ZGF-130對(duì)缺血性神經(jīng)元死亡的保護(hù)作用及其機(jī)制摘要：本研究旨在探究ZGF-130對(duì)缺血性神經(jīng)元死亡的保護(hù)作用及其潛在機(jī)制。通過(guò)一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ZGF-130能夠顯著減少缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，提高神經(jīng)元的存活率。進(jìn)一步研究揭示，其保護(hù)機(jī)制可能涉及抑制氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)信號(hào)通路以及減輕炎癥反應(yīng)等多個(gè)方面。本研究為缺血性腦損傷的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和理論依據(jù)。一、引言缺血性腦損傷是一種嚴(yán)重威脅人類健康的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其主要病理特征是神經(jīng)元死亡和神經(jīng)功能障礙。目前，雖然針對(duì)缺血性腦損傷的治療方法取得了一定進(jìn)展，但仍缺乏有效的治療手段。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和藥物具有重要的臨床意義。ZGF-130是一種新合成的化合物，前期研究表明其具有多種生物學(xué)活性，本研究擬探討其對(duì)缺血性神經(jīng)元死亡的保護(hù)作用及其機(jī)制。二、材料與方法（一）實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：采用大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用健康成年SD大鼠。主要試劑：ZGF-130、氧糖剝奪（OGD）模型構(gòu)建相關(guān)試劑、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)試劑盒等。（二）實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞實(shí)驗(yàn)氧糖剝奪（OGD）模型建立：將原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞置于無(wú)糖Earle's平衡鹽溶液（EBSS）中，通入95%N?和5%CO?混合氣體，在37℃培養(yǎng)箱中孵育一定時(shí)間，構(gòu)建OGD模型。分組及處理：將細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、OGD模型組、ZGF-130不同濃度（低、中、高）預(yù)處理組。ZGF-130預(yù)處理組在OGD處理前1小時(shí)給予相應(yīng)濃度的ZGF-130孵育。細(xì)胞存活率檢測(cè)：采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，同時(shí)采用Westernblot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白（如Bax、Bcl-2、cleavedcaspase-3等）的表達(dá)水平。氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)：檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）模型建立：采用線栓法制備SD大鼠MCAO模型。分組及處理：將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、MCAO模型組、ZGF-130治療組（術(shù)后立即腹腔注射ZGF-130）。神經(jīng)功能評(píng)分：在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)采用Longa評(píng)分法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。腦梗死體積測(cè)定：采用TTC染色法測(cè)定腦梗死體積。腦組織病理學(xué)觀察：取腦組織進(jìn)行HE染色，觀察神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化；采用免疫組化法檢測(cè)腦組織中炎癥因子（如TNF-α、IL-1β等）的表達(dá)。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（一）ZGF-130對(duì)OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元存活率的影響與正常對(duì)照組相比，OGD模型組神經(jīng)元存活率顯著降低（P<0.01）。而ZGF-130預(yù)處理組神經(jīng)元存活率明顯提高，且呈濃度依賴性（P<0.05或P<0.01）。（二）ZGF-130對(duì)OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，OGD模型組細(xì)胞凋亡率顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），ZGF-130預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P<0.05或P<0.01）。Westernblot結(jié)果表明，OGD模型組Bax和cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，而ZGF-130預(yù)處理組可逆轉(zhuǎn)這些變化。（三）ZGF-130對(duì)OGD誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響OGD模型組細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量顯著增加，SOD和GSH-Px活性顯著降低（P<0.01）。ZGF-130預(yù)處理組ROS和MDA含量明顯降低，SOD和GSH-Px活性顯著升高（P<0.05或P<0.01）。（四）ZGF-130對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能和腦梗死體積的影響與假手術(shù)組相比，MCAO模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高，腦梗死體積顯著增大（P<0.01）。ZGF-130治療組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分降低，腦梗死體積減?。≒<0.05或P<0.01）。（五）ZGF-130對(duì)MCAO大鼠腦組織病理學(xué)和炎癥因子表達(dá)的影響HE染色結(jié)果顯示，MCAO模型組腦組織神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的損傷和壞死，ZGF-130治療組神經(jīng)元損傷程度減輕。免疫組化結(jié)果表明，MCAO模型組腦組織中TNF-α和IL-1β表達(dá)水平顯著升高，ZGF-130治療組表達(dá)水平降低（P<0.05或P<0.01）。四、討論缺血性腦損傷導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等。本研究結(jié)果表明，ZGF-130對(duì)缺血性神經(jīng)元死亡具有顯著的保護(hù)作用，其機(jī)制可能涉及以下幾個(gè)方面。（一）抑制氧化應(yīng)激缺血再灌注過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，ROS可攻擊細(xì)胞膜上的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量反映了氧化應(yīng)激的程度。SOD和GSH-Px是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除ROS，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。本研究中，ZGF-130預(yù)處理可顯著降低OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量，提高SOD和GSH-Px活性，表明ZGF-130能夠抑制氧化應(yīng)激，減輕氧化損傷對(duì)神經(jīng)元的損害。（二）調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)信號(hào)通路細(xì)胞凋亡是缺血性神經(jīng)元死亡的重要方式之一。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，其中Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡。Caspase家族蛋白酶是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，cleavedcaspase-3是caspase-3的活化形式，其表達(dá)水平升高提示細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，ZGF-130預(yù)處理可上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax和cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)元。（三）減輕炎癥反應(yīng)炎癥反應(yīng)在缺血性腦損傷的病理過(guò)程中起著重要作用。TNF-α和IL-1β是重要的促炎細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，加重神經(jīng)元損傷。本研究結(jié)果顯示，ZGF-130治療可降低MCAO大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平，減輕炎癥反應(yīng)，對(duì)缺血性神經(jīng)元起到保護(hù)作用。綜上所述，ZGF-130對(duì)缺血性神經(jīng)元死亡具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)信號(hào)通路以及減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究為缺血性腦損傷的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和理論依據(jù)，但ZGF-130在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性以及長(zhǎng)期安全性