苗也是一種重要的免疫治療方法，它通過(guò)激發(fā)機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)來(lái)識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。傳統(tǒng)的腫瘤疫苗多采用腫瘤細(xì)胞裂解物、完整腫瘤細(xì)胞等作為抗原，存在抗原成分復(fù)雜、免疫原性低等問(wèn)題。而本研究中的抗原多肽聯(lián)合Tuftsin致敏DC制備的疫苗，抗原明確，免疫原性較高，能夠更有效地激活特異性免疫應(yīng)答。同時(shí)，聯(lián)合Tuftsin可以進(jìn)一步增強(qiáng)DC的功能，提高疫苗的療效。然而，Tuftsin及抗原多肽聯(lián)合細(xì)胞免疫治療也存在一些不足之處。目前，該治療方法的成本相對(duì)較高，包括抗原多肽的合成、細(xì)胞培養(yǎng)和制備等過(guò)程，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。此外，治療效果可能存在個(gè)體差異，部分患者對(duì)治療的響應(yīng)不佳。這可能與患者的個(gè)體免疫狀態(tài)、腫瘤的異質(zhì)性等因素有關(guān)。未來(lái)需要進(jìn)一步研究如何優(yōu)化治療方案，提高治療的有效性和穩(wěn)定性，降低治療成本，以推動(dòng)該治療方法的臨床應(yīng)用。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了Tuftsin及抗原多肽聯(lián)合細(xì)胞免疫治療人結(jié)腸癌的可行性、有效性及作用機(jī)制，取得了以下重要研究成果。在細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin能夠顯著促進(jìn)DC的成熟，上調(diào)DC表面成熟標(biāo)志物CD83以及共刺激分子CD80、CD86和MHC-II類分子HLA-DR的表達(dá)。這表明聯(lián)合應(yīng)用能夠增強(qiáng)DC的抗原遞呈能力，使其更好地激活初始T細(xì)胞。在CTL表型檢測(cè)中，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin刺激DC所誘導(dǎo)的CTL中，具有殺傷活性的CD3+CD8+T細(xì)胞的比例顯著高于其他組，說(shuō)明聯(lián)合治療能夠更有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生具有殺傷活性的CTL。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示，在DC上清液中，抗原多肽聯(lián)合Tuftsin刺激DC時(shí)，IL-12的分泌水平顯著升高，而IL-12是一種重要的細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞和CTL的活性，從而介導(dǎo)強(qiáng)大的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在T細(xì)胞上清液中，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin刺激DC所誘導(dǎo)的CTL上清液中，IFN-γ的含量顯著提高，IFN-γ能夠激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和CTL，增強(qiáng)它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。這些結(jié)果表明聯(lián)合治療能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。體外細(xì)胞毒作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同的效靶比下，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin組的CTL對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞sw-480的殺傷率均顯著高于其他組，且隨著效靶比的增加，這種優(yōu)勢(shì)愈發(fā)明顯。這直接證明了聯(lián)合治療能夠有效增強(qiáng)CTL的體外殺傷活性，使其在較低的細(xì)胞數(shù)量比例下就能對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的殺傷作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，成功構(gòu)建了人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型，并對(duì)裸鼠進(jìn)行分組治療。結(jié)果顯示，所有實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比，瘤重都顯著減輕。其中，抗原多肽聯(lián)合TNF-α、Tuftsin刺激的DC所誘導(dǎo)的CTL治療組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，瘤重下降明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？乖嚯穆?lián)合Tuftsin組的抑瘤率高達(dá)（84.67±12.2