microRNA-21在豬骨骼肌生長發(fā)育中的分子調(diào)控機制解析一、引言1.1研究背景豬作為全球范圍內(nèi)最重要的家畜之一，在人類的飲食結(jié)構(gòu)中占據(jù)著舉足輕重的地位。豬肉不僅是人類獲取蛋白質(zhì)的主要來源，其產(chǎn)量和品質(zhì)也直接關(guān)系到全球肉類市場的穩(wěn)定與發(fā)展。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球豬肉產(chǎn)量在過去幾十年中持續(xù)增長，2023年全球豬肉產(chǎn)量達到了1.13億噸，占全球肉類總產(chǎn)量的36.7%。中國作為世界上最大的豬肉生產(chǎn)和消費國，2023年豬肉產(chǎn)量達到了5794萬噸，占全球總產(chǎn)量的51.3%。由此可見，豬肉產(chǎn)業(yè)在全球農(nóng)業(yè)經(jīng)濟和人類生活中扮演著不可或缺的角色。豬骨骼肌的生長發(fā)育是決定豬肉產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素。骨骼肌作為豬體內(nèi)最大的組織之一，其發(fā)育狀況直接影響到豬的生長速度、瘦肉率以及肉質(zhì)口感等重要經(jīng)濟性狀。從胚胎期的肌細(xì)胞增殖與分化，到出生后的肌肉纖維增粗和肥大，豬骨骼肌的生長發(fā)育是一個受到多種基因和信號通路精細(xì)調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過程。在胚胎發(fā)育早期，生肌祖細(xì)胞在一系列轉(zhuǎn)錄因子的作用下，逐步分化為成肌細(xì)胞，并進一步融合形成多核肌管，奠定了肌肉組織的基本結(jié)構(gòu)。出生后，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞被激活，參與肌肉的生長、修復(fù)和再生過程，通過增殖、分化和融合，不斷增加肌肉纖維的數(shù)量和體積。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對豬骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控機制有了更深入的認(rèn)識。研究表明，除了傳統(tǒng)的編碼基因外，非編碼RNA在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。MicroRNA（miRNA）作為一類長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA的互補配對，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行負(fù)調(diào)控，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程。在豬骨骼肌生長發(fā)育過程中，miRNA通過靶向作用于關(guān)鍵基因和信號通路，精細(xì)調(diào)節(jié)肌細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，從而影響肌肉的生長和發(fā)育。例如，miR-1、miR-133和miR-206等肌肉特異性miRNA在骨骼肌發(fā)育過程中呈現(xiàn)出動態(tài)表達模式，它們通過靶向調(diào)控肌生成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和信號通路，促進肌細(xì)胞的分化和肌纖維的形成；而miR-27則通過抑制肌生成抑制素（MSTN）的表達，促進骨骼肌的生長和發(fā)育。MicroRNA-21（miR-21）作為一種在多種組織和細(xì)胞中廣泛表達的miRNA，近年來在基因調(diào)控層面的研究中受到了廣泛關(guān)注。在腫瘤研究領(lǐng)域，miR-21被發(fā)現(xiàn)具有致癌作用，它通過靶向抑制腫瘤抑制基因的表達，促進腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在心血管疾病研究中，miR-21參與心肌細(xì)胞的增殖、凋亡和纖維化過程，對心臟功能的維持和疾病的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。在骨骼肌生長發(fā)育方面，已有研究表明miR-21在肌肉損傷修復(fù)和肌肉疾病中發(fā)揮著重要作用，但關(guān)于miR-21在豬骨骼肌生長發(fā)育過程中的調(diào)控機制仍有待深入研究。揭示miR-21在豬骨骼肌生長發(fā)育中的作用機制，不僅有助于深入理解豬骨骼肌生長發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為豬肉產(chǎn)業(yè)的遺傳改良提供理論依據(jù)，還可能為人類肌肉疾病的治療提供新的思路和靶點。1.2研究目的與意義本研究旨在深入揭示MicroRNA-21對豬骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控機制，為豬的遺傳育種提供堅實的理論依據(jù)，具體而言，本研究將從以下幾個方面展開：通過對不同生長發(fā)育階段豬骨骼肌中MicroRNA-21表達模式的分析，明確其在豬骨骼肌生長發(fā)育過程中的時空表達特征，揭示其與豬骨骼肌生長發(fā)育進程的內(nèi)在聯(lián)系；利用分子生物學(xué)技術(shù)，如RNA干擾、過表達等，改變豬骨骼肌細(xì)胞中MicroRNA-21的表達水平，深入探究其對豬骨骼肌細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響，闡明其在豬骨骼肌細(xì)胞生物學(xué)過程中的具體作用；借助生物信息學(xué)預(yù)測和實驗驗證相結(jié)合的方法，篩選并鑒定MicroRNA-21的靶基因，解析其通過靶向調(diào)控關(guān)鍵基因和信號通路，對豬骨骼肌生長發(fā)育進行調(diào)控的分子機制；綜合以上研究結(jié)果，為豬的遺傳育種提供新的分子靶點和理論基礎(chǔ)，助力培育出生長速度更快、瘦肉率更高、肉質(zhì)更優(yōu)的豬新品種，推動豬肉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。豬肉作為全球范圍內(nèi)廣泛消費的肉類產(chǎn)品，其產(chǎn)量和品質(zhì)對于滿足人類日益增長的蛋白質(zhì)需求、保障糧食安全以及促進農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。豬骨骼肌的生長發(fā)育狀況直接決定了豬肉的產(chǎn)量和品質(zhì)，深入研究豬骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控機制，對于提高豬肉產(chǎn)量、改善肉質(zhì)品質(zhì)具有至關(guān)重要的作用。近年來，隨著消費者對豬肉品質(zhì)要求的不斷提高，如何培育出具有優(yōu)良肉質(zhì)性狀的豬品種已成為豬遺傳育種領(lǐng)域的研究熱點。MicroRNA-21作為一種重要的非編碼RNA，在豬骨骼肌生長發(fā)育過程中發(fā)揮著潛在的調(diào)控作用，深入研究其調(diào)控機制，不僅有助于豐富我們對豬骨骼肌生長發(fā)育分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識，還可能為豬的遺傳育種提供新的思路和方法，具有重要的理論意義和實踐價值。二、豬骨骼肌生長發(fā)育機制概述2.1豬骨骼肌的生長發(fā)育過程豬骨骼肌的生長發(fā)育是一個連續(xù)且復(fù)雜的生物學(xué)過程，從胚胎期開始啟動，一直持續(xù)到出生后個體的生長階段。在這一過程中，涉及到一系列細(xì)胞的增殖、分化和融合等關(guān)鍵事件，這些事件受到多種基因和信號通路的精確調(diào)控。了解豬骨骼肌生長發(fā)育的過程，對于深入探究其調(diào)控機制以及提高豬肉產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。2.1.1胚胎期骨骼肌發(fā)育胚胎期是豬骨骼肌發(fā)育的關(guān)鍵時期，這一時期的發(fā)育過程為出生后骨骼肌的生長和功能奠定了基礎(chǔ)。在胚胎發(fā)育早期，體節(jié)的生肌節(jié)區(qū)是產(chǎn)生肌祖細(xì)胞的重要區(qū)域。肌祖細(xì)胞起源于中胚層，是一類具有自我更新和分化能力的干細(xì)胞。這些細(xì)胞呈現(xiàn)單核狀態(tài)，能夠進行活躍的DNA復(fù)制及細(xì)胞分裂，通過不斷的增殖來增加細(xì)胞數(shù)量。在成肌細(xì)胞決定因子（如MyoD、Myf5等）的作用下，肌祖細(xì)胞進一步分化形成單核成肌細(xì)胞。與肌祖細(xì)胞不同，成肌細(xì)胞雖然失去了DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂的能力，但卻獲得了向肌細(xì)胞分化的能力。當(dāng)成肌細(xì)胞增殖到一定階段后，在成肌異性蛋白（如Myogenin等）及相應(yīng)細(xì)胞黏附因子（如N-cadherin等）的作用下，它們開始聚集并相互融合，形成肌管。肌管是一種含有肌原纖維的長圓柱形多核細(xì)胞，其形成標(biāo)志著骨骼肌發(fā)育進入了一個新的階段。隨著發(fā)育的進行，肌管內(nèi)的肌原纖維數(shù)量不斷增多，這是由于肌動蛋白和肌球蛋白等蛋白質(zhì)的合成和組裝不斷增加。同時，細(xì)胞核也逐漸向細(xì)胞（肌管）周邊移動，這一過程與肌原纖維的增多密切相關(guān)，可能涉及到細(xì)胞骨架的動態(tài)變化和相關(guān)信號通路的調(diào)控。最終，肌管發(fā)育形成肌纖維，即成熟的骨骼肌細(xì)胞。這些肌纖維具有收縮功能，是構(gòu)成骨骼肌組織的基本單位。豬的胚胎期骨骼肌發(fā)育具有明顯的階段性和時間特征。研究表明，豬的肌纖維增殖主要在妊娠期的前90天完成，其中初級肌纖維在妊娠35-55天形成。初級肌纖維的形成決定了未來肌纖維的族群數(shù)，它們作為后續(xù)肌纖維發(fā)育的基礎(chǔ)。隨后，次級肌纖維以初級肌纖維為支架，在其四周進行增殖，這一過程在妊娠85-90天完成。次級肌纖維的形成進一步增加了肌纖維的數(shù)量和密度，對骨骼肌的生長和功能發(fā)育具有重要影響。在胚胎期，骨骼肌的發(fā)育還受到多種基因和信號通路的調(diào)控，如Wnt信號通路、Notch信號通路等，這些信號通路相互作用，共同調(diào)節(jié)肌祖細(xì)胞的增殖、分化和肌纖維的形成。2.1.2出生后骨骼肌生長出生后，豬骨骼肌的生長主要通過肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增殖和分化來實現(xiàn)。肌肉衛(wèi)星細(xì)胞是一種位于骨骼肌肌纖維膜與基膜之間的成肌干細(xì)胞，在正常生理條件下，它們處于靜息狀態(tài)，代謝活動相對較低。當(dāng)受到外界刺激，如肌肉損傷、運動或生長激素等因素的作用時，衛(wèi)星細(xì)胞被激活，進入細(xì)胞周期，開始進行活躍的增殖。激活后的衛(wèi)星細(xì)胞通過有絲分裂不斷增加細(xì)胞數(shù)量，這些增殖的衛(wèi)星細(xì)胞一部分會繼續(xù)保持干細(xì)胞狀態(tài)，作為儲備細(xì)胞，以維持肌肉組織的干細(xì)胞池；另一部分則會向成肌細(xì)胞方向分化。在分化過程中，衛(wèi)星細(xì)胞會表達一系列與肌肉分化相關(guān)的基因，如MyoD、Myogenin等，這些基因的表達調(diào)控著衛(wèi)星細(xì)胞向成熟肌纖維的轉(zhuǎn)變。分化后的衛(wèi)星細(xì)胞逐漸融合到已有的肌纖維中，或者相互融合形成新的肌纖維，從而實現(xiàn)骨骼肌的生長和修復(fù)。在豬的生長過程中，骨骼肌的生長速度和程度受到多種因素的影響。營養(yǎng)因素是其中一個重要的方面，充足的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)對于骨骼肌的生長至關(guān)重要。例如，蛋白質(zhì)是骨骼肌生長的主要原料，氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本組成單位，對于肌肉的生長和修復(fù)具有關(guān)鍵作用。缺乏蛋白質(zhì)或某些必需氨基酸會導(dǎo)致骨骼肌生長受阻，肌肉質(zhì)量下降。生長激素、胰島素樣生長因子（IGF-1）等激素也對骨骼肌生長具有重要的調(diào)節(jié)作用。生長激素可以促進蛋白質(zhì)合成，增加肌肉細(xì)胞的體積和數(shù)量；IGF-1則可以刺激衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化，促進肌纖維的生長和肥大。運動也可以刺激骨骼肌的生長，適當(dāng)?shù)倪\動可以增加肌肉的負(fù)荷，激活相關(guān)信號通路，促進衛(wèi)星細(xì)胞的激活和增殖，從而促進骨骼肌的生長和發(fā)育。2.2調(diào)控豬骨骼肌生長發(fā)育的主要因素豬骨骼肌的生長發(fā)育是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，受到多種因素的精確調(diào)控。這些因素相互作用，共同影響著骨骼肌的形成、生長和功能維持。深入了解這些調(diào)控因素，對于揭示豬骨骼肌生長發(fā)育的分子機制，提高豬肉產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。2.2.1遺傳因素遺傳因素在豬骨骼肌生長發(fā)育中起著決定性作用，眾多基因參與其中，它們通過復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，精確地控制著骨骼肌發(fā)育的各個階段。成肌調(diào)節(jié)因子（MRFs）家族是一類對骨骼肌發(fā)育至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，包括MYF5、MYOD、肌原蛋白（Myogenin）和MRF4等。MYF5和MYOD主要在成肌細(xì)胞的決定和增殖階段發(fā)揮作用，它們能夠激活一系列與成肌細(xì)胞分化相關(guān)的基因表達，促使肌祖細(xì)胞向成肌細(xì)胞分化。研究表明，在豬胚胎期骨骼肌發(fā)育過程中，MYF5和MYOD的表達水平呈現(xiàn)動態(tài)變化，在肌纖維形成的關(guān)鍵時期，它們的表達顯著上調(diào)，為肌纖維的形成奠定基礎(chǔ)。而Myogenin和MRF4則主要在成肌細(xì)胞的分化和融合階段起關(guān)鍵作用，它們能夠促進成肌細(xì)胞的融合，形成多核肌管，進而發(fā)育為成熟的肌纖維。在豬的出生后骨骼肌生長階段，Myogenin和MRF4的持續(xù)表達對于維持肌肉的正常生長和修復(fù)具有重要意義。肌生成抑制素（MSTN）是一種負(fù)調(diào)控骨骼肌生長的重要基因，它主要通過抑制成肌細(xì)胞的增殖和分化來調(diào)控骨骼肌的生長發(fā)育。MSTN基因的突變或缺失會導(dǎo)致骨骼肌的過度生長，肌肉量顯著增加。在一些雙肌性狀的豬品種中，就發(fā)現(xiàn)了MSTN基因的自然突變，這些突變使得MSTN蛋白的功能喪失或減弱，從而解除了對骨骼肌生長的抑制作用，導(dǎo)致豬的肌肉量明顯增加。相反，當(dāng)MSTN基因過表達時，會抑制成肌細(xì)胞的增殖和分化，使骨骼肌生長受阻，肌肉量減少。這表明MSTN在豬骨骼肌生長發(fā)育過程中起著重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，維持著骨骼肌生長的平衡。除了上述基因外，還有許多其他基因也參與了豬骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控。例如，PAX3和PAX7基因在肌衛(wèi)星細(xì)胞的維持和激活中發(fā)揮著重要作用，它們能夠調(diào)控肌衛(wèi)星細(xì)胞的自我更新和分化能力，確保在肌肉生長和修復(fù)過程中有足夠的肌衛(wèi)星細(xì)胞參與。IGF-1基因編碼的胰島素樣生長因子-1，能夠促進成肌細(xì)胞的增殖和分化，刺激肌肉蛋白質(zhì)的合成，對豬骨骼肌的生長具有重要的促進作用。在豬的生長過程中，IGF-1的表達水平與骨骼肌的生長速度密切相關(guān)，高表達的IGF-1能夠顯著促進骨骼肌的生長和發(fā)育。2.2.2信號通路信號通路在豬骨骼肌生長發(fā)育過程中扮演著關(guān)鍵角色，它們?nèi)缤?xì)胞內(nèi)的信號傳遞使者，將外界刺激和細(xì)胞內(nèi)的基因表達調(diào)控緊密聯(lián)系起來，精確地調(diào)節(jié)著細(xì)胞的增殖、分化和蛋白質(zhì)合成等重要生物學(xué)過程。PI3K/Akt/mTOR信號通路是一條在細(xì)胞生長和代謝調(diào)控中發(fā)揮核心作用的信號通路。當(dāng)細(xì)胞受到生長因子（如胰島素樣生長因子IGF-1等）的刺激時，受體酪氨酸激酶被激活，進而招募并激活PI3K。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，能夠招募并激活蛋白激酶B（Akt）?；罨腁kt進一步激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），mTOR通過調(diào)節(jié)下游的核糖體蛋白S6激酶（S6K）和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）等，促進蛋白質(zhì)的合成，從而促進骨骼肌細(xì)胞的生長和增殖。研究發(fā)現(xiàn)，在豬骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)實驗中，添加IGF-1能夠顯著激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進細(xì)胞的增殖和蛋白質(zhì)合成，使細(xì)胞的生長速度明顯加快；而使用該信號通路的抑制劑（如LY294002抑制PI3K，雷帕霉素抑制mTOR），則會抑制細(xì)胞的增殖和蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細(xì)胞生長受阻。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路也是調(diào)控豬骨骼肌生長發(fā)育的重要信號通路之一，它主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條途徑。在豬骨骼肌生長發(fā)育過程中，ERK信號通路主要參與細(xì)胞增殖的調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞受到生長因子或其他刺激時，ERK被激活，進而磷酸化一系列下游底物，如轉(zhuǎn)錄因子Elk-1等，促進細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達，推動細(xì)胞進入增殖周期，促進成肌細(xì)胞的增殖。JNK信號通路在骨骼肌細(xì)胞的分化和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在成肌細(xì)胞分化過程中，JNK的激活能夠促進肌源性轉(zhuǎn)錄因子的表達，如MyoD和Myogenin等，從而促進成肌細(xì)胞的分化和肌纖維的形成。p38MAPK信號通路則主要參與細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)和分化調(diào)控。在骨骼肌受到損傷或應(yīng)激時，p38MAPK被激活，它可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，促進細(xì)胞的修復(fù)和再生；在成肌細(xì)胞分化過程中，p38MAPK也參與了肌源性轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，對肌纖維的形成和成熟具有重要影響。Wnt信號通路在豬骨骼肌胚胎發(fā)育過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。Wnt信號通路可分為經(jīng)典Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路和非經(jīng)典Wnt信號通路。在經(jīng)典Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路中，當(dāng)Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，會抑制β-連環(huán)蛋白的降解，使β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中積累并進入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活下游靶基因的表達，如Myf5、MyoD等，從而促進肌祖細(xì)胞的增殖和分化。在豬胚胎期骨骼肌發(fā)育的早期階段，經(jīng)典Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路處于活躍狀態(tài)，對肌纖維的形成和發(fā)育至關(guān)重要。非經(jīng)典Wnt信號通路則通過其他途徑，如平面細(xì)胞極性通路和Wnt/Ca2+通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、極性和分化等過程，也在豬骨骼肌發(fā)育中發(fā)揮著不可或缺的作用。2.2.3外部因素外部因素對豬骨骼肌生長發(fā)育有著顯著的影響，這些因素主要包括營養(yǎng)物質(zhì)和激素等，它們通過與豬體內(nèi)的生理調(diào)節(jié)機制相互作用，共同塑造了骨骼肌的生長發(fā)育進程。營養(yǎng)物質(zhì)是豬骨骼肌生長發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)，充足且均衡的營養(yǎng)供應(yīng)對于維持骨骼肌的正常生長和功能至關(guān)重要。蛋白質(zhì)作為骨骼肌生長的主要原料，其攝入量和質(zhì)量直接影響著肌肉的生長和修復(fù)。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，其中必需氨基酸（如賴氨酸、蛋氨酸等）對于豬骨骼肌生長發(fā)育尤為關(guān)鍵。研究表明，在豬的日糧中添加適量的賴氨酸和蛋氨酸，能夠顯著提高豬的生長速度和瘦肉率，促進骨骼肌的生長和發(fā)育。這是因為賴氨酸和蛋氨酸參與了蛋白質(zhì)的合成過程，為肌肉的生長提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。同時，它們還可以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達和信號通路的活性，進一步促進骨骼肌細(xì)胞的增殖和分化。碳水化合物和脂肪是豬生長過程中的重要能量來源，為骨骼肌的生長發(fā)育提供必要的能量支持。當(dāng)豬攝入足夠的碳水化合物和脂肪時，體內(nèi)的能量代謝處于平衡狀態(tài)，能夠保證骨骼肌細(xì)胞的正常生理功能和生長需求。如果碳水化合物或脂肪供應(yīng)不足，豬會動用體內(nèi)的蛋白質(zhì)來提供能量，從而影響骨骼肌的生長和發(fā)育，導(dǎo)致肌肉量減少、生長速度減慢。維生素和礦物質(zhì)在豬骨骼肌生長發(fā)育中也發(fā)揮著不可或缺的作用。維生素D能夠促進鈣的吸收和利用，對骨骼和骨骼肌的發(fā)育具有重要影響。缺乏維生素D會導(dǎo)致鈣吸收不良，影響骨骼和骨骼肌的正常發(fā)育，使豬出現(xiàn)生長遲緩、骨骼畸形等問題。礦物質(zhì)如鈣、磷、鋅等對于維持骨骼肌的正常結(jié)構(gòu)和功能也至關(guān)重要。鈣和磷是骨骼和牙齒的主要組成成分，同時也參與了肌肉的收縮和舒張過程；鋅則是許多酶的組成成分，參與了蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖和分化等生理過程，對豬骨骼肌的生長發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。激素作為體內(nèi)的化學(xué)信使，對豬骨骼肌生長發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用。生長激素（GH）是由垂體前葉分泌的一種重要激素，它能夠促進蛋白質(zhì)合成，增加肌肉細(xì)胞的體積和數(shù)量，從而促進豬骨骼肌的生長。生長激素通過與肝臟和骨骼肌細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的信號通路，促進胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的合成和釋放。IGF-1作為生長激素發(fā)揮作用的重要介質(zhì)，能夠直接作用于骨骼肌細(xì)胞，促進細(xì)胞的增殖和分化，刺激肌肉蛋白質(zhì)的合成，進而促進骨骼肌的生長。研究發(fā)現(xiàn)，給生長遲緩的豬注射生長激素，能夠顯著提高其血液中IGF-1的水平，促進骨骼肌的生長和發(fā)育，使豬的生長速度明顯加快。胰島素也是調(diào)節(jié)豬骨骼肌生長發(fā)育的重要激素之一。胰島素能夠促進葡萄糖的攝取和利用，為骨骼肌細(xì)胞提供能量，同時還可以促進蛋白質(zhì)合成，抑制蛋白質(zhì)降解，對骨骼肌的生長和修復(fù)具有重要作用。在豬的生長過程中，胰島素通過與骨骼肌細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因的表達，增加肌肉蛋白質(zhì)的含量，從而促進骨骼肌的生長和發(fā)育。三、microRNA-21的生物學(xué)特性與功能基礎(chǔ)3.1microRNA-21的結(jié)構(gòu)與生成MicroRNA-21（miR-21）是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在生物體內(nèi)發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。深入了解miR-21的結(jié)構(gòu)與生成過程，對于揭示其在基因表達調(diào)控中的機制具有重要意義。miR-21的編碼基因位于人類17號染色體的17q23.2區(qū)域，具體定位于跨膜蛋白49（TMEM49）基因的內(nèi)含子區(qū)域。這一特殊的基因定位暗示著miR-21的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能與TMEM49基因存在一定的關(guān)聯(lián)，雖然二者的具體關(guān)系尚不完全明確，但已有研究表明，基因的內(nèi)含子區(qū)域往往包含著重要的順式作用元件，可能參與調(diào)控miR-21的轉(zhuǎn)錄起始、速率以及轉(zhuǎn)錄后的加工等過程。從結(jié)構(gòu)上看，成熟的miR-21是一條長度約為22個核苷酸的單鏈RNA分子。其核苷酸序列在不同物種間具有高度的保守性，這種保守性從進化的角度反映了miR-21在生物體內(nèi)功能的重要性和穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物中，如人類、小鼠和豬等，miR-21的序列相似度極高，僅存在個別核苷酸的差異。這種高度保守的序列特征使得miR-21能夠在不同物種中識別并結(jié)合相似的靶mRNA序列，從而發(fā)揮相似的生物學(xué)功能，確保了生物體內(nèi)基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的相對穩(wěn)定性。miR-21的生成是一個復(fù)雜而精細(xì)的過程，涉及多個步驟和多種酶的參與，主要可分為細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)兩個階段。在細(xì)胞核內(nèi)，miR-21基因首先在RNA聚合酶II的作用下轉(zhuǎn)錄生成初級轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-21）。pri-miR-21是一種長度可達數(shù)百至數(shù)千個核苷酸的長鏈RNA分子，它不僅包含了miR-21的編碼序列，還含有5'端帽子結(jié)構(gòu)和3'端多聚腺苷酸（polyA）尾巴，以及1到數(shù)個發(fā)夾狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)特征對于pri-miR-21的穩(wěn)定性、加工以及轉(zhuǎn)運等過程具有重要意義。隨后，pri-miR-21在核酸酶Drosha及其輔助因子Pasha（也稱為DGCR8）組成的復(fù)合體作用下進行剪切加工。Drosha是一種III型核糖核酸酶，它能夠識別pri-miR-21的發(fā)夾狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并在特定位置進行切割，將pri-miR-21剪切成長度約為70-90個核苷酸的帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體（pre-miR-21）。pre-miR-21為單一發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其5'端帶有磷酸基團，3'端有兩個突出堿基，并帶有3'羥基，這些結(jié)構(gòu)特點是pre-miR-21的典型特征，也是其后續(xù)加工和轉(zhuǎn)運的重要識別標(biāo)志。在pre-miR-21生成后，它需要從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)中，才能進行下一步的加工和成熟過程。這一轉(zhuǎn)運過程主要由Ran-GTP依賴的核輸出蛋白Exportin-5負(fù)責(zé)。Exportin-5能夠特異性地識別pre-miR-21的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并與pre-miR-21形成復(fù)合物，在Ran-GTP的作用下，將pre-miR-21從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)。一旦進入細(xì)胞質(zhì)，pre-miR-21便會在另一種III型核糖核酸酶Dicer的作用下進行進一步的剪切。Dicer能夠識別pre-miR-21的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并將其切割成約22個核苷酸長度的雙鏈miRNA，其中一條鏈即為成熟的miR-21，另一條鏈則通常被降解。成熟的miR-21會迅速與相關(guān)的蛋白結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。在RISC中，miR-21通過其種子序列（通常為5'端的2-8個核苷酸）與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）進行堿基互補配對，從而實現(xiàn)對靶基因表達的調(diào)控作用。這種調(diào)控作用主要通過兩種方式實現(xiàn)：當(dāng)miR-21與靶mRNA的堿基配對完全互補時，RISC會介導(dǎo)靶mRNA的降解；當(dāng)miR-21與靶mRNA的堿基配對不完全互補時，RISC則主要抑制靶mRNA的翻譯過程，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行負(fù)調(diào)控。3.2microRNA-21的作用機制MicroRNA-21（miR-21）作為一種重要的非編碼RNA，其作用機制主要是通過與靶mRNA的相互作用，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行負(fù)調(diào)控。這種調(diào)控作用廣泛影響著細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程，在豬骨骼肌生長發(fā)育以及疾病發(fā)生發(fā)展等方面都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。miR-21發(fā)揮調(diào)控作用的核心步驟是與靶mRNA的識別與結(jié)合。miR-21通過其種子序列（通常為5'端的2-8個核苷酸）與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）進行堿基互補配對，從而實現(xiàn)兩者的特異性結(jié)合。這種堿基互補配對并非要求完全匹配，而是具有一定的靈活性，只要種子序列與靶mRNA的相應(yīng)區(qū)域能夠精確配對，即可啟動后續(xù)的調(diào)控過程。研究表明，miR-21的種子序列在進化上高度保守，這為其在不同物種中穩(wěn)定地識別并結(jié)合相似的靶mRNA提供了保障。例如，在人類和小鼠中，miR-21的種子序列幾乎完全一致，這使得它能夠在這兩個物種中靶向作用于相同或相似的基因，發(fā)揮相似的生物學(xué)功能。通過生物信息學(xué)預(yù)測和實驗驗證，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了眾多miR-21的靶基因，這些靶基因涉及細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝等多個生物學(xué)過程，充分體現(xiàn)了miR-21調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的廣泛性和復(fù)雜性。當(dāng)miR-21與靶mRNA結(jié)合后，主要通過兩種方式對基因表達進行調(diào)控：mRNA降解和翻譯抑制。當(dāng)miR-21與靶mRNA的堿基配對完全互補時，miR-21會引導(dǎo)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）對靶mRNA進行切割，從而導(dǎo)致靶mRNA的降解。在這一過程中，RISC中的核酸酶會識別并切斷靶mRNA與miR-21互補配對區(qū)域的磷酸二酯鍵，使靶mRNA斷裂成片段，進而被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶進一步降解，無法進行正常的翻譯過程。這種mRNA降解機制能夠快速、有效地降低靶基因的表達水平，對細(xì)胞內(nèi)的基因表達調(diào)控起到了重要的“剎車”作用。在大多數(shù)情況下，miR-21與靶mRNA的堿基配對并非完全互補，此時miR-21主要通過抑制靶mRNA的翻譯過程來調(diào)控基因表達。具體來說，miR-21與靶mRNA結(jié)合后，會阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，或者干擾核糖體在mRNA上的移動，從而抑制蛋白質(zhì)的合成。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可以通過與翻譯起始因子、核糖體蛋白等相互作用，改變它們的構(gòu)象或功能，進而影響翻譯起始復(fù)合物的形成和翻譯過程的進行。此外，miR-21還可能通過影響mRNA的穩(wěn)定性，間接抑制翻譯過程。例如，miR-21可以促使mRNA的3'端polyA尾巴縮短，使其更容易被核酸酶降解，從而降低mRNA的半衰期，減少蛋白質(zhì)的合成。miR-21在豬骨骼肌生長發(fā)育過程中的調(diào)控作用也與上述作用機制密切相關(guān)。在豬骨骼肌細(xì)胞的增殖階段，miR-21可能通過靶向作用于某些抑制細(xì)胞增殖的基因，如PTEN（磷酸酶和張力蛋白同源物）等，抑制其表達，從而促進細(xì)胞的增殖。PTEN是一種重要的抑癌基因，它能夠通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，負(fù)向調(diào)控細(xì)胞的增殖和生長。研究表明，miR-21可以與PTENmRNA的3'UTR互補配對，抑制PTEN的翻譯過程，使PTEN蛋白表達水平降低，進而解除對PI3K/Akt/mTOR信號通路的抑制，促進豬骨骼肌細(xì)胞的增殖。在豬骨骼肌細(xì)胞的分化階段，miR-21可能通過靶向作用于一些抑制肌肉分化的基因，如HDAC4（組蛋白去乙?；?）等，促進肌肉分化相關(guān)基因的表達，從而推動骨骼肌細(xì)胞的分化。HDAC4能夠抑制MyoD等肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子的活性，阻礙骨骼肌細(xì)胞的分化。miR-21可以通過與HDAC4mRNA的3'UTR結(jié)合，抑制HDAC4的表達，解除其對MyoD等轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用，促進骨骼肌細(xì)胞的分化和肌纖維的形成。3.3microRNA-21在其他生物過程中的功能除了在豬骨骼肌生長發(fā)育過程中發(fā)揮潛在作用外，MicroRNA-21（miR-21）在其他生物過程中也展現(xiàn)出廣泛而重要的功能，對細(xì)胞的增殖、凋亡、腫瘤發(fā)生和心血管疾病等方面都有著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在細(xì)胞增殖方面，miR-21被證實能夠促進多種細(xì)胞類型的增殖。在腫瘤細(xì)胞中，miR-21通過靶向作用于多個關(guān)鍵基因，如PTEN等，解除對細(xì)胞增殖的抑制，從而促進腫瘤細(xì)胞的快速增殖。PTEN是一種重要的抑癌基因，它能夠負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制細(xì)胞的增殖和生長。研究表明，miR-21可以與PTENmRNA的3'UTR互補配對，抑制PTEN的翻譯過程，使PTEN蛋白表達水平降低，進而激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進腫瘤細(xì)胞的增殖。在成纖維細(xì)胞中，miR-21也能夠通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，促進細(xì)胞的增殖。在心肌梗死后的心臟重塑過程中，上調(diào)的miR-21可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β信號通路中Smad7的表達，促進成纖維細(xì)胞的增殖和分化，進而調(diào)節(jié)心梗后的心臟重塑。miR-21在細(xì)胞凋亡過程中扮演著重要角色，其通常發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。在腫瘤細(xì)胞中，miR-21通過抑制程序性細(xì)胞死亡4（PDCD4）等促凋亡基因的表達，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避機體的免疫監(jiān)視和清除，從而促進腫瘤的發(fā)展。PDCD4是一種重要的腫瘤抑制因子，它能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，促進細(xì)胞凋亡。miR-21可以與PDCD4mRNA的3'UTR結(jié)合，抑制PDCD4的表達，從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。在神經(jīng)細(xì)胞中，miR-21也參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控。在腦缺血再灌注損傷模型中，miR-21的表達上調(diào)，通過抑制靶基因Bim的表達，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，對腦組織起到一定的保護作用。在腫瘤發(fā)生過程中，miR-21被廣泛認(rèn)為是一種致癌miRNA，其在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，并通過多種機制促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。除了上述通過靶向PTEN和PDCD4促進腫瘤細(xì)胞增殖和抑制凋亡外，miR-21還參與腫瘤血管生成過程。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，miR-21可以通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等相關(guān)基因的表達，促進腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和氧氣，從而支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，miR-21通過靶向抑制Sprouty2基因的表達，激活Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，上調(diào)VEGF的表達，促進腫瘤血管生成。miR-21還與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在肝癌細(xì)胞中，miR-21通過抑制E-cadherin等上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）抑制因子的表達，促進EMT過程，使肝癌細(xì)胞獲得更強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。心血管疾病方面，miR-21也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，參與心肌細(xì)胞的增殖、凋亡和纖維化等過程。在心肌梗死發(fā)生后，心肌組織中miR-21的表達明顯上調(diào)。一方面，miR-21通過促進成纖維細(xì)胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)心臟重塑過程。如前文所述，miR-21通過調(diào)節(jié)TGF-β信號通路中Smad7的表達，促進成纖維細(xì)胞增殖和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達，使成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，參與心肌梗死后的瘢痕形成和心臟結(jié)構(gòu)重塑。另一方面，miR-21在心肌細(xì)胞凋亡中也起著關(guān)鍵作用。在心肌缺血-再灌注損傷模型中，miR-21的過表達可以抑制心肌細(xì)胞的凋亡，減少心肌梗死面積，保護心臟功能。其機制可能是通過抑制靶基因如PDCD4等的表達，阻斷凋亡信號通路的激活，從而減少心肌細(xì)胞的凋亡。但在某些情況下，miR-21的過度表達也可能導(dǎo)致心肌纖維化等不良后果。長期的心肌纖維化會導(dǎo)致心肌僵硬度增加，心臟功能受損，最終發(fā)展為心力衰竭。研究表明，miR-21通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，促進心肌成纖維細(xì)胞的活化和膠原蛋白的合成，從而加重心肌纖維化。四、microRNA-21對豬骨骼肌生長發(fā)育調(diào)控的實驗研究4.1實驗材料與方法4.1.1實驗動物與樣本采集選用健康的長白豬作為實驗動物，長白豬是一種瘦肉型豬品種，具有生長速度快、瘦肉率高、肉質(zhì)優(yōu)良等特點，在豬肉生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，對其骨骼肌生長發(fā)育機制的研究具有重要的實踐意義。實驗選取不同發(fā)育階段的長白豬，包括胚胎期第35天（E35）、45天（E45）、60天（E60）、75天（E75）、90天（E90）的胎兒，每個時間點各6頭；出生后1天（D1）、7天（D7）、14天（D14）、21天（D21）、28天（D28）、60天（D60）、90天（D90）、120天（D120）的仔豬和育肥豬，每個時間點各8頭。在相應(yīng)的時間點，將實驗動物進行安樂死后，迅速采集背最長肌組織樣本。背最長肌是豬體中最大的骨骼肌之一，在豬的運動和生長過程中發(fā)揮著重要作用，且其生長發(fā)育特征具有代表性，常被用于豬骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)研究。采集的樣本立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的實驗分析。為確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，在樣本采集過程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，使用經(jīng)過消毒的器械進行采樣，避免樣本受到污染。同時，對每頭實驗動物的基本信息，如出生日期、體重、性別等進行詳細(xì)記錄，以便后續(xù)分析不同因素對實驗結(jié)果的影響。4.1.2主要實驗試劑與儀器實驗所需的主要試劑包括：RNA提取試劑TRIzol（Invitrogen公司），該試劑能夠高效、快速地從組織和細(xì)胞中提取總RNA，其主要原理是利用酚-氯仿的混合液對細(xì)胞進行裂解，使RNA釋放出來，并通過相分離將RNA與蛋白質(zhì)、DNA等其他生物大分子分離；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），用于將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，該試劑盒包含逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTP等必要成分，能夠在適宜的條件下將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴增提供模板；實時熒光定量PCR試劑盒（Roche公司），基于SYBRGreenI染料法，能夠在PCR擴增過程中實時監(jiān)測雙鏈DNA的合成量，從而實現(xiàn)對基因表達量的精確測定，SYBRGreenI染料能夠特異性地結(jié)合到雙鏈DNA的小溝區(qū)域，在游離狀態(tài)下發(fā)出微弱熒光，而與雙鏈DNA結(jié)合后熒光強度顯著增強，通過檢測熒光信號的變化即可實時監(jiān)測PCR擴增進程；引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，根據(jù)miR-21和內(nèi)參基因U6的序列設(shè)計特異性引物，引物的設(shè)計遵循堿基互補配對原則，同時考慮引物的長度、GC含量、Tm值等因素，以確保引物具有良好的特異性和擴增效率。實驗用到的主要儀器有：PCR儀（Bio-Rad公司），用于進行PCR擴增反應(yīng)，能夠精確控制反應(yīng)溫度和時間，實現(xiàn)DNA的指數(shù)級擴增；離心機（Eppendorf公司），用于樣本的離心分離，如在RNA提取過程中，通過高速離心實現(xiàn)相分離，將RNA與其他雜質(zhì)分離；實時熒光定量PCR儀（Roche公司），能夠?qū)崟r監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中的熒光信號變化，從而對基因表達量進行定量分析；核酸蛋白分析儀（ThermoScientific公司），用于檢測RNA的濃度和純度，通過測量RNA在260nm和280nm波長處的吸光值，計算RNA的濃度和A260/A280比值，以評估RNA的質(zhì)量；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳分離后，檢測和分析擴增產(chǎn)物的大小和純度，通過凝膠電泳將不同大小的DNA片段分離，然后利用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進行拍照和分析，觀察擴增產(chǎn)物的條帶情況，判斷擴增的特異性和有效性。4.1.3實驗方法RNA提取采用TRIzol試劑法。具體操作如下：取約100mg的背最長肌組織樣本，加入1mlTRIzol試劑，用組織勻漿器在冰上充分勻漿，使組織細(xì)胞完全裂解。將勻漿后的樣品室溫放置5分鐘，使其充分反應(yīng)。然后加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋，手動劇烈振蕩管體15秒，使溶液充分混合，15-30℃孵育2-3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘，此時混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相、中間層以及無色水相上層，RNA全部被分配于水相中。小心吸取水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后15-30℃孵育10分鐘，于4℃下12000rpm離心10分鐘，此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。移去上清液，每1mlTRIzol試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH?O配制），清洗RNA沉淀，混勻后4℃下7000rpm離心5分鐘。小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。最后加入適量無RNA酶的水，用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。cDNA合成使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。首先，在冰上配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積為20μl，包括5×PrimeScriptBuffer4μl、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl、OligodTPrimer（50μM）1μl、Random6mers（100μM）1μl、TotalRNA模板適量（根據(jù)RNA濃度調(diào)整，一般為1-2μg），用RNase-freedH?O補足至20μl。輕輕混勻后，6000rpm短暫離心，使反應(yīng)液聚集于管底。將反應(yīng)管置于PCR儀中，先70℃孵育10分鐘，然后立即冰浴2分鐘，使RNA模板變性并防止引物二聚體的形成。接著加入逆轉(zhuǎn)錄酶，37℃孵育60分鐘，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，85℃加熱5分鐘，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，得到的cDNA溶液保存于-20℃?zhèn)溆谩崟r熒光定量PCR采用Roche公司的實時熒光定量PCR試劑盒，基于SYBRGreenI染料法進行檢測。反應(yīng)體系為20μl，包括2×SYBRGreenIMaster10μl、上下游引物（10μM）各0.5μl、cDNA模板2μl，用ddH?O補足至20μl。引物序列如下：miR-21上游引物5'-CAGUCAUCAGUCUGAUAAGCUC-3'，下游引物5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；內(nèi)參基因U6上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，6000rpm短暫離心，使溶液聚集于管底。將反應(yīng)管放入實時熒光定量PCR儀中，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃5分鐘；變性95℃10秒，退火60℃30秒，延伸72℃30秒，共40個循環(huán)；熔解曲線分析從65℃到95℃，每升高0.5℃采集一次熒光信號。采用2^(-ΔΔCt)法計算miR-21的相對表達量，其中ΔCt=Ct(miR-21)-Ct(U6)，ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)，通過比較不同樣本間的ΔΔCt值，分析miR-21在豬不同發(fā)育階段骨骼肌中的表達差異。4.2microRNA-21在豬骨骼肌中的表達模式利用實時熒光定量PCR技術(shù)，對不同發(fā)育階段豬骨骼肌中MicroRNA-21的表達水平進行了精確測定。結(jié)果顯示，MicroRNA-21在豬胚胎期和出生后骨骼肌中均有表達，但其表達水平呈現(xiàn)出明顯的動態(tài)變化。在胚胎期，從E35到E90，MicroRNA-21的表達量整體呈上升趨勢。其中，在E35時，MicroRNA-21的表達水平相對較低，隨著胚胎發(fā)育的推進，其表達量逐漸增加。在E60到E75期間，MicroRNA-21的表達量出現(xiàn)了較為顯著的上升，這一時期正是豬骨骼肌肌纖維大量增殖和分化的關(guān)鍵階段，暗示著MicroRNA-21可能在這一過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，在其他物種的骨骼肌發(fā)育過程中，如小鼠，在肌纖維快速增殖和分化階段，也有類似的miRNA表達變化，進一步印證了MicroRNA-21與骨骼肌發(fā)育進程的密切關(guān)聯(lián)。出生后，MicroRNA-21的表達模式發(fā)生了明顯改變。在D1到D28階段，其表達量呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢。在D1時，MicroRNA-21的表達量相對較高，隨后在D7到D14期間逐漸下降，達到一個相對較低的水平，之后又在D21到D28期間逐漸上升。在D60到D120階段，MicroRNA-21的表達量維持在一個相對穩(wěn)定的水平，但仍高于D7到D14階段的表達量。這種出生后表達模式的變化可能與豬骨骼肌在不同生長階段的生理需求和細(xì)胞活動有關(guān)。在出生后的早期階段，豬骨骼肌主要進行快速的生長和重塑，此時細(xì)胞的增殖和分化活動較為活躍；而隨著生長發(fā)育的進行，骨骼肌逐漸進入相對穩(wěn)定的生長階段，細(xì)胞的代謝和功能維持成為主要任務(wù)，MicroRNA-21的表達變化可能正是為了適應(yīng)這些不同階段的生理需求。進一步分析不同部位骨骼肌中MicroRNA-21的表達差異，選取了背最長肌、股四頭肌和肱三頭肌等具有代表性的部位進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-21在這三個部位的骨骼肌中均有表達，但表達水平存在一定差異。在背最長肌中，MicroRNA-21的表達量相對較高；而在股四頭肌和肱三頭肌中，其表達量相對較低，且股四頭肌和肱三頭肌之間的表達差異不顯著。背最長肌作為豬體中最大的骨骼肌之一，在豬的運動和生長過程中承擔(dān)著重要的功能，其較高的MicroRNA-21表達量可能與其在生長發(fā)育過程中更為活躍的細(xì)胞增殖和分化活動有關(guān)，MicroRNA-21可能通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，促進背最長肌的生長和發(fā)育。4.3microRNA-21對豬骨骼肌細(xì)胞增殖與分化的影響4.3.1細(xì)胞實驗設(shè)計為深入探究MicroRNA-21對豬骨骼肌細(xì)胞增殖與分化的影響，本研究構(gòu)建了過表達或敲低MicroRNA-21的豬骨骼肌細(xì)胞模型。選用體外培養(yǎng)的原代豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞作為實驗對象，這些細(xì)胞具有自我更新和分化為成熟肌纖維的能力，是研究骨骼肌生長發(fā)育的理想模型。在構(gòu)建過表達MicroRNA-21的細(xì)胞模型時，采用化學(xué)合成的miR-21模擬物（mimics）進行轉(zhuǎn)染。miR-21mimics是一段與成熟miR-21序列相同的雙鏈RNA分子，能夠有效提高細(xì)胞內(nèi)miR-21的表達水平。轉(zhuǎn)染前，將豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至70%-80%融合時，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進行操作。具體步驟如下：將適量的miR-21mimics和Lipofectamine3000試劑分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，然后將兩者混合均勻，室溫孵育15-20分鐘，使miR-21mimics與Lipofectamine3000形成復(fù)合物。將復(fù)合物逐滴加入到含有細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后4-6小時，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。為確保轉(zhuǎn)染效果，設(shè)置了陰性對照（NC）組，轉(zhuǎn)染與miR-21mimics序列無關(guān)的陰性對照寡核苷酸（NCmimics），其轉(zhuǎn)染操作與miR-21mimics轉(zhuǎn)染一致。對于敲低MicroRNA-21的細(xì)胞模型構(gòu)建，使用化學(xué)合成的miR-21抑制劑（inhibitor）進行轉(zhuǎn)染。miR-21inhibitor是一段與成熟miR-21序列互補的單鏈RNA分子，能夠特異性地與細(xì)胞內(nèi)的miR-21結(jié)合，從而抑制miR-21的功能。轉(zhuǎn)染方法與miR-21mimics轉(zhuǎn)染類似，同樣將豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至合適密度后，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進行操作。將miR-21inhibitor和Lipofectamine3000試劑分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，混合均勻后室溫孵育，然后加入到含有細(xì)胞的6孔板中。轉(zhuǎn)染后4-6小時更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并設(shè)置陰性對照（NC）組，轉(zhuǎn)染與miR-21inhibitor序列無關(guān)的陰性對照寡核苷酸（NCinhibitor）。轉(zhuǎn)染后不同時間點（24小時、48小時、72小時），通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測細(xì)胞中miR-21的表達水平，以驗證轉(zhuǎn)染效果。提取細(xì)胞總RNA，按照前文所述的RNA提取和實時熒光定量PCR方法進行操作，分析miR-21的表達變化。若轉(zhuǎn)染miR-21mimics組的miR-21表達水平顯著高于陰性對照組，而轉(zhuǎn)染miR-21inhibitor組的miR-21表達水平顯著低于陰性對照組，則表明轉(zhuǎn)染成功，過表達或敲低MicroRNA-21的豬骨骼肌細(xì)胞模型構(gòu)建成功，可用于后續(xù)的細(xì)胞增殖與分化實驗研究。4.3.2檢測指標(biāo)與結(jié)果分析在成功構(gòu)建過表達或敲低MicroRNA-21的豬骨骼肌細(xì)胞模型后，對細(xì)胞增殖和分化相關(guān)指標(biāo)進行檢測，以深入分析MicroRNA-21對豬骨骼肌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。對于細(xì)胞增殖指標(biāo)的檢測，采用CCK-8法測定細(xì)胞活力。在轉(zhuǎn)染后24小時、48小時、72小時，將CCK-8試劑加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，每孔加入10μl，37℃孵育1-2小時。CCK-8試劑中的WST-8在電子耦合試劑1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-methoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye），其生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），通過比較不同組之間的OD值，評估細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示，過表達MicroRNA-21組的細(xì)胞在各時間點的OD值均顯著高于陰性對照組，表明過表達MicroRNA-21能夠促進豬骨骼肌細(xì)胞的增殖；而敲低MicroRNA-21組的細(xì)胞在各時間點的OD值均顯著低于陰性對照組，說明敲低MicroRNA-21會抑制豬骨骼肌細(xì)胞的增殖。通過EdU（5-ethynyl-2'-deoxyuridine）標(biāo)記實驗進一步檢測細(xì)胞的DNA合成能力，以驗證CCK-8實驗結(jié)果。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過程中替代胸腺嘧啶（T）摻入到新合成的DNA中。在轉(zhuǎn)染后48小時，向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入EdU工作液，使其終濃度為10μM，37℃孵育2小時。然后按照EdU檢測試劑盒的說明書進行操作，使用Click反應(yīng)將EdU與熒光染料Azide進行共價結(jié)合，從而對增殖細(xì)胞進行標(biāo)記。通過熒光顯微鏡觀察并拍照，統(tǒng)計EdU陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例。結(jié)果表明，過表達MicroRNA-21組的EdU陽性細(xì)胞比例顯著高于陰性對照組，而敲低MicroRNA-21組的EdU陽性細(xì)胞比例顯著低于陰性對照組，進一步證實了MicroRNA-21對豬骨骼肌細(xì)胞增殖具有促進作用。在細(xì)胞分化方面，檢測成肌分化相關(guān)基因的表達水平是評估細(xì)胞分化程度的重要指標(biāo)。采用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測轉(zhuǎn)染后不同時間點（24小時、48小時、72小時）細(xì)胞中MyoD、Myogenin、MyHC等成肌分化標(biāo)志基因的表達變化。提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行實時熒光定量PCR檢測。結(jié)果顯示，過表達MicroRNA-21組的MyoD、Myogenin、MyHC基因表達水平在各時間點均顯著高于陰性對照組，表明過表達MicroRNA-21能夠促進豬骨骼肌細(xì)胞的分化；而敲低MicroRNA-21組的這些基因表達水平在各時間點均顯著低于陰性對照組，說明敲低MicroRNA-21會抑制豬骨骼肌細(xì)胞的分化。通過免疫熒光染色法觀察成肌細(xì)胞的分化情況。在轉(zhuǎn)染后72小時，將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX-100透化，5%BSA封閉后，加入抗MyHC抗體孵育過夜，然后加入熒光標(biāo)記的二抗孵育1-2小時。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計MyHC陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例。結(jié)果顯示，過表達MicroRNA-21組的MyHC陽性細(xì)胞比例顯著高于陰性對照組，而敲低MicroRNA-21組的MyHC陽性細(xì)胞比例顯著低于陰性對照組，進一步驗證了MicroRNA-21對豬骨骼肌細(xì)胞分化的促進作用。4.4microRNA-21的靶基因驗證4.4.1靶基因預(yù)測為了深入探究MicroRNA-21對豬骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控機制，運用生物信息學(xué)方法預(yù)測其在豬骨骼肌中的潛在靶基因。常用的miRNA靶基因預(yù)測工具主要基于miRNA與靶mRNA之間的堿基互補配對原則，同時考慮種子序列的匹配、配對自由能以及靶位點的保守性等因素來進行預(yù)測。本研究選用了多個在靶基因預(yù)測領(lǐng)域廣泛應(yīng)用且具有較高準(zhǔn)確性和可靠性的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和工具，如TargetScan、miRanda和PicTar等。這些工具在算法和數(shù)據(jù)來源上各有特點，通過綜合使用它們，可以提高靶基因預(yù)測的準(zhǔn)確性和全面性。在使用TargetScan進行預(yù)測時，該工具主要基于種子序列的保守性和配對自由能等因素來識別潛在的靶基因。它通過對不同物種間的基因組序列進行比對，分析miRNA種子序列在不同物種中的保守性，以此來評估靶位點的可靠性。對于MicroRNA-21，TargetScan預(yù)測結(jié)果顯示，眾多基因可能是其潛在靶基因，其中包括一些在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用的基因。例如，預(yù)測結(jié)果提示PTEN（磷酸酶和張力蛋白同源物）基因可能是MicroRNA-21的靶基因。PTEN是一種重要的抑癌基因，在細(xì)胞生長、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控作用。它能夠通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，阻止細(xì)胞過度增殖，促進細(xì)胞凋亡。若PTEN基因受到MicroRNA-21的調(diào)控，可能會對豬骨骼肌細(xì)胞的增殖和凋亡產(chǎn)生重要影響，進而影響豬骨骼肌的生長發(fā)育。miRanda則主要依據(jù)miRNA與靶mRNA之間的堿基互補配對情況以及形成雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性來預(yù)測靶基因。它通過計算miRNA與靶mRNA結(jié)合時的自由能變化，評估二者結(jié)合的穩(wěn)定性，從而篩選出潛在的靶基因。利用miRanda對MicroRNA-21的靶基因進行預(yù)測，也得到了一系列可能的靶基因。其中，HDAC4（組蛋白去乙?；?）基因被預(yù)測為MicroRNA-21的潛在靶基因之一。HDAC4在骨骼肌細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著重要作用，它能夠抑制肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子的活性，阻礙骨骼肌細(xì)胞的分化。如果MicroRNA-21能夠靶向調(diào)控HDAC4基因的表達，那么可能會通過解除對肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子的抑制，促進豬骨骼肌細(xì)胞的分化，進而影響豬骨骼肌的發(fā)育進程。PicTar工具則綜合考慮了多個物種間的保守性、種子序列匹配以及靶位點的進化保守性等因素來進行靶基因預(yù)測。它通過構(gòu)建復(fù)雜的模型，對大量的基因組數(shù)據(jù)進行分析，從而更準(zhǔn)確地預(yù)測miRNA的靶基因。使用PicTar對MicroRNA-21的靶基因進行預(yù)測，同樣得到了許多潛在的靶基因。將這三個工具的預(yù)測結(jié)果進行整合分析，篩選出在多個工具預(yù)測結(jié)果中均出現(xiàn)的基因作為重點研究對象。通過這種綜合分析的方法，不僅提高了靶基因預(yù)測的準(zhǔn)確性，還能夠更全面地挖掘MicroRNA-21在豬骨骼肌生長發(fā)育過程中的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)的實驗驗證和機制研究提供了重要的線索和方向。4.4.2雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炘谕ㄟ^生物信息學(xué)方法預(yù)測出MicroRNA-21的潛在靶基因后，為了驗證MicroRNA-21與靶基因之間的靶向關(guān)系，進行了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?。該實驗的原理是利用熒光素酶作為報告基因，將靶基因?'非翻譯區(qū)（3'UTR）克隆到熒光素酶報告載體中，與MicroRNA-21共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。如果MicroRNA-21能夠與靶基因的3'UTR結(jié)合，就會影響熒光素酶的表達，從而通過檢測熒光素酶的活性來判斷二者之間是否存在靶向關(guān)系。首先，構(gòu)建含靶基因3'UTR的熒光素酶報告載體。以PTEN基因的3'UTR為例，通過PCR擴增技術(shù)，從豬基因組DNA中擴增出PTEN基因的3'UTR序列。根據(jù)PTEN基因的3'UTR序列設(shè)計特異性引物，引物兩端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點，以便后續(xù)將擴增產(chǎn)物克隆到熒光素酶報告載體中。PCR擴增反應(yīng)體系包括模板DNA、上下游引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液等。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴增結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，觀察是否得到預(yù)期大小的條帶。將擴增得到的PTEN基因3'UTR片段用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進行酶切，然后與同樣經(jīng)過酶切處理的熒光素酶報告載體pGL3-Basic進行連接。連接反應(yīng)使用T4DNA連接酶，在16℃條件下過夜反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍白斑篩選和菌落PCR鑒定，挑選出陽性克隆。將陽性克隆進行測序驗證，確保插入的PTEN基因3'UTR序列正確無誤。將構(gòu)建好的含PTEN基因3'UTR的熒光素酶報告載體與MicroRNA-21mimics或陰性對照NCmimics共轉(zhuǎn)染到豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前，將豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞生長至70%-80%融合時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進行操作，將熒光素酶報告載體和miRNAmimics分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，然后將兩者與Lipofectamine3000試劑混合均勻，室溫孵育15-20分鐘，使它們形成復(fù)合物。將復(fù)合物逐滴加入到含有細(xì)胞的24孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48小時，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega公司）檢測熒光素酶活性。具體操作步驟如下：吸去24孔板中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次；每孔加入100μl1×PassiveLysisBuffer，室溫振蕩15分鐘，使細(xì)胞充分裂解；將裂解液轉(zhuǎn)移到離心管中，12000rpm離心5分鐘，取上清液；將上清液加入到96孔板中，每孔加入10μlLuciferaseAssayReagentII，使用多功能酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶的活性；然后每孔加入10μlStop&Glo?Reagent，檢測海腎熒光素酶的活性。以海腎熒光素酶的活性作為內(nèi)參，對螢火蟲熒光素酶的活性進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計算相對熒光素酶活性。實驗設(shè)置了多個組，包括實驗組（共轉(zhuǎn)染含PTEN基因3'UTR的熒光素酶報告載體和MicroRNA-21mimics）、陰性對照組（共轉(zhuǎn)染含PTEN基因3'UTR的熒光素酶報告載體和NCmimics）以及空白對照組（只轉(zhuǎn)染熒光素酶報告載體）。結(jié)果顯示，實驗組的相對熒光素酶活性顯著低于陰性對照組和空白對照組，表明MicroRNA-21能夠與PTEN基因的3'UTR結(jié)合，抑制熒光素酶的表達，從而驗證了MicroRNA-21與PTEN基因之間存在靶向關(guān)系。4.4.3其他驗證方法除了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炌猓瑸榱诉M一步驗證MicroRNA-21與靶基因之間的靶向調(diào)控關(guān)系，還通過qRT-PCR和Westernblot檢測靶基因mRNA和蛋白表達水平。在qRT-PCR實驗中，首先提取過表達或敲低MicroRNA-21的豬骨骼肌細(xì)胞的總RNA，具體提取方法如前文所述。然后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說明書進行操作。以cDNA為模板，使用特異性引物進行qRT-PCR擴增。以PTEN基因和HDAC4基因作為靶基因進行檢測，PTEN基因的引物序列為：上游引物5'-CCCAGAGCTGAAGAAGAAGA-3'，下游引物5'-TCTGTGCTGGTGCTGATGTA-3'；HDAC4基因的引物序列為：上游引物5'-CAGCAGAAGGAGAGCAGAAA-3'，下游引物5'-CCAGCCTTGTCTTCCATCTT-3'。內(nèi)參基因選用GAPDH，其引物序列為：上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μl，包括2×SYBRGreenIMaster10μl、上下游引物（10μM）各0.5μl、cDNA模板2μl，用ddH?O補足至20μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40個循環(huán)；熔解曲線分析從65℃到95℃，每升高0.5℃采集一次熒光信號。采用2^(-ΔΔCt)法計算靶基因的相對表達量，其中ΔCt=Ct(靶基因)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)。結(jié)果顯示，在過表達MicroRNA-21的豬骨骼肌細(xì)胞中，PTEN基因和HDAC4基因的mRNA表達水平均顯著低于對照組；而在敲低MicroRNA-21的豬骨骼肌細(xì)胞中，PTEN基因和HDAC4基因的mRNA表達水平均顯著高于對照組。這表明MicroRNA-21能夠在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控PTEN基因和HDAC4基因的mRNA表達。通過Westernblot實驗檢測靶基因的蛋白表達水平，進一步驗證MicroRNA-21對靶基因的調(diào)控作用。提取過表達或敲低MicroRNA-21的豬骨骼肌細(xì)胞的總蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白樣品進入分離膠后，120V恒壓電泳至溴酚藍指示劑遷移至膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：250mA恒流轉(zhuǎn)膜90分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1小時，以阻斷非特異性結(jié)合。封閉后，將PVDF膜與一抗（兔抗PTEN抗體，1:1000稀釋；兔抗HDAC4抗體，1:1000稀釋；鼠抗GAPDH抗體，1:5000稀釋）在4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后與相應(yīng)的二抗（山羊抗兔IgG-HRP，1:5000稀釋；山羊抗鼠IgG-HRP，1:5000稀釋）在室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后使用化學(xué)發(fā)光試劑進行顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄結(jié)果。結(jié)果表明，在過表達MicroRNA-21的豬骨骼肌細(xì)胞中，PTEN蛋白和HDAC4蛋白的表達水平均顯著降低；而在敲低MicroRNA-21的豬骨骼肌細(xì)胞中，PTEN蛋白和HDAC4蛋白的表達水平均顯著升高。這與qRT-PCR的結(jié)果一致，進一步證實了MicroRNA-21能夠通過抑制靶基因的mRNA和蛋白表達，對豬骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因進行調(diào)控，從而影響豬骨骼肌細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程。五、microRNA-21調(diào)控豬骨骼肌生長發(fā)育的分子機制探討5.1參與的信號通路MicroRNA-21（miR-21）在豬骨骼肌生長發(fā)育過程中，通過靶向調(diào)控關(guān)鍵基因，深度參與了多條重要的信號通路，其中PI3K/Akt/mTOR信號通路是其發(fā)揮作用的核心途徑之一。PI3K/Akt/mTOR信號通路在細(xì)胞的生長、增殖、分化以及代謝等多種生物學(xué)過程中扮演著至關(guān)重要的角色，它猶如細(xì)胞內(nèi)的“總開關(guān)”，精準(zhǔn)地調(diào)控著細(xì)胞的命運和功能。在豬骨骼肌細(xì)胞中，miR-21通過靶向抑制PTEN基因的表達，激活了PI3K/Akt/mTOR信號通路。PTEN是一種重要的抑癌基因，同時也是PI3K/Akt/mTOR信號通路的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子。研究表明，miR-21能夠與PTENmRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）特異性結(jié)合，抑制PTEN的翻譯過程，從而降低PTEN蛋白的表達水平。當(dāng)PTEN表達受到抑制時，其對PI3K的抑制作用被解除，PI3K被激活，進而催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募并激活蛋白激酶B（Akt），使Akt發(fā)生磷酸化而活化?；罨腁kt進一步激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），mTOR通過調(diào)節(jié)下游的核糖體蛋白S6激酶（S6K）和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）等，促進蛋白質(zhì)的合成，為豬骨骼肌細(xì)胞的生長和增殖提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。在過表達miR-21的豬骨骼肌細(xì)胞中，PTEN蛋白表達顯著降低，PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平明顯升高，細(xì)胞的增殖能力顯著增強；而在敲低miR-21的細(xì)胞中，PTEN蛋白表達上調(diào)，PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平降低，細(xì)胞增殖受到抑制。這充分證明了miR-21通過靶向PTEN激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，對豬骨骼肌細(xì)胞增殖起到促進作用。在豬骨骼肌細(xì)胞分化過程中，miR-21同樣通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路發(fā)揮重要作用。隨著骨骼肌細(xì)胞分化的進行，miR-21的表達水平發(fā)生動態(tài)變化，它通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路中相關(guān)分子的活性，影響肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達和功能，從而促進成肌細(xì)胞的分化和肌纖維的形成。研究發(fā)現(xiàn)，在miR-21過表達的細(xì)胞中，PI3K/Akt/mTOR信號通路的持續(xù)激活能夠上調(diào)MyoD、Myogenin等肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達，促進成肌細(xì)胞向肌管的分化；而抑制該信號通路則會阻礙骨骼肌細(xì)胞的分化進程。這表明miR-21通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，為豬骨骼肌細(xì)胞的分化提供了必要的信號支持，促進了肌纖維的形成和成熟。除了PI3K/Akt/mTOR信號通路外，miR-21還可能參與其他信號通路的調(diào)控，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。MAPK信號通路包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條主要途徑，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及應(yīng)激反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，miR-21可以通過靶向作用于MAPK信號通路中的關(guān)鍵分子，如MAPK激酶（MKK）等，調(diào)節(jié)該信號通路的活性，進而影響豬骨骼肌細(xì)胞的生物學(xué)行為。在某些細(xì)胞模型中，miR-21的過表達能夠激活ERK信號通路，促進細(xì)胞的增殖；而在另一些情況下，miR-21可能通過調(diào)節(jié)JNK或p38MAPK信號通路，參與細(xì)胞的分化和應(yīng)激反應(yīng)。雖然目前關(guān)于miR-21在豬骨骼肌中對MAPK信號通路的具體調(diào)控機制尚未完全明確，但已有研究為進一步探索兩者之間的關(guān)系提供了重要線索，有望揭示miR-21在豬骨骼肌生長發(fā)育過程中更為復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。5.2與其他調(diào)控因子的相互作用在豬骨骼肌生長發(fā)育的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，MicroRNA-21（miR-21）并非孤立地發(fā)揮作用，而是與轉(zhuǎn)錄因子、其他miRNA等多種調(diào)控因子之間存在著廣泛而復(fù)雜的相互作用，這些相互作用共同構(gòu)建了一個精密的調(diào)控體系，精準(zhǔn)地調(diào)節(jié)著豬骨骼肌的生長發(fā)育進程。轉(zhuǎn)錄因子在基因表達調(diào)控中起著核心作用，它們能夠與DNA的特定序列結(jié)合，激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。miR-21與一些轉(zhuǎn)錄因子之間存在著協(xié)同或拮抗的調(diào)控關(guān)系，共同影響豬骨骼肌的生長發(fā)育。MyoD作為成肌調(diào)節(jié)因子家族的重要成員，是骨骼肌發(fā)育過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，MyoD可以通過與miR-21基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進miR-21的轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)miR-21的表達水平。在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞向成肌細(xì)胞分化的過程中，MyoD的表達逐漸升高，同時miR-21的表達也隨之增加。這種協(xié)同作用可能進一步促進了成肌細(xì)胞的分化和肌纖維的形成。一方面，MyoD通過激活一系列與肌肉分化相關(guān)的基因表達，為肌纖維的形成奠定基礎(chǔ)；另一方面，miR-21通過靶向抑制某些阻礙肌肉分化的基因，如HDAC4等，增強了MyoD