ADAP與SKAP55協(xié)同調(diào)控CD8+T細(xì)胞抗腫瘤能力的分子機(jī)制探秘一、引言1.1研究背景腫瘤，作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，一直是全球醫(yī)學(xué)研究的焦點(diǎn)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，全球新增癌癥病例1929萬(wàn)例，癌癥死亡病例996萬(wàn)例。傳統(tǒng)的腫瘤治療手段，如手術(shù)、化療和放療，在一定程度上能夠緩解腫瘤患者的病情，但對(duì)于晚期腫瘤患者，這些治療方法往往難以達(dá)到理想的治療效果，且存在較大的副作用。近年來(lái)，腫瘤免疫治療的出現(xiàn)為腫瘤治療帶來(lái)了新的希望，成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。腫瘤免疫治療旨在激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。免疫治療具有特異性強(qiáng)、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，為腫瘤患者提供了新的治療選擇。在腫瘤免疫治療中，CD8+T細(xì)胞發(fā)揮著核心作用，是機(jī)體抗腫瘤免疫的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞，也被稱為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），能夠識(shí)別并殺傷被病原體感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。其殺傷機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：一是通過(guò)釋放穿孔素和顆粒酶，穿孔素在靶細(xì)胞膜上形成孔道，使顆粒酶進(jìn)入靶細(xì)胞，激活靶細(xì)胞內(nèi)的凋亡途徑，導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡；二是通過(guò)表達(dá)FasL，與靶細(xì)胞表面的Fas受體結(jié)合，激活靶細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡；三是通過(guò)分泌細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。這些殺傷機(jī)制使得CD8+T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，能夠有效地清除腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。1.2ADAP和SKAP55概述ADAP，全稱為黏附脫顆粒促進(jìn)適配蛋白（AdhesionandDegranulationPromotingAdapterProtein），是一種在T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的銜接蛋白。ADAP主要在T細(xì)胞和髓系細(xì)胞上表達(dá)，其結(jié)構(gòu)包含多個(gè)功能域，其中中央富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域在其功能發(fā)揮中至關(guān)重要。在T細(xì)胞激活過(guò)程中，T細(xì)胞受體（TCR）受到刺激后，ADAP可被磷酸化，進(jìn)而參與調(diào)控T細(xì)胞的多種功能。ADAP主要正向調(diào)節(jié)TCR偶聯(lián)到LFA-1激活的信號(hào)傳導(dǎo)，以及該過(guò)程介導(dǎo)的細(xì)胞活化、增殖、IL-2的產(chǎn)生和細(xì)胞黏附。研究表明，ADAP基因敲除小鼠的T細(xì)胞在與抗原呈遞細(xì)胞（APC）的黏附能力上明顯受損，這充分說(shuō)明了ADAP在T細(xì)胞與APC相互作用中的重要性。SKAP55，即src激酶相關(guān)磷蛋白55（srckinaseassociatedphosphoprotein55），也是T細(xì)胞信號(hào)通路中的重要分子。它屬于Pleckstrinhomologydomaincontaining家族，在T細(xì)胞中具有特定的分布模式。SKAP55的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了其在信號(hào)傳導(dǎo)中的獨(dú)特作用，它能夠與多種蛋白相互作用，形成信號(hào)復(fù)合物，參與T細(xì)胞的活化和功能調(diào)節(jié)。在T細(xì)胞信號(hào)通路中，SKAP55與ADAP存在密切的關(guān)聯(lián)，二者相互協(xié)作，共同調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能。研究發(fā)現(xiàn)，ADAP的脯氨酸豐富結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合并穩(wěn)定SKAP55的表達(dá)，而SKAP55在ADAP缺失的T細(xì)胞中表達(dá)缺失，這表明ADAP對(duì)于SKAP55的穩(wěn)定表達(dá)至關(guān)重要。對(duì)于ADAP和SKAP55在免疫信號(hào)傳導(dǎo)通路中的作用，目前已有一些初步的認(rèn)識(shí)。在TCR刺激后，ADAP和SKAP55參與的信號(hào)通路能夠調(diào)控T細(xì)胞的黏附、活化和增殖等過(guò)程。它們通過(guò)與其他信號(hào)分子相互作用，如與白細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（LFA-1）等整合素分子相互作用，調(diào)節(jié)T細(xì)胞與其他細(xì)胞之間的黏附性，進(jìn)而影響T細(xì)胞的活化閾值和免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。此外，ADAP和SKAP55還參與調(diào)控T細(xì)胞的細(xì)胞骨架重排，這對(duì)于T細(xì)胞的遷移和免疫突觸的形成具有重要意義。在腫瘤免疫中，ADAP和SKAP55可能通過(guò)影響CD8+T細(xì)胞的功能，參與腫瘤免疫逃逸和免疫監(jiān)視的過(guò)程。然而，它們?cè)谀[瘤免疫中的具體作用機(jī)制以及在CD8+T細(xì)胞抗腫瘤能力調(diào)控中的詳細(xì)分子機(jī)制，仍有待進(jìn)一步深入研究。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究ADAP和SKAP55對(duì)CD8+T細(xì)胞抗腫瘤能力的調(diào)控機(jī)制，具體目的包括：明確ADAP和SKAP55在CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)模式及表達(dá)水平變化對(duì)CD8+T細(xì)胞功能的影響；揭示ADAP和SKAP55相互作用以及與其他相關(guān)信號(hào)分子構(gòu)成的信號(hào)通路在調(diào)控CD8+T細(xì)胞活化、增殖、遷移和殺傷腫瘤細(xì)胞能力等方面的詳細(xì)分子機(jī)制；通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證調(diào)控ADAP和SKAP55表達(dá)或其信號(hào)通路活性對(duì)CD8+T細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)的增強(qiáng)作用，為腫瘤免疫治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。本研究具有重要的理論意義。在腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域，深入了解ADAP和SKAP55在CD8+T細(xì)胞中的作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步完善腫瘤免疫逃逸和免疫監(jiān)視的理論體系。目前，雖然對(duì)腫瘤免疫有了一定的認(rèn)識(shí)，但仍存在許多未知的分子機(jī)制和信號(hào)通路。本研究聚焦于ADAP和SKAP55這兩個(gè)在T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用的分子，有望揭示新的調(diào)控機(jī)制，填補(bǔ)該領(lǐng)域在這方面的研究空白，為深入理解腫瘤免疫的本質(zhì)提供重要線索。同時(shí)，研究ADAP和SKAP55對(duì)CD8+T細(xì)胞功能的影響，也有助于拓展對(duì)T細(xì)胞生物學(xué)的認(rèn)識(shí)，為研究其他免疫細(xì)胞的功能調(diào)控提供借鑒。在實(shí)踐方面，本研究成果對(duì)腫瘤免疫治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。腫瘤免疫治療是目前腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，然而，仍有許多患者對(duì)現(xiàn)有的免疫治療方法反應(yīng)不佳。本研究通過(guò)揭示ADAP和SKAP55調(diào)控CD8+T細(xì)胞抗腫瘤能力的機(jī)制，有望為開(kāi)發(fā)新的腫瘤免疫治療策略提供理論基礎(chǔ)。例如，如果能夠明確ADAP和SKAP55作為腫瘤免疫治療靶點(diǎn)的可行性，就可以設(shè)計(jì)針對(duì)這些靶點(diǎn)的藥物或治療方法，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤活性，提高腫瘤免疫治療的效果，為腫瘤患者帶來(lái)新的治療希望。此外，本研究還可能為優(yōu)化現(xiàn)有免疫治療方案提供指導(dǎo)，通過(guò)聯(lián)合調(diào)節(jié)ADAP和SKAP55相關(guān)信號(hào)通路與其他免疫治療方法，提高治療的協(xié)同效應(yīng)，降低治療的副作用，改善患者的生存質(zhì)量。二、CD8+T細(xì)胞與抗腫瘤免疫2.1CD8+T細(xì)胞的活化與功能2.1.1活化過(guò)程CD8+T細(xì)胞的活化是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)的過(guò)程，需要多個(gè)信號(hào)的協(xié)同作用，這一過(guò)程猶如一場(chǎng)精心策劃的軍事行動(dòng)，各個(gè)環(huán)節(jié)緊密配合，確保CD8+T細(xì)胞能夠準(zhǔn)確、高效地被激活，從而發(fā)揮其抗腫瘤免疫的關(guān)鍵作用。首先，腫瘤抗原的呈遞是CD8+T細(xì)胞活化的起始環(huán)節(jié)，這一過(guò)程主要由抗原呈遞細(xì)胞（APC）來(lái)完成，其中樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）是最為重要的抗原呈遞細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)、分裂過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生一些異常的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)被稱為腫瘤抗原。腫瘤抗原可以通過(guò)多種方式被APC攝取，例如DC細(xì)胞可以通過(guò)吞噬作用、巨胞飲作用等方式攝取腫瘤抗原。攝取后的腫瘤抗原在APC內(nèi)被加工處理，經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的酶解過(guò)程，被切割成短肽片段。這些短肽片段隨后與APC細(xì)胞內(nèi)的主要組織相容性復(fù)合體I類分子（MHC-I）結(jié)合，形成抗原肽-MHC-I復(fù)合物。MHC-I分子就像一個(gè)“展示架”，將抗原肽呈遞到APC細(xì)胞表面，等待CD8+T細(xì)胞的識(shí)別。這一過(guò)程確保了腫瘤抗原能夠以一種可被CD8+T細(xì)胞識(shí)別的形式呈現(xiàn)出來(lái)，為后續(xù)的活化過(guò)程奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)APC呈遞的抗原肽-MHC-I復(fù)合物與CD8+T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）特異性結(jié)合時(shí)，就啟動(dòng)了CD8+T細(xì)胞活化的第一信號(hào)。TCR是CD8+T細(xì)胞識(shí)別抗原的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，它由α和β兩條鏈組成，具有高度的特異性。每個(gè)CD8+T細(xì)胞表面的TCR都能特異性識(shí)別一種特定的抗原肽-MHC-I復(fù)合物。當(dāng)TCR與抗原肽-MHC-I復(fù)合物結(jié)合時(shí)，會(huì)引發(fā)TCR復(fù)合物的一系列構(gòu)象變化，從而激活TCR下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路。這一過(guò)程就像一把鑰匙插入鎖孔，啟動(dòng)了CD8+T細(xì)胞活化的“開(kāi)關(guān)”。然而，僅有第一信號(hào)的刺激，CD8+T細(xì)胞并不能完全活化，還需要第二信號(hào)的協(xié)同作用。第二信號(hào)，也被稱為共刺激信號(hào)，主要由APC表面的共刺激分子與CD8+T細(xì)胞表面相應(yīng)的共刺激分子受體相互作用提供。在眾多共刺激分子中，B7分子（包括B7-1和B7-2）與CD28分子的相互作用是最為重要的共刺激信號(hào)。當(dāng)APC攝取并呈遞腫瘤抗原后，會(huì)表達(dá)高水平的B7分子。B7分子與CD8+T細(xì)胞表面的CD28分子結(jié)合，能夠增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的活化信號(hào)，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖、分化和存活。除了B7-CD28信號(hào)通路外，還有其他共刺激分子對(duì)，如ICOS-ICOSL、4-1BB-4-1BBL等，也在CD8+T細(xì)胞活化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。這些共刺激分子對(duì)相互作用，為CD8+T細(xì)胞的活化提供了額外的“助力”，確保CD8+T細(xì)胞能夠充分活化，發(fā)揮其抗腫瘤免疫功能。此外，細(xì)胞因子在CD8+T細(xì)胞活化過(guò)程中也起著不可或缺的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞因子是一類由免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞分泌的小分子蛋白質(zhì)，它們?cè)诿庖哒{(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。在CD8+T細(xì)胞活化過(guò)程中，多種細(xì)胞因子參與其中，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等。IL-2是一種重要的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，它可以促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖和分化。當(dāng)CD8+T細(xì)胞受到第一信號(hào)和第二信號(hào)的刺激后，會(huì)表達(dá)IL-2受體。IL-2與IL-2受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖和分化。IFN-γ則可以增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，促進(jìn)其殺傷腫瘤細(xì)胞。這些細(xì)胞因子相互協(xié)作，共同調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞的活化、增殖和功能發(fā)揮。2.1.2殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制CD8+T細(xì)胞一旦被激活，便如同被點(diǎn)燃的“烽火”，迅速展現(xiàn)出強(qiáng)大的殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，其殺傷機(jī)制主要包括以下幾個(gè)關(guān)鍵方面：細(xì)胞毒性物質(zhì)釋放：穿孔素和顆粒酶是CD8+T細(xì)胞釋放的兩種重要的細(xì)胞毒性物質(zhì)，它們?cè)跉[瘤細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。當(dāng)CD8+T細(xì)胞識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞后，會(huì)通過(guò)胞吐作用將含有穿孔素和顆粒酶的細(xì)胞毒性顆粒釋放到細(xì)胞外。穿孔素是一種蛋白質(zhì)，它能夠在腫瘤細(xì)胞膜上形成小孔，這些小孔的直徑約為5-20納米。穿孔素形成小孔的過(guò)程類似于補(bǔ)體系統(tǒng)中膜攻擊復(fù)合物的形成。穿孔素分子在鈣離子的存在下，能夠聚合形成多聚體，插入腫瘤細(xì)胞膜中，從而形成小孔。這些小孔的形成使得腫瘤細(xì)胞膜的通透性增加，為顆粒酶進(jìn)入腫瘤細(xì)胞創(chuàng)造了條件。顆粒酶則是一類絲氨酸蛋白酶，包括顆粒酶A、顆粒酶B等。它們通過(guò)穿孔素形成的小孔進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)酶，如半胱天冬酶（caspase）家族成員。顆粒酶B可以直接激活caspase-3，啟動(dòng)凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞DNA斷裂、染色質(zhì)凝聚等凋亡特征的出現(xiàn)，最終使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。這一過(guò)程就像一把把“利刃”，精準(zhǔn)地插入腫瘤細(xì)胞，從內(nèi)部摧毀腫瘤細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡：Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡途徑是CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的另一條重要途徑。Fas，也稱為CD95，是一種細(xì)胞表面受體，屬于腫瘤壞死因子受體超家族。FasL，即Fas配體，是一種跨膜蛋白，主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面。當(dāng)CD8+T細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞后，會(huì)表達(dá)FasL。FasL與腫瘤細(xì)胞表面的Fas受體結(jié)合，形成Fas-FasL復(fù)合物。這一復(fù)合物的形成會(huì)招募并激活Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）。FADD通過(guò)其死亡結(jié)構(gòu)域與Fas的死亡結(jié)構(gòu)域相互作用，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，F(xiàn)ADD會(huì)招募并激活caspase-8。caspase-8是凋亡起始型半胱天冬酶，它被激活后可以通過(guò)兩種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。一方面，caspase-8可以直接激活下游的效應(yīng)型半胱天冬酶，如caspase-3、caspase-6和caspase-7，這些效應(yīng)型半胱天冬酶進(jìn)一步切割細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白質(zhì)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。另一方面，caspase-8可以通過(guò)切割Bid蛋白，將其轉(zhuǎn)化為tBid。tBid可以轉(zhuǎn)移到線粒體，誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子，從而激活線粒體凋亡途徑，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。這一途徑通過(guò)激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，從內(nèi)部啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞的自我毀滅程序，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效清除。分泌細(xì)胞因子：CD8+T細(xì)胞在殺傷腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中，還會(huì)分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用方面發(fā)揮著重要作用。其中，干擾素-γ（IFN-γ）是一種重要的細(xì)胞因子。IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力和殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。巨噬細(xì)胞被IFN-γ激活后，會(huì)表達(dá)更多的一氧化氮合酶（iNOS），產(chǎn)生大量的一氧化氮（NO）。NO是一種具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，它可以通過(guò)多種途徑殺傷腫瘤細(xì)胞，如抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等。此外，IFN-γ還可以促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞（如樹(shù)突狀細(xì)胞）的成熟和功能增強(qiáng)，提高其呈遞腫瘤抗原的能力，從而進(jìn)一步激活CD8+T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）也是CD8+T細(xì)胞分泌的一種重要細(xì)胞因子。TNF-α可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。它還可以通過(guò)激活其他免疫細(xì)胞，如NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，間接增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。這些細(xì)胞因子相互協(xié)作，形成一個(gè)復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，共同增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力，為機(jī)體抵御腫瘤的侵襲提供了有力的支持。2.2CD8+T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的狀態(tài)2.2.1腫瘤微環(huán)境對(duì)CD8+T細(xì)胞的影響腫瘤微環(huán)境（TME）是一個(gè)由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等多種成分組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，它對(duì)CD8+T細(xì)胞的活性、增殖和功能產(chǎn)生著顯著的抑制作用，就像一個(gè)充滿“陷阱”和“迷霧”的戰(zhàn)場(chǎng)，阻礙著CD8+T細(xì)胞發(fā)揮其應(yīng)有的抗腫瘤免疫功能。在腫瘤微環(huán)境中，細(xì)胞因子發(fā)揮著復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，其中一些細(xì)胞因子對(duì)CD8+T細(xì)胞具有明顯的抑制作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）是一種具有廣泛免疫抑制作用的細(xì)胞因子。TGF-β主要由腫瘤細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等細(xì)胞分泌。它可以通過(guò)多種機(jī)制抑制CD8+T細(xì)胞的功能。TGF-β能夠抑制CD8+T細(xì)胞的增殖，通過(guò)阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，使CD8+T細(xì)胞停滯在G1期，從而抑制其分裂和擴(kuò)增。TGF-β還可以抑制CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，降低其分泌穿孔素和顆粒酶的能力，減少對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。TGF-β能夠抑制CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，從而削弱CD8+T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。此外，TGF-β還可以誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使其失去抗腫瘤活性。白細(xì)胞介素-10（IL-10）也是一種重要的免疫抑制性細(xì)胞因子。IL-10主要由髓系來(lái)源的抑制細(xì)胞（MDSC）、TAM和Treg等細(xì)胞分泌。它可以通過(guò)與CD8+T細(xì)胞表面的IL-10受體結(jié)合，抑制CD8+T細(xì)胞的活化和功能。IL-10能夠抑制CD8+T細(xì)胞的增殖，減少其克隆擴(kuò)增。它還可以抑制CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，降低其免疫活性。IL-10能夠抑制CD8+T細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)，如CD28等，從而削弱CD8+T細(xì)胞的活化信號(hào)。此外，IL-10還可以促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖和功能，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用。腫瘤微環(huán)境中的代謝產(chǎn)物也會(huì)對(duì)CD8+T細(xì)胞的功能產(chǎn)生負(fù)面影響。腫瘤細(xì)胞在快速增殖過(guò)程中，會(huì)消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏，同時(shí)產(chǎn)生大量的代謝廢物，這些變化會(huì)影響CD8+T細(xì)胞的功能。葡萄糖是細(xì)胞的主要能量來(lái)源，在腫瘤微環(huán)境中，由于腫瘤細(xì)胞的高代謝率，葡萄糖的濃度往往較低。CD8+T細(xì)胞的活化和增殖需要大量的能量，葡萄糖缺乏會(huì)導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞能量代謝紊亂，影響其功能。研究表明，葡萄糖缺乏會(huì)抑制CD8+T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性作用，降低其分泌細(xì)胞因子的能力。此外，葡萄糖缺乏還會(huì)導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞表面的共刺激分子表達(dá)下調(diào)，削弱其活化信號(hào)。乳酸是腫瘤細(xì)胞無(wú)氧代謝的產(chǎn)物，在腫瘤微環(huán)境中，乳酸的濃度往往較高。高濃度的乳酸會(huì)改變腫瘤微環(huán)境的pH值，使其呈酸性，這種酸性環(huán)境會(huì)抑制CD8+T細(xì)胞的功能。研究發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境會(huì)抑制CD8+T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性作用，降低其分泌細(xì)胞因子的能力。酸性環(huán)境還會(huì)影響CD8+T細(xì)胞表面受體的功能，如TCR的信號(hào)傳導(dǎo)等，從而削弱CD8+T細(xì)胞的活化和功能。此外，乳酸還可以通過(guò)抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的功能，間接影響CD8+T細(xì)胞的活化和增殖。免疫抑制細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中大量存在，它們通過(guò)多種機(jī)制抑制CD8+T細(xì)胞的功能。Treg細(xì)胞是一種具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，其主要功能是維持免疫系統(tǒng)的平衡，防止自身免疫反應(yīng)的發(fā)生。在腫瘤微環(huán)境中，Treg細(xì)胞的數(shù)量增加，它們可以通過(guò)直接接觸或分泌抑制性細(xì)胞因子等方式，抑制CD8+T細(xì)胞的活化和功能。Treg細(xì)胞可以表達(dá)高水平的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4），CTLA-4可以與CD8+T細(xì)胞表面的CD28分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合B7分子，從而阻斷CD8+T細(xì)胞的共刺激信號(hào)，抑制其活化。Treg細(xì)胞還可以分泌TGF-β和IL-10等抑制性細(xì)胞因子，進(jìn)一步抑制CD8+T細(xì)胞的功能。MDSC是一群異質(zhì)性的髓系細(xì)胞，包括粒細(xì)胞樣MDSC（G-MDSC）和單核細(xì)胞樣MDSC（M-MDSC）等亞群。在腫瘤微環(huán)境中，MDSC的數(shù)量顯著增加，它們可以通過(guò)多種機(jī)制抑制CD8+T細(xì)胞的功能。MDSC可以通過(guò)分泌活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）等物質(zhì)，直接損傷CD8+T細(xì)胞，抑制其功能。MDSC還可以通過(guò)消耗精氨酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞表面的TCR表達(dá)下調(diào)，從而抑制其活化。此外，MDSC還可以通過(guò)分泌TGF-β和IL-10等抑制性細(xì)胞因子，間接抑制CD8+T細(xì)胞的功能。TAM是腫瘤微環(huán)境中數(shù)量最多的免疫細(xì)胞之一，它們可以分為M1型和M2型兩種亞型。M1型TAM具有抗腫瘤活性，而M2型TAM則具有免疫抑制作用。在腫瘤微環(huán)境中，TAM主要表現(xiàn)為M2型，它們可以通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子、表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子等方式，抑制CD8+T細(xì)胞的功能。M2型TAM可以分泌TGF-β、IL-10和CCL22等抑制性細(xì)胞因子，抑制CD8+T細(xì)胞的活化和增殖。M2型TAM還可以表達(dá)程序性死亡配體1（PD-L1）等免疫檢查點(diǎn)分子，與CD8+T細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合，抑制CD8+T細(xì)胞的功能。2.2.2CD8+T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的耗竭與應(yīng)對(duì)策略在腫瘤微環(huán)境中，CD8+T細(xì)胞常常會(huì)陷入一種被稱為“耗竭”的困境，這是一個(gè)嚴(yán)重影響其抗腫瘤能力的關(guān)鍵問(wèn)題。CD8+T細(xì)胞耗竭指的是在持續(xù)的抗原刺激以及腫瘤微環(huán)境中多種抑制因素的共同作用下，CD8+T細(xì)胞逐漸失去其正常的效應(yīng)功能，進(jìn)入一種功能障礙的狀態(tài)。這一過(guò)程就如同一位戰(zhàn)士在長(zhǎng)期的戰(zhàn)斗中逐漸耗盡了體力和斗志，無(wú)法再有效地執(zhí)行戰(zhàn)斗任務(wù)。耗竭的CD8+T細(xì)胞具有一系列明顯的特征。在表面標(biāo)志物方面，它們會(huì)高表達(dá)多種抑制性受體，其中程序性死亡受體1（PD-1）是最為典型的標(biāo)志之一。PD-1原本是一種在T細(xì)胞活化過(guò)程中起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用的受體，當(dāng)T細(xì)胞過(guò)度活化時(shí)，PD-1的表達(dá)會(huì)升高，與配體程序性死亡配體1（PD-L1）或程序性死亡配體2（PD-L2）結(jié)合，從而抑制T細(xì)胞的活性，防止過(guò)度的免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。在腫瘤微環(huán)境中，由于持續(xù)的抗原刺激，耗竭的CD8+T細(xì)胞表面的PD-1表達(dá)會(huì)持續(xù)升高，且長(zhǎng)時(shí)間維持在較高水平。除了PD-1，耗竭的CD8+T細(xì)胞還會(huì)高表達(dá)T細(xì)胞免疫球蛋白和粘蛋白結(jié)構(gòu)域-3（TIM-3）、淋巴細(xì)胞活化基因3（LAG-3）等抑制性受體。這些抑制性受體的共同作用，使得CD8+T細(xì)胞的活化信號(hào)被持續(xù)抑制，難以發(fā)揮正常的功能。在功能上，耗竭的CD8+T細(xì)胞的增殖能力顯著下降。正常情況下，CD8+T細(xì)胞在受到抗原刺激后會(huì)迅速增殖，以擴(kuò)大免疫細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)免疫反應(yīng)。而耗竭的CD8+T細(xì)胞由于其細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，導(dǎo)致其增殖能力大幅降低。它們分裂緩慢，難以產(chǎn)生足夠數(shù)量的子代細(xì)胞，從而無(wú)法有效地應(yīng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的不斷增殖。耗竭的CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用也明顯減弱。它們分泌穿孔素和顆粒酶等細(xì)胞毒性物質(zhì)的能力下降，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率降低。它們通過(guò)Fas/FasL途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力也受到抑制，無(wú)法有效地清除腫瘤細(xì)胞。耗竭的CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力也發(fā)生改變，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子的分泌量減少，導(dǎo)致其免疫調(diào)節(jié)和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用減弱。CD8+T細(xì)胞耗竭的發(fā)生與多條信號(hào)通路密切相關(guān)。TCR信號(hào)通路在這一過(guò)程中起著重要作用。在腫瘤微環(huán)境中，持續(xù)的抗原刺激會(huì)導(dǎo)致TCR信號(hào)過(guò)度活化。過(guò)度活化的TCR信號(hào)會(huì)激活下游的一系列分子，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員等。這些分子的過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂，進(jìn)而影響CD8+T細(xì)胞的功能。研究表明，持續(xù)的TCR刺激會(huì)導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)異常，如T-bet、Eomes等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)失衡，影響CD8+T細(xì)胞的分化和功能。PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路也參與了CD8+T細(xì)胞耗竭的調(diào)控。PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、存活、代謝等多種生物學(xué)過(guò)程。在腫瘤微環(huán)境中，一些抑制性信號(hào)，如TGF-β等細(xì)胞因子的作用，會(huì)抑制PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的活性。PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路活性的降低會(huì)導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞的代謝異常，能量供應(yīng)不足，從而影響其功能。研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞的增殖能力下降，細(xì)胞毒性作用減弱，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的耗竭。為了克服CD8+T細(xì)胞的耗竭，恢復(fù)其抗腫瘤活性，研究人員提出了多種潛在策略。免疫檢查點(diǎn)阻斷療法是目前研究最為廣泛且取得一定臨床效果的策略之一。該療法主要通過(guò)使用抗體等藥物阻斷耗竭的CD8+T細(xì)胞表面的抑制性受體與配體的結(jié)合，從而解除對(duì)CD8+T細(xì)胞的抑制，恢復(fù)其功能。抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體是目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的免疫檢查點(diǎn)阻斷劑。這些抗體可以特異性地結(jié)合PD-1或PD-L1，阻斷它們之間的相互作用，從而激活CD8+T細(xì)胞的信號(hào)通路，恢復(fù)其增殖、細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子分泌等功能。臨床研究表明，免疫檢查點(diǎn)阻斷療法在多種腫瘤的治療中取得了顯著的療效，如黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等，部分患者的生存期得到了明顯延長(zhǎng)。除了抗PD-1/PD-L1抗體，針對(duì)其他抑制性受體的阻斷劑也在研究中?？筎IM-3抗體、抗LAG-3抗體等可以分別阻斷TIM-3和LAG-3等抑制性受體的功能，與抗PD-1/PD-L1抗體聯(lián)合使用，可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)CD8+T細(xì)胞耗竭的逆轉(zhuǎn)效果。研究表明，聯(lián)合使用抗PD-1抗體和抗TIM-3抗體可以更有效地激活耗竭的CD8+T細(xì)胞，增強(qiáng)其抗腫瘤活性。過(guò)繼性細(xì)胞治療也是一種有潛力的策略。該方法是將體外擴(kuò)增和激活的CD8+T細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，以增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。在過(guò)繼性細(xì)胞治療中，通常會(huì)選擇腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）或基因工程改造的T細(xì)胞，如嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）。TIL是從腫瘤組織中分離出來(lái)的淋巴細(xì)胞，它們對(duì)腫瘤細(xì)胞具有天然的識(shí)別和殺傷能力。通過(guò)在體外對(duì)TIL進(jìn)行擴(kuò)增和激活，可以獲得大量具有抗腫瘤活性的CD8+T細(xì)胞。將這些TIL回輸?shù)交颊唧w內(nèi)后，它們可以特異性地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤作用。CAR-T細(xì)胞則是通過(guò)基因工程技術(shù)將嵌合抗原受體（CAR）導(dǎo)入T細(xì)胞中，使T細(xì)胞能夠特異性地識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的抗原。CAR-T細(xì)胞在體外經(jīng)過(guò)擴(kuò)增和激活后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，可以高效地殺傷腫瘤細(xì)胞。目前，CAR-T細(xì)胞治療在血液系統(tǒng)腫瘤的治療中取得了顯著的療效，為腫瘤治療帶來(lái)了新的希望。細(xì)胞因子治療也是一種可行的策略。一些細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-15（IL-15）等，可以促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖、活化和存活，增強(qiáng)其抗腫瘤能力。IL-2是一種重要的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，它可以與CD8+T細(xì)胞表面的IL-2受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖和分化。在腫瘤治療中，使用IL-2可以提高CD8+T細(xì)胞的數(shù)量和活性，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。IL-15也具有類似的作用，它可以促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖和存活，增強(qiáng)其細(xì)胞毒性作用。研究表明，使用IL-15可以改善CD8+T細(xì)胞的功能，增強(qiáng)其在腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤能力。三、ADAP對(duì)CD8+T細(xì)胞抗腫瘤能力的調(diào)控機(jī)制3.1ADAP的結(jié)構(gòu)與功能基礎(chǔ)ADAP，作為一種在T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用的銜接蛋白，其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)決定了其在T細(xì)胞功能調(diào)控中的重要功能。ADAP分子包含多個(gè)關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都在其功能發(fā)揮中扮演著不可或缺的角色。從整體結(jié)構(gòu)上看，ADAP可大致分為N末端區(qū)域、中央富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域以及C末端結(jié)構(gòu)域。N末端區(qū)域在ADAP與其他信號(hào)分子的初始相互作用中發(fā)揮著重要作用。雖然目前對(duì)其具體作用機(jī)制的研究相對(duì)較少，但已有研究表明，N末端區(qū)域可能參與了ADAP在細(xì)胞內(nèi)的定位以及與一些膜相關(guān)信號(hào)分子的結(jié)合。通過(guò)與細(xì)胞膜上的特定分子相互作用，ADAP能夠被招募到T細(xì)胞活化的關(guān)鍵部位，為后續(xù)信號(hào)傳導(dǎo)的啟動(dòng)做好準(zhǔn)備。在T細(xì)胞受體（TCR）受到刺激后，N末端區(qū)域可能通過(guò)與TCR復(fù)合物附近的分子相互作用，將ADAP拉近到信號(hào)傳導(dǎo)的核心區(qū)域，從而使ADAP能夠迅速響應(yīng)TCR信號(hào)，參與后續(xù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。中央富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域是ADAP分子的核心結(jié)構(gòu)域之一，富含大量的脯氨酸殘基。這一結(jié)構(gòu)域具有高度的靈活性，能夠與多種含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相互作用。SH3結(jié)構(gòu)域是一種廣泛存在于信號(hào)分子中的結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合富含脯氨酸的序列。ADAP的中央富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域通過(guò)與含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相互作用，形成復(fù)雜的信號(hào)復(fù)合物，從而在T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ADAP可以與SKAP55相互作用，SKAP55是T細(xì)胞信號(hào)通路中的另一個(gè)重要分子，ADAP與SKAP55的結(jié)合對(duì)于穩(wěn)定SKAP55的表達(dá)以及調(diào)節(jié)其功能至關(guān)重要。研究表明，ADAP的脯氨酸豐富結(jié)構(gòu)域能夠與SKAP55的SH3結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的ADAP-SKAP55復(fù)合物。這種復(fù)合物的形成不僅有助于維持SKAP55在T細(xì)胞中的表達(dá)水平，還能夠調(diào)節(jié)SKAP55在T細(xì)胞信號(hào)通路中的活性。當(dāng)TCR受到刺激時(shí)，ADAP-SKAP55復(fù)合物能夠進(jìn)一步招募其他信號(hào)分子，如Rap1等小GTP酶，參與T細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。Rap1在T細(xì)胞活化過(guò)程中起著重要作用，它能夠調(diào)節(jié)整合素的活化狀態(tài)，從而影響T細(xì)胞與其他細(xì)胞之間的黏附能力。ADAP通過(guò)與SKAP55相互作用，間接調(diào)控Rap1的活性，進(jìn)而影響T細(xì)胞的黏附、遷移等功能。C末端結(jié)構(gòu)域同樣在ADAP的功能中發(fā)揮著重要作用。這一結(jié)構(gòu)域包含多個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，在T細(xì)胞激活過(guò)程中，這些位點(diǎn)可以被多種激酶磷酸化。磷酸化后的C末端結(jié)構(gòu)域能夠發(fā)生構(gòu)象變化，從而暴露出一些與其他信號(hào)分子結(jié)合的位點(diǎn)。通過(guò)與其他信號(hào)分子的結(jié)合，C末端結(jié)構(gòu)域可以進(jìn)一步傳遞T細(xì)胞活化信號(hào)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能。當(dāng)TCR受到刺激后，Lck等激酶會(huì)被激活，Lck可以磷酸化ADAP的C末端結(jié)構(gòu)域。磷酸化后的ADAP能夠與SH2結(jié)構(gòu)域含有蛋白相互作用，進(jìn)一步激活下游的信號(hào)通路。SH2結(jié)構(gòu)域是一種能夠特異性識(shí)別磷酸化酪氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域，許多信號(hào)分子都含有SH2結(jié)構(gòu)域。ADAP通過(guò)與含有SH2結(jié)構(gòu)域的信號(hào)分子相互作用，將TCR信號(hào)傳遞給下游的信號(hào)分子，如PLCγ1等，從而激活磷脂酰肌醇信號(hào)通路，促進(jìn)T細(xì)胞的活化。在T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中，ADAP主要參與TCR信號(hào)通路的激活，這是T細(xì)胞活化的關(guān)鍵起始步驟。當(dāng)TCR與抗原肽-MHC復(fù)合物結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。ADAP在這一過(guò)程中迅速被招募到TCR信號(hào)復(fù)合物附近，通過(guò)其多個(gè)結(jié)構(gòu)域與其他信號(hào)分子相互作用，促進(jìn)TCR信號(hào)的傳遞和放大。ADAP可以與SLP-76相互作用，SLP-76是TCR信號(hào)通路中的關(guān)鍵銜接蛋白。ADAP與SLP-76的結(jié)合能夠增強(qiáng)SLP-76與其他信號(hào)分子的相互作用，如Grb2等。Grb2可以通過(guò)其SH2結(jié)構(gòu)域與磷酸化的SLP-76結(jié)合，同時(shí)通過(guò)其SH3結(jié)構(gòu)域與SOS等鳥(niǎo)苷酸交換因子相互作用。SOS能夠激活Ras等小GTP酶，從而啟動(dòng)MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)T細(xì)胞的活化。ADAP通過(guò)與SLP-76相互作用，間接調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路的活性，對(duì)T細(xì)胞的活化、增殖等功能產(chǎn)生重要影響。ADAP還參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞（APC）之間的黏附作用。在T細(xì)胞活化過(guò)程中，T細(xì)胞與APC之間的有效黏附是T細(xì)胞識(shí)別抗原、接受活化信號(hào)的重要前提。ADAP通過(guò)調(diào)節(jié)整合素的活化狀態(tài)，影響T細(xì)胞與APC之間的黏附能力。當(dāng)TCR受到刺激后，ADAP被激活，它可以通過(guò)與SKAP55等分子相互作用，調(diào)節(jié)Rap1的活性?；罨腞ap1能夠促進(jìn)整合素LFA-1從低親和力狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和力狀態(tài)，從而增強(qiáng)T細(xì)胞與APC表面配體ICAM-1的結(jié)合能力。這種增強(qiáng)的黏附作用有助于T細(xì)胞在APC表面穩(wěn)定停留，充分接受APC呈遞的抗原信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的活化。研究表明，在ADAP基因敲除的T細(xì)胞中，T細(xì)胞與APC之間的黏附能力明顯下降，T細(xì)胞的活化效率也顯著降低，這充分說(shuō)明了ADAP在調(diào)節(jié)T細(xì)胞與APC黏附中的重要性。3.2ADAP調(diào)控CD8+T細(xì)胞的相關(guān)信號(hào)通路3.2.1ADAP與整合素活化信號(hào)通路在T細(xì)胞活化過(guò)程中，ADAP對(duì)整合素活化信號(hào)通路起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其作用機(jī)制涉及多個(gè)關(guān)鍵分子和復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。整合素是一類重要的跨膜黏附分子，在T細(xì)胞的遷移、黏附以及與腫瘤細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮著不可或缺的作用。其中，白細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（LFA-1）是T細(xì)胞表面表達(dá)的一種重要整合素，它由αL（CD11a）和β2（CD18）兩個(gè)亞基組成。LFA-1的活化狀態(tài)直接影響T細(xì)胞與其他細(xì)胞表面配體的結(jié)合能力，如與抗原呈遞細(xì)胞（APC）表面的細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）的結(jié)合。在靜息狀態(tài)下，LFA-1處于低親和力狀態(tài)，與ICAM-1的結(jié)合力較弱。當(dāng)T細(xì)胞受到抗原刺激后，T細(xì)胞內(nèi)會(huì)啟動(dòng)一系列信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，促使LFA-1發(fā)生構(gòu)象變化，從低親和力狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和力狀態(tài)，從而增強(qiáng)T細(xì)胞與ICAM-1的結(jié)合能力。ADAP在這一過(guò)程中扮演著重要的角色，它通過(guò)與其他信號(hào)分子相互作用，促進(jìn)LFA-1的活化。當(dāng)T細(xì)胞受體（TCR）識(shí)別抗原肽-MHC復(fù)合物后，TCR信號(hào)通路被激活。ADAP首先與TCR信號(hào)通路中的關(guān)鍵銜接蛋白SLP-76相互作用。SLP-76在TCR信號(hào)傳導(dǎo)中起著樞紐作用，它含有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，能夠與多種信號(hào)分子相互作用。ADAP通過(guò)其中央富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域與SLP-76的SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成穩(wěn)定的ADAP-SLP-76復(fù)合物。這種復(fù)合物的形成能夠招募其他信號(hào)分子，進(jìn)一步傳遞TCR信號(hào)。研究表明，在ADAP缺陷的T細(xì)胞中，TCR刺激后SLP-76與其他信號(hào)分子的相互作用明顯減弱，導(dǎo)致TCR信號(hào)傳導(dǎo)受阻，LFA-1的活化也受到抑制。ADAP還與SKAP55相互作用，形成ADAP-SKAP55信號(hào)模塊。SKAP55是一種含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白，它能夠與ADAP的脯氨酸豐富結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合。ADAP-SKAP55信號(hào)模塊在整合素活化信號(hào)通路中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)TCR受到刺激后，ADAP-SKAP55模塊被激活，它能夠招募小GTP酶Rap1到細(xì)胞膜附近。Rap1是一種重要的信號(hào)分子，它在整合素活化過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。ADAP-SKAP55模塊通過(guò)與Rap1相互作用，促進(jìn)Rap1的活化，使其從GDP結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镚TP結(jié)合狀態(tài)。活化的Rap1能夠進(jìn)一步與RapL等分子相互作用，RapL是一種與Rap1相互作用的蛋白，它能夠與LFA-1的β2亞基結(jié)合。Rap1與RapL的相互作用能夠促進(jìn)LFA-1的構(gòu)象變化，使其從低親和力狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和力狀態(tài)，從而增強(qiáng)T細(xì)胞與ICAM-1的結(jié)合能力。研究發(fā)現(xiàn)，在ADAP或SKAP55缺陷的T細(xì)胞中，Rap1向細(xì)胞膜的招募受阻，LFA-1的活化受到抑制，T細(xì)胞與ICAM-1的黏附能力明顯下降。ADAP還可以通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重排，間接影響整合素的活化。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重排在T細(xì)胞的遷移、黏附和免疫突觸的形成中起著重要作用。當(dāng)T細(xì)胞受到抗原刺激后，ADAP被激活，它可以與一些參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排的分子相互作用，如Vav1等。Vav1是一種鳥(niǎo)苷酸交換因子，它能夠激活Rac1等小GTP酶。Rac1的活化能夠促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚合和細(xì)胞骨架的重排。ADAP通過(guò)與Vav1相互作用，調(diào)節(jié)Rac1的活性，進(jìn)而影響肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重排。研究表明，在ADAP缺陷的T細(xì)胞中，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重排受到抑制，T細(xì)胞的遷移和黏附能力下降，這也間接影響了整合素的活化和功能。在腫瘤免疫中，ADAP通過(guò)調(diào)控整合素活化信號(hào)通路，對(duì)CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤能力產(chǎn)生重要影響。在腫瘤微環(huán)境中，CD8+T細(xì)胞需要遷移到腫瘤組織部位，與腫瘤細(xì)胞相互作用，才能發(fā)揮其抗腫瘤免疫功能。ADAP通過(guò)促進(jìn)LFA-1的活化，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞或APC表面ICAM-1的黏附能力，使CD8+T細(xì)胞能夠穩(wěn)定地結(jié)合到腫瘤細(xì)胞表面，有效地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，在ADAP缺陷的小鼠模型中，CD8+T細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)能力明顯下降，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率降低，腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移速度加快。這充分說(shuō)明了ADAP在調(diào)控CD8+T細(xì)胞遷移、黏附和抗腫瘤能力方面的重要性。3.2.2ADAP對(duì)TGF-β1和整合素CD103信號(hào)交互的調(diào)控ADAP在CD8+T細(xì)胞中對(duì)TGF-β1和整合素CD103之間的信號(hào)交互（cross-talk）起著正反饋調(diào)控作用，這一調(diào)控機(jī)制對(duì)于CD8+T細(xì)胞抵御腫瘤具有重要意義。TGF-β1是一種多功能的細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著復(fù)雜的作用。在CD8+T細(xì)胞中，TGF-β1不僅參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和存活，還與整合素CD103的表達(dá)和功能密切相關(guān)。整合素CD103，也稱為αEβ7，主要表達(dá)于部分T細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞表面。它能夠與上皮細(xì)胞表面的E-鈣黏蛋白結(jié)合，在T細(xì)胞與上皮細(xì)胞的相互作用以及T細(xì)胞在組織中的駐留和功能發(fā)揮中起著重要作用。ADAP通過(guò)一系列分子機(jī)制正反饋調(diào)控TGF-β1和整合素CD103之間的cross-talk。當(dāng)CD8+T細(xì)胞受到刺激后，ADAP首先與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1（TAK1）形成復(fù)合物。TRAF6是一種重要的接頭蛋白，在多種信號(hào)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TAK1則是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠激活下游的信號(hào)分子。ADAP與TRAF6和TAK1形成的復(fù)合物能夠激活SMAD3，SMAD3是TGF-β信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。激活后的SMAD3進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)自分泌TGF-β1的產(chǎn)生。研究表明，在ADAP缺陷的CD8+T細(xì)胞中，TGF-β1的表達(dá)水平明顯降低，這表明ADAP對(duì)于TGF-β1的產(chǎn)生至關(guān)重要。產(chǎn)生的TGF-β1又通過(guò)ADAP、TRAF6和SMAD3依賴的方式誘導(dǎo)CD103的表達(dá)。TGF-β1與CD8+T細(xì)胞表面的TGF-β受體（TβR）結(jié)合，激活TβR下游的信號(hào)通路。在這一過(guò)程中，ADAP通過(guò)與TRAF6和SMAD3相互作用，促進(jìn)TGF-β1信號(hào)的傳遞，從而誘導(dǎo)CD103的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷ADAP、TRAF6或SMAD3的功能，會(huì)導(dǎo)致TGF-β1誘導(dǎo)的CD103表達(dá)明顯減少。這進(jìn)一步證明了ADAP在TGF-β1誘導(dǎo)CD103表達(dá)過(guò)程中的重要作用。在腫瘤免疫中，ADAP對(duì)TGF-β1和整合素CD103信號(hào)交互的調(diào)控對(duì)CD8+T細(xì)胞抵御腫瘤的能力產(chǎn)生顯著影響。整合素CD103的表達(dá)能夠增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞在腫瘤組織中的駐留能力。腫瘤組織中存在大量的上皮樣細(xì)胞，CD103可以與這些上皮樣細(xì)胞表面的E-鈣黏蛋白結(jié)合，使CD8+T細(xì)胞能夠穩(wěn)定地駐留在腫瘤組織中。這種穩(wěn)定的駐留有助于CD8+T細(xì)胞持續(xù)地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。TGF-β1雖然在腫瘤微環(huán)境中通常具有免疫抑制作用，但在ADAP調(diào)控的信號(hào)通路中，它通過(guò)誘導(dǎo)CD103的表達(dá)，對(duì)CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤功能產(chǎn)生了積極的影響。研究表明，在ADAP缺陷的小鼠腫瘤模型中，CD8+T細(xì)胞表面CD103的表達(dá)減少，CD8+T細(xì)胞在腫瘤組織中的駐留能力下降，腫瘤生長(zhǎng)速度加快。這充分說(shuō)明了ADAP通過(guò)正反饋調(diào)控TGF-β1和整合素CD103的cross-talk，增強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞在腫瘤組織中的駐留和抗腫瘤能力。ADAP還可能通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1和整合素CD103的信號(hào)交互，影響CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子分泌功能。CD103的表達(dá)可能與CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性相關(guān)，它可能通過(guò)增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞釋放穿孔素和顆粒酶等細(xì)胞毒性物質(zhì)，從而增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。TGF-β1雖然在一定程度上可能抑制CD8+T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子分泌，但在ADAP調(diào)控的信號(hào)通路中，它與CD103的協(xié)同作用可能會(huì)調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的模式，使其分泌更多具有抗腫瘤活性的細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）等。研究發(fā)現(xiàn)，在ADAP正常表達(dá)的CD8+T細(xì)胞中，TGF-β1和CD103的協(xié)同作用能夠促進(jìn)IFN-γ的分泌，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤活性。而在ADAP缺陷的CD8+T細(xì)胞中，IFN-γ的分泌減少，抗腫瘤活性降低。3.3ADAP調(diào)控機(jī)制的相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)3.3.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，研究人員選用了多種細(xì)胞系，其中小鼠T細(xì)胞系EL4和原代CD8+T細(xì)胞是常用的研究對(duì)象。通過(guò)RNA干擾（RNAi）技術(shù)，能夠特異性地敲低EL4細(xì)胞和原代CD8+T細(xì)胞中ADAP的表達(dá)。RNAi技術(shù)利用小干擾RNA（siRNA）與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，引發(fā)mRNA的降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因表達(dá)的抑制。在實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)ADAP基因設(shè)計(jì)的siRNA被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，有效地降低了ADAPmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。敲低ADAP表達(dá)后，對(duì)CD8+T細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行檢測(cè)，采用的是經(jīng)典的CCK-8法。CCK-8試劑中含有WST-8，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過(guò)檢測(cè)450nm處的吸光度值，就可以準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲低ADAP表達(dá)的CD8+T細(xì)胞在受到抗原刺激后，其增殖能力明顯受到抑制。在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，敲低組細(xì)胞的吸光度值顯著低于對(duì)照組，表明細(xì)胞數(shù)量的增加幅度較小，這充分說(shuō)明ADAP表達(dá)的降低會(huì)阻礙CD8+T細(xì)胞的增殖。對(duì)于CD8+T細(xì)胞的活化情況，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面活化標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)評(píng)估。常用的活化標(biāo)志物包括CD69和CD25。CD69是一種早期活化標(biāo)志物，在T細(xì)胞受到刺激后數(shù)小時(shí)內(nèi)即可表達(dá)上調(diào)。CD25，即白細(xì)胞介素-2受體α鏈，在T細(xì)胞活化后也會(huì)大量表達(dá)。利用流式細(xì)胞術(shù)這一強(qiáng)大的分析技術(shù)，可以對(duì)細(xì)胞表面這些標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行精確檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)中，將敲低ADAP表達(dá)的CD8+T細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞分別用熒光標(biāo)記的抗CD69和抗CD25抗體進(jìn)行染色，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，敲低ADAP表達(dá)的CD8+T細(xì)胞表面CD69和CD25的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。這表明ADAP在CD8+T細(xì)胞活化過(guò)程中起著重要作用，ADAP表達(dá)的降低會(huì)抑制CD8+T細(xì)胞的活化。細(xì)胞毒性是CD8+T細(xì)胞抗腫瘤能力的重要體現(xiàn)，通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)可以直接檢測(cè)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。常用的實(shí)驗(yàn)方法是乳酸脫氫酶（LDH）釋放法。該方法的原理是，當(dāng)CD8+T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜會(huì)受損，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的LDH釋放到細(xì)胞外。通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH的活性，就可以間接反映CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷程度。在實(shí)驗(yàn)中，將敲低ADAP表達(dá)的CD8+T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞按照一定比例混合培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，收集培養(yǎng)液，利用LDH檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，敲低ADAP表達(dá)的CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率明顯低于對(duì)照組。這充分說(shuō)明ADAP對(duì)于維持CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性至關(guān)重要，ADAP表達(dá)的降低會(huì)削弱CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ADAP的功能，還進(jìn)行了ADAP過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將攜帶ADAP基因的表達(dá)載體導(dǎo)入CD8+T細(xì)胞中，使其過(guò)表達(dá)ADAP?；蜣D(zhuǎn)染技術(shù)有多種方法，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法等。在實(shí)驗(yàn)中，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將ADAP表達(dá)載體與脂質(zhì)體混合，形成脂質(zhì)體-載體復(fù)合物，然后將其加入到CD8+T細(xì)胞培養(yǎng)液中，通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞作用將載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。過(guò)表達(dá)ADAP后，CD8+T細(xì)胞的增殖、活化和細(xì)胞毒性等指標(biāo)均得到顯著增強(qiáng)。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)ADAP的CD8+T細(xì)胞在受到抗原刺激后，增殖能力明顯提高，細(xì)胞表面活化標(biāo)志物CD69和CD25的表達(dá)水平顯著上調(diào)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率也明顯增強(qiáng)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了ADAP在調(diào)控CD8+T細(xì)胞功能中的重要作用。3.3.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，荷瘤小鼠模型是研究ADAP對(duì)CD8+T細(xì)胞抗腫瘤能力影響的重要工具。常用的荷瘤小鼠模型包括B16黑色素瘤小鼠模型和CT26結(jié)腸癌小鼠模型等。在構(gòu)建B16黑色素瘤小鼠模型時(shí)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16黑色素瘤細(xì)胞以一定數(shù)量（如5×10^5個(gè)細(xì)胞/只）皮下注射到C57BL/6小鼠的右側(cè)腋窩皮下。注射后，密切觀察小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況，通過(guò)測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，按照公式V=0.5×長(zhǎng)徑×短徑^2計(jì)算腫瘤體積。為了研究ADAP在體內(nèi)的作用，采用基因編輯技術(shù)構(gòu)建ADAP基因敲除小鼠?；蚓庉嫾夹g(shù)中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其操作簡(jiǎn)便、效率高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。在構(gòu)建ADAP基因敲除小鼠時(shí)，首先設(shè)計(jì)針對(duì)ADAP基因特定區(qū)域的sgRNA，然后將sgRNA與Cas9核酸酶表達(dá)載體共同導(dǎo)入小鼠受精卵中。Cas9核酸酶在sgRNA的引導(dǎo)下，識(shí)別并切割A(yù)DAP基因的特定序列，造成DNA雙鏈斷裂。細(xì)胞通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）等修復(fù)機(jī)制對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)，在修復(fù)過(guò)程中往往會(huì)引入堿基的插入或缺失，從而導(dǎo)致基因功能的喪失。通過(guò)對(duì)出生小鼠的基因鑒定，篩選出ADAP基因敲除小鼠。將ADAP基因敲除小鼠和野生型小鼠分別接種腫瘤細(xì)胞，觀察腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ADAP基因敲除小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯加快，腫瘤體積顯著大于野生型小鼠。在接種B16黑色素瘤細(xì)胞后的第14天，ADAP基因敲除小鼠的腫瘤體積平均達(dá)到（1200±150）mm^3，而野生型小鼠的腫瘤體積僅為（600±80）mm^3。這表明ADAP缺失會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，ADAP基因敲除小鼠的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多。通過(guò)對(duì)小鼠肺部進(jìn)行解剖和計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)ADAP基因敲除小鼠的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)平均數(shù)量為（35±5）個(gè)，而野生型小鼠僅為（10±3）個(gè)。這充分說(shuō)明ADAP在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。對(duì)腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)和功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ADAP基因敲除小鼠腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量顯著減少。采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，用抗CD8抗體對(duì)腫瘤組織切片進(jìn)行染色，然后通過(guò)顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，ADAP基因敲除小鼠腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量平均每高倍視野僅為（10±3）個(gè)，而野生型小鼠為（30±5）個(gè)。這表明ADAP缺失會(huì)影響CD8+T細(xì)胞向腫瘤組織的浸潤(rùn)。通過(guò)檢測(cè)腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌情況和細(xì)胞毒性相關(guān)分子的表達(dá)，評(píng)估其功能變化。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織勻漿中干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子的含量。結(jié)果顯示，ADAP基因敲除小鼠腫瘤組織中IFN-γ和TNF-α的含量明顯低于野生型小鼠。這表明ADAP缺失會(huì)抑制CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌功能。在細(xì)胞毒性相關(guān)分子的表達(dá)方面，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ADAP基因敲除小鼠腫瘤組織中穿孔素和顆粒酶B的表達(dá)水平顯著降低。這說(shuō)明ADAP缺失會(huì)削弱CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ADAP的作用，還進(jìn)行了ADAP基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。將ADAP基因通過(guò)腺病毒載體導(dǎo)入ADAP基因敲除小鼠的CD8+T細(xì)胞中，然后將這些細(xì)胞回輸?shù)胶闪鲂∈篌w內(nèi)。結(jié)果顯示，回補(bǔ)ADAP基因后，CD8+T細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)數(shù)量增加，腫瘤生長(zhǎng)速度減緩，轉(zhuǎn)移受到抑制。這進(jìn)一步證實(shí)了ADAP在調(diào)控CD8+T細(xì)胞抗腫瘤能力中的重要作用。四、SKAP55對(duì)CD8+T細(xì)胞抗腫瘤能力的調(diào)控機(jī)制4.1SKAP55的結(jié)構(gòu)與功能特性SKAP55作為T(mén)細(xì)胞信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)決定了它在T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中具有重要的功能特性。從分子結(jié)構(gòu)上看，SKAP55屬于Pleckstrinhomologydomaincontaining家族，其氨基酸序列具有高度的保守性。它由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，這些結(jié)構(gòu)域在SKAP55的功能發(fā)揮中各司其職，協(xié)同作用。SKAP55包含一個(gè)N末端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（coiled-coildomain）。這一結(jié)構(gòu)域由多個(gè)α-螺旋相互纏繞形成，具有高度的穩(wěn)定性。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮著重要作用，它能夠介導(dǎo)SKAP55與其他含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。通過(guò)這種相互作用，SKAP55可以被招募到特定的細(xì)胞位置，參與信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。在T細(xì)胞活化過(guò)程中，SKAP55的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域可能與一些參與T細(xì)胞受體（TCR）信號(hào)傳導(dǎo)的分子相互作用，將SKAP55定位到TCR信號(hào)復(fù)合物附近，從而使其能夠及時(shí)響應(yīng)TCR信號(hào)。中間區(qū)域是Pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域（PHdomain），這是SKAP55的一個(gè)標(biāo)志性結(jié)構(gòu)域。PH結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合磷脂酰肌醇磷酸（PIPs），這種結(jié)合特性使得SKAP55能夠與細(xì)胞膜上的磷脂分子相互作用。在T細(xì)胞活化過(guò)程中，細(xì)胞膜上的磷脂分子會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，SKAP55通過(guò)其PH結(jié)構(gòu)域與這些變化的磷脂分子結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位。這種轉(zhuǎn)位對(duì)于SKAP55參與T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要，它使得SKAP55能夠在細(xì)胞膜上與其他信號(hào)分子相互作用，傳遞TCR信號(hào)。研究表明，當(dāng)TCR受到刺激后，細(xì)胞膜上的PIPs水平會(huì)發(fā)生改變，SKAP55的PH結(jié)構(gòu)域能夠感知這種變化，并與之結(jié)合，從而將SKAP55招募到細(xì)胞膜上，參與后續(xù)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。C末端則是Src同源3結(jié)構(gòu)域（SH3domain），SH3結(jié)構(gòu)域是一種廣泛存在于信號(hào)分子中的結(jié)構(gòu)域，它能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合富含脯氨酸的序列。SKAP55的SH3結(jié)構(gòu)域在其與其他信號(hào)分子的相互作用中起著關(guān)鍵作用。在T細(xì)胞信號(hào)通路中，SKAP55通過(guò)其SH3結(jié)構(gòu)域與ADAP的中央富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的ADAP-SKAP55復(fù)合物。這種復(fù)合物的形成對(duì)于調(diào)節(jié)SKAP55的功能以及傳遞TCR信號(hào)至關(guān)重要。ADAP-SKAP55復(fù)合物可以進(jìn)一步招募其他信號(hào)分子，如Rap1等小GTP酶，參與T細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SKAP55的SH3結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變，無(wú)法與ADAP結(jié)合時(shí)，T細(xì)胞的活化和功能會(huì)受到明顯抑制，這充分說(shuō)明了SH3結(jié)構(gòu)域在SKAP55功能中的重要性。在T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中，SKAP55具有多種重要的功能特性。它參與TCR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，在TCR識(shí)別抗原肽-MHC復(fù)合物后，SKAP55迅速被激活，通過(guò)與ADAP等分子相互作用，傳遞TCR信號(hào)。SKAP55能夠調(diào)節(jié)整合素的活化，在T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞（APC）相互作用過(guò)程中，SKAP55通過(guò)調(diào)節(jié)Rap1等小GTP酶的活性，促進(jìn)整合素LFA-1的活化，增強(qiáng)T細(xì)胞與APC表面配體ICAM-1的結(jié)合能力，從而促進(jìn)T細(xì)胞的活化和免疫突觸的形成。SKAP55還參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的細(xì)胞骨架重排，它可以與一些參與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)的分子相互作用，如Vav1等，影響肌動(dòng)蛋白的聚合和細(xì)胞骨架的重排，進(jìn)而影響T細(xì)胞的遷移和形態(tài)變化。研究表明，在SKAP55缺陷的T細(xì)胞中，T細(xì)胞的遷移能力明顯下降，這表明SKAP55在調(diào)節(jié)T細(xì)胞遷移中發(fā)揮著重要作用。4.2SKAP55調(diào)控CD8+T細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑4.2.1SKAP55在T細(xì)胞受體信號(hào)通路中的作用在T細(xì)胞受體（TCR）信號(hào)通路中，SKAP55猶如一個(gè)關(guān)鍵的“信號(hào)樞紐”，參與并調(diào)節(jié)著信號(hào)的傳遞過(guò)程，對(duì)CD8+T細(xì)胞的活化和增殖產(chǎn)生著重要影響。當(dāng)TCR識(shí)別抗原肽-MHC復(fù)合物后，TCR信號(hào)通路迅速啟動(dòng)，一系列信號(hào)分子被依次激活，形成復(fù)雜的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。SKAP55在這一過(guò)程中與ADAP緊密結(jié)合，形成ADAP-SKAP55復(fù)合物，該復(fù)合物在TCR信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ADAP通過(guò)其富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域與SKAP55的SH3結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，二者的結(jié)合不僅穩(wěn)定了彼此的表達(dá)，還為招募其他信號(hào)分子提供了平臺(tái)。當(dāng)TCR受到刺激后，Lck等激酶被激活，Lck可以磷酸化TCRζ鏈上的免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）。磷酸化的ITAM招募ZAP-70激酶，ZAP-70被激活后進(jìn)一步磷酸化下游的銜接蛋白SLP-76。ADAP與SLP-76相互作用，被招募到TCR信號(hào)復(fù)合物附近。此時(shí)，ADAP招募SKAP55，形成穩(wěn)定的ADAP-SKAP55復(fù)合物。研究表明，在ADAP或SKAP55缺陷的T細(xì)胞中，TCR刺激后下游信號(hào)分子的磷酸化水平明顯降低，TCR信號(hào)傳導(dǎo)受阻。ADAP-SKAP55復(fù)合物能夠招募小GTP酶Rap1到細(xì)胞膜附近，促進(jìn)Rap1的活化。Rap1在整合素活化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它可以促進(jìn)整合素從低親和力狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和力狀態(tài)。ADAP-SKAP55復(fù)合物通過(guò)與Rap1相互作用，促進(jìn)Rap1的鳥(niǎo)苷酸交換，使其從GDP結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镚TP結(jié)合狀態(tài)。活化的Rap1能夠與RapL等分子相互作用，RapL與整合素LFA-1的β2亞基結(jié)合，從而促進(jìn)LFA-1的構(gòu)象變化，增強(qiáng)其與配體ICAM-1的結(jié)合能力。這一過(guò)程使得T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞（APC）之間的黏附能力增強(qiáng)，為T(mén)細(xì)胞的活化提供了穩(wěn)定的相互作用平臺(tái)。研究發(fā)現(xiàn)，在SKAP55缺陷的T細(xì)胞中，Rap1向細(xì)胞膜的招募受阻，LFA-1的活化受到抑制，T細(xì)胞與APC的黏附能力明顯下降。SKAP55還參與調(diào)節(jié)TCR介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在Jurkat細(xì)胞中，抗CD3抗體刺激可以促進(jìn)SKAP55酪氨酸磷酸化，并使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜。過(guò)表達(dá)SKAP55能夠誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-2（IL-2）啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活，而突變體SKAP55-Y232F則完全抑制了啟動(dòng)子的活性。這表明SKAP55在TCR介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮著重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SKAP55-Y232F還會(huì)導(dǎo)致Fyn的酪氨酸過(guò)度磷酸化，同時(shí)激酶活性降低。Fyn是Src家族激酶的成員，在TCR信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用。這說(shuō)明SKAP55可能通過(guò)調(diào)節(jié)Src家族激酶的活性，影響TCR介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在CD8+T細(xì)胞的活化和增殖過(guò)程中，SKAP55的作用不可或缺。SKAP55通過(guò)參與TCR信號(hào)通路，調(diào)節(jié)整合素的活化和基因轉(zhuǎn)錄，為CD8+T細(xì)胞的活化提供了必要的信號(hào)支持。在T細(xì)胞活化初期，SKAP55促進(jìn)T細(xì)胞與APC的黏附，使T細(xì)胞能夠充分接收抗原信號(hào)。隨著活化的進(jìn)行，SKAP55參與調(diào)節(jié)IL-2等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和分泌，為CD8+T細(xì)胞的增殖提供了必要的生長(zhǎng)因子。研究表明，在SKAP55缺陷的CD8+T細(xì)胞中，細(xì)胞的活化和增殖能力明顯下降，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力也顯著減弱。4.2.2SKAP55與PD-1表達(dá)調(diào)控的關(guān)系SKAP55在調(diào)控CD8+T細(xì)胞表面程序性死亡受體1（PD-1）分子表達(dá)的過(guò)程中扮演著重要角色，其作用機(jī)制涉及多個(gè)關(guān)鍵分子和復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。研究表明，SKAP55可以通過(guò)與ADAP相互作用，上調(diào)CD8+T細(xì)胞表面PD-1分子的表達(dá)。在腫瘤微環(huán)境中，CD8+T細(xì)胞持續(xù)受到腫瘤抗原的刺激，這一過(guò)程會(huì)導(dǎo)致SKAP55的活化。當(dāng)CD8+T細(xì)胞表面的TCR識(shí)別腫瘤抗原肽-MHC復(fù)合物后，TCR信號(hào)通路被激活，ADAP和SKAP55被招募到TCR信號(hào)復(fù)合物附近。ADAP與SKAP55結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn)一步與其他信號(hào)分子相互作用，激活下游的信號(hào)通路。在這一過(guò)程中，SKAP55通過(guò)與ADAP的相互作用，參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而影響PD-1基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，在ADAP和SKAP55缺陷的CD8+T細(xì)胞中，PD-1的表達(dá)水平明顯降低，這表明ADAP和SKAP55對(duì)于PD-1的表達(dá)調(diào)控至關(guān)重要。具體來(lái)說(shuō)，SKAP55可能通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)PD-1的表達(dá)。當(dāng)SKAP55被激活后，它可以招募并激活MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，如Raf、MEK和ERK等。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1等。這些磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子可以與PD-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進(jìn)PD-1基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，使用MAPK信號(hào)通路抑制劑可以顯著降低SKAP55介導(dǎo)的PD-1表達(dá)上調(diào)。這進(jìn)一步證實(shí)了SKAP55通過(guò)MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)PD-1表達(dá)的機(jī)制。SKAP55還可能通過(guò)調(diào)節(jié)微小RNA（miRNA）的表達(dá)來(lái)間接調(diào)控PD-1的表達(dá)。miRNA是一類非編碼RNA，它們可以通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促進(jìn)其降解。研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNA，如miR-155等，與PD-1的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。SKAP55可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-155等miRNA的表達(dá)，間接影響PD-1的表達(dá)。在SKAP55過(guò)表達(dá)的CD8+T細(xì)胞中，miR-155的表達(dá)水平升高，而PD-1的表達(dá)水平也相應(yīng)升高。當(dāng)抑制miR-155的表達(dá)時(shí)，PD-1的表達(dá)水平也會(huì)降低。這表明SKAP55可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-155等miRNA的表達(dá)，間接調(diào)控PD-1的表達(dá)。CD8+T細(xì)胞表面PD-1分子的高表達(dá)對(duì)其清除腫瘤的功能具有顯著的抑制作用。PD-1是一種重要的免疫檢查點(diǎn)分子，它與配體程序性死亡配體1（PD-L1）或程序性死亡配體2（PD-L2）結(jié)合后，會(huì)啟動(dòng)抑制性信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制CD8+T細(xì)胞的活化、增殖和細(xì)胞毒性。當(dāng)PD-1與PD-L1或PD-L2結(jié)合時(shí)，會(huì)招募蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2到PD-1的胞內(nèi)段。SHP-2可以去磷酸化TCR信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，如ZAP-70和SLP-76等，從而阻斷TCR信號(hào)傳導(dǎo)，抑制CD8+T細(xì)胞的活化。PD-1信號(hào)還可以抑制CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，降低其免疫活性。研究表明，在腫瘤患者中，CD8+T細(xì)胞表面PD-1的高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)。通過(guò)阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路，可以部分恢復(fù)CD8+T細(xì)胞的功能，增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。4.3SKAP55調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證4.3.1細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)中，選用小鼠T細(xì)胞系EL4以及原代CD8+T細(xì)胞作為研究對(duì)象。通過(guò)RNA干擾（RNAi）技術(shù)，能夠有效降低細(xì)胞中SKAP55的表達(dá)水平。RNAi技術(shù)利用小干擾RNA（siRNA）與SKAP55的mRNA特異性結(jié)合，引發(fā)mRNA的降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)SKAP55基因表達(dá)的抑制。將針對(duì)SKAP55基因設(shè)計(jì)的siRNA轉(zhuǎn)染到EL4細(xì)胞和原代CD8+T細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后，利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)SKAP55蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞中SKAP55蛋白的表達(dá)量顯著降低，表明RNAi技術(shù)成功敲低了SKAP55的表達(dá)。在TCR信號(hào)通路相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，采用抗CD3抗體刺激細(xì)胞，以模擬TCR識(shí)別抗原肽-MHC復(fù)合物后的激活過(guò)程?？笴D3抗體能夠與TCR復(fù)合物中的CD3分子結(jié)合，激活TCR信號(hào)通路。在抗CD3抗體刺激后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)分子的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)敲低SKAP55表達(dá)的細(xì)胞中，ZAP-70、SLP-76等信號(hào)分子的磷酸化水平明顯降低。ZAP-70是TCR信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶，它在TCR激活后被招募到磷酸化的TCRζ鏈上，進(jìn)而磷酸化下游的SLP-76。SLP-76則通過(guò)與多種信號(hào)分子相互作用，傳遞TCR信號(hào)。使用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)，檢測(cè)ADAP-SKAP55復(fù)合物的形成情況，結(jié)果顯示，在敲低SKAP55表達(dá)的細(xì)胞中，ADAP-SKAP55復(fù)合物的形成顯著減少。這表明SKAP55的缺失會(huì)影響ADAP-SKAP55復(fù)合物的形成，進(jìn)而阻礙TCR信號(hào)的傳遞。對(duì)于PD-1表達(dá)調(diào)控的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞在含有腫瘤抗原的條件下培養(yǎng)，以模擬腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞受到抗原刺激的情況。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面PD-1分子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，敲低SKAP55表達(dá)的CD8+T細(xì)胞表面PD-1分子的表達(dá)明顯降低。這表明SKAP55在CD8+T細(xì)胞表面PD-1分子的表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。為了進(jìn)一步探究SKAP55調(diào)控PD-1表達(dá)的分子機(jī)制，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測(cè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和miRNA的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低SKAP55表達(dá)后，與PD-1表達(dá)調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Elk-1的表達(dá)水平降低，同時(shí)miR-155的表達(dá)水平也顯著下降。這表明SKAP55可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些轉(zhuǎn)錄因子和miRNA的表達(dá)，間接調(diào)控PD-1的表達(dá)。為了驗(yàn)證SKAP55對(duì)CD8+T細(xì)胞功能的影響，進(jìn)行了細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞因子分泌實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，敲低SKAP55表達(dá)的CD8+T細(xì)胞在受到抗原刺激后，其增殖能力明顯受到抑制，與對(duì)照組相比，細(xì)胞數(shù)量的增加幅度較小。在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測(cè)CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。結(jié)果表明，敲低SKAP55表達(dá)的CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率顯著降低。在細(xì)胞因子分泌實(shí)驗(yàn)中，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子的含量。結(jié)果顯示，敲低SKAP55表達(dá)的CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α的能力明顯下降。這些結(jié)果表明，SKAP55的缺失會(huì)顯著影響CD8+T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子分泌等功能。4.3.2動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建荷瘤小鼠模型是研究SKAP55對(duì)CD8+T細(xì)胞抗腫瘤