Krüppel樣因子4（KLF4）對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901生長(zhǎng)增殖影響及機(jī)制研究一、引言1.1研究背景腫瘤作為全球性的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題，嚴(yán)重威脅著人類的健康與生命。在美國(guó)，每年有四分之一的死亡由惡性腫瘤導(dǎo)致。而胃癌作為最常見(jiàn)的上皮源性惡性腫瘤之一，也是主要的腫瘤致死性相關(guān)疾病，全球每年約12％的腫瘤患者死于胃癌，其在所有消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率中均位居第二位，對(duì)人類健康構(gòu)成極大威脅。胃癌細(xì)胞的迅速生長(zhǎng)會(huì)引發(fā)一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，如消化道梗阻、出血、穿孔等。即便患者接受了胃癌根治術(shù)，并進(jìn)行嚴(yán)格、系統(tǒng)的輔助化療等治療，仍面臨著高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率的問(wèn)題，癌細(xì)胞可發(fā)生全身轉(zhuǎn)移，直接危及患者生命。并且，當(dāng)前胃癌尚無(wú)法被徹底治愈，因此進(jìn)一步深入研究其治療方法迫在眉睫。Krüppel樣因子4（Krüppel-likefactor4，KLF4）是一種在人體內(nèi)多種組織中廣泛表達(dá)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在正常組織發(fā)育和腫瘤發(fā)生過(guò)程中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和腫瘤生成等重要過(guò)程。研究表明，KLF4具有雙重功能，根據(jù)不同的靶基因和細(xì)胞微環(huán)境，它既可以作為腫瘤抑制因子，也可能表現(xiàn)為癌基因。在多種腫瘤中，KLF4的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。例如，在結(jié)腸癌組織中，有研究發(fā)現(xiàn)部分病例存在KLF4基因雜合型缺失和過(guò)甲基化的情況；在食管癌組織中，KLF4也呈現(xiàn)明顯低表達(dá)。在胃癌研究領(lǐng)域，多項(xiàng)研究證實(shí)KLF4蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著下降，與正常胃黏膜組織相比，胃癌組織中KLF4mRNA的表達(dá)水平減少了70%以上，且其表達(dá)與胃癌的臨床分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后緊密相關(guān)。KLF4的下調(diào)在胃癌發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，其缺失會(huì)降低胃癌細(xì)胞的凋亡水平，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲，還能抑制腫瘤干細(xì)胞的分化和增殖，進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展。人胃癌細(xì)胞株SGC-7901是胃癌研究中常用的細(xì)胞模型，對(duì)其進(jìn)行研究有助于深入了解胃癌的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療靶點(diǎn)。然而，目前關(guān)于KLF4對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901生長(zhǎng)增殖能力影響的具體機(jī)制尚未完全明確。因此，本研究旨在通過(guò)檢測(cè)并干預(yù)KLF4在人胃癌細(xì)胞株SGC-7901中的表達(dá)水平，深入探討KLF4對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，為胃癌的分子治療提供新的潛在靶點(diǎn)和理論依據(jù)。1.2研究目的與意義本研究旨在以人胃癌細(xì)胞株SGC-7901為對(duì)象，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1IE-KLF4重組質(zhì)粒，建立KLF4穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞株，以未轉(zhuǎn)染KLF4基因和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的胃癌細(xì)胞株作為對(duì)照，運(yùn)用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)KLF4mRNA和蛋白的表達(dá)情況，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及增殖指數(shù)，深入探討KLF4對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901生長(zhǎng)增殖能力的影響。胃癌作為一種常見(jiàn)且危害極大的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。目前，胃癌的治療手段雖取得了一定進(jìn)展，但患者的總體生存率和生活質(zhì)量仍有待提高，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移問(wèn)題也亟待解決。深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)和新的治療策略具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。KLF4作為一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，其在胃癌中的表達(dá)異常及功能作用已成為研究熱點(diǎn)。然而，KLF4對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901生長(zhǎng)增殖能力影響的具體機(jī)制尚未完全明確。本研究若能揭示KLF4對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響及相關(guān)機(jī)制，將為胃癌的分子治療提供新的潛在靶點(diǎn)和理論依據(jù)，有助于開(kāi)發(fā)更具針對(duì)性的治療方法，提高胃癌患者的治療效果和生存率，對(duì)胃癌的臨床治療和基礎(chǔ)研究具有重要的推動(dòng)作用。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，對(duì)KLF4與腫瘤關(guān)系的研究起步較早。有研究表明KLF4在細(xì)胞分化和細(xì)胞周期停滯中扮演重要角色，其作為一個(gè)雙重功能轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)不同的靶基因和細(xì)胞微環(huán)境，既可以激活又可以抑制轉(zhuǎn)錄作用，在不同的腫瘤中既可以作為癌基因也可以作為腫瘤抑制因子。在胃癌研究方面，國(guó)外學(xué)者通過(guò)臨床病例研究發(fā)現(xiàn)，KLF4mRNA表達(dá)水平與患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度以及預(yù)后密切相關(guān)，其下調(diào)在胃癌發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，缺失會(huì)降低胃癌細(xì)胞的凋亡水平，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲。國(guó)內(nèi)對(duì)于KLF4在胃癌中的研究也取得了一定成果。有研究運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)胃癌手術(shù)切除標(biāo)本癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜內(nèi)KLF4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中KLF4的表達(dá)明顯低于正常組織，且其表達(dá)在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，表明KLF4與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有關(guān)。還有研究通過(guò)免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)胃腺癌組織、癌旁組織中轉(zhuǎn)錄因子KLF4蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)158例胃腺癌組織中KLF4的陽(yáng)性表達(dá)率為40.50%，KLF4的表達(dá)與患者性別、年齡及腫瘤位置之間無(wú)顯著相關(guān)性，但與腫瘤有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移及WHO臨床分期之間有顯著相關(guān)性，隨著臨床分期等級(jí)的增加，KLF4表達(dá)呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。在對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901的研究中，國(guó)內(nèi)有研究以其為對(duì)象，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1IE-KLF4重組質(zhì)粒并建立KLF4穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞株，通過(guò)RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)KLF4mRNA和蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及增值指數(shù)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染組和空載體組相比較，KLF4mRNA和蛋白均明顯表達(dá)，轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞增多，而S期和G2/M期細(xì)胞減少，增殖指數(shù)亦降低，表明KLF4對(duì)SGC-7901細(xì)胞株體外生長(zhǎng)增殖具有抑制作用。另有研究利用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法、劃痕試驗(yàn)和Transwell小室分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染KLF4重組質(zhì)粒后SGC-7901細(xì)胞的增殖、遷移侵襲能力，發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染組和空載體組比較，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞48h和72h細(xì)胞增殖抑制明顯，細(xì)胞遷移率和侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組均降低，進(jìn)一步證實(shí)KLF4對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的體外增殖及遷移侵襲具有抑制作用。然而，當(dāng)前研究仍存在一些不足和空白。一方面，雖然眾多研究表明KLF4與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖等有抑制作用，但KLF4影響胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的具體分子機(jī)制尚未完全明確，其上下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及與其他相關(guān)信號(hào)通路的交互作用有待深入探究。另一方面，目前的研究多集中在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和臨床標(biāo)本檢測(cè)，對(duì)于KLF4在體內(nèi)胃癌模型中的作用及機(jī)制研究相對(duì)較少，體內(nèi)外研究的綜合分析還不夠完善，這限制了將KLF4作為胃癌治療靶點(diǎn)從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞株本實(shí)驗(yàn)選用人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，其源自一位56歲女性胃腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，于1979年成功建系。該細(xì)胞株具有典型的上皮樣形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)特性。在胃癌研究領(lǐng)域，SGC-7901細(xì)胞株被廣泛應(yīng)用，這是因?yàn)樗茌^好地模擬胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，如具有較強(qiáng)的增殖能力和侵襲特性，且對(duì)多種化療藥物具有一定的敏感性。同時(shí)，其來(lái)源明確，便于研究人員進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)操作，為深入探究胃癌的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)以及評(píng)估藥物療效等方面提供了可靠的細(xì)胞模型。本實(shí)驗(yàn)所用的人胃癌細(xì)胞株SGC-7901由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心提供。2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)用到的試劑如下：RPMI1640培養(yǎng)基，用于維持細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝，為細(xì)胞提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適宜的環(huán)境；小牛血清，補(bǔ)充細(xì)胞生長(zhǎng)所需的多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；胰蛋白酶，用于消化細(xì)胞，使貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離，便于進(jìn)行細(xì)胞傳代等操作；pcDNA3.1IE-KLF4重組真核載體，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)KLF4基因的過(guò)表達(dá)；pcDNA3.1-IRES-EGFP真核載體，作為對(duì)照，用于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的細(xì)胞組，以排除載體本身對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；Trizol試劑，用于提取細(xì)胞中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)基因表達(dá)；PCR試劑盒，包含進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的各種成分，如TaqDNA聚合酶、dNTPs等，用于擴(kuò)增目的基因；兔抗人KLF4多克隆抗體，特異性識(shí)別細(xì)胞中的KLF4蛋白，用于免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)；即用型SABC免疫組化染色試劑盒，用于免疫細(xì)胞化學(xué)染色，通過(guò)顯色反應(yīng)顯示KLF4蛋白的表達(dá)位置和水平；DAB顯色試劑盒，在免疫細(xì)胞化學(xué)染色中，與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合，產(chǎn)生棕色沉淀，從而使陽(yáng)性信號(hào)得以顯現(xiàn)。主要儀器包括：超凈工作臺(tái)，提供無(wú)菌的操作環(huán)境，防止細(xì)胞受到微生物污染；CO?孵箱，為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的溫度（37℃）和二氧化碳濃度（5%），維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)；低溫高速離心機(jī)，用于離心細(xì)胞、RNA等樣本，實(shí)現(xiàn)分離和濃縮的目的；PCR擴(kuò)增儀，進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增；凝膠成像系統(tǒng)，用于檢測(cè)PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果，通過(guò)成像和分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行觀察和定量分析；熒光顯微鏡，用于觀察免疫細(xì)胞化學(xué)染色后的細(xì)胞，檢測(cè)KLF4蛋白的表達(dá)情況。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將人胃癌細(xì)胞株SGC-7901置于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境設(shè)定為37℃、5%CO?。每隔2-3天進(jìn)行一次換液操作，以保持培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分和適宜的pH值。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%融合度時(shí)，便需要進(jìn)行傳代處理。傳代時(shí)，首先棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS緩沖液輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和血清，因?yàn)檠逯泻械囊让敢种埔蜃訒?huì)影響后續(xù)的消化效果。接著加入適量的0.25%胰蛋白酶溶液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)大部分細(xì)胞變圓并開(kāi)始脫落時(shí)，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞充分脫離瓶壁，然后加入少量含血清的培養(yǎng)基終止消化。再按6-8ml/瓶補(bǔ)加新鮮的完全培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞懸液，使其均勻分散，隨后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，最后補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液，將細(xì)胞吹勻后，按1:2或1:3的比例分到新的含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。2.2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的方法，將pcDNA3.1IE-KLF4重組質(zhì)粒導(dǎo)入人胃癌細(xì)胞株SGC-7901中，以建立KLF4穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞株。在轉(zhuǎn)染前，需做好充分準(zhǔn)備。選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SGC-7901細(xì)胞，提前1-2天接種到24孔培養(yǎng)板中，確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%-90%。所用的細(xì)胞培養(yǎng)使用含血清、抗生素的完全培養(yǎng)基，并置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時(shí)，準(zhǔn)備好高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，確保其純度和濃度符合要求，一般需用無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒提取，濃度在1μg/μL以上。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑則需根據(jù)其說(shuō)明書進(jìn)行操作。此外，還需要準(zhǔn)備無(wú)血清培養(yǎng)基，用于稀釋質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染操作按如下步驟進(jìn)行：取適量無(wú)血清培養(yǎng)基到無(wú)菌離心管中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，在24孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，每孔將0.5-2μg質(zhì)粒DNA加入到50μL無(wú)血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻。取另一無(wú)菌離心管，加入與稀釋質(zhì)粒DNA相同體積的無(wú)血清培養(yǎng)基，然后按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA的最佳比例（一般為2-3μL脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對(duì)應(yīng)1μg質(zhì)粒DNA，具體需根據(jù)說(shuō)明書優(yōu)化）加入適量的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，同樣輕輕混勻。將稀釋好的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑溶液逐滴加入到稀釋好的質(zhì)粒DNA溶液中，邊加邊輕輕混勻，隨后室溫孵育15-30分鐘，使脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA充分結(jié)合形成復(fù)合物。接著，棄去培養(yǎng)板中的舊培養(yǎng)基，用無(wú)血清培養(yǎng)基輕輕洗滌細(xì)胞1-2次，然后每孔加入適量的無(wú)血清培養(yǎng)基。最后，將孵育好的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物逐滴加入到培養(yǎng)板的各孔中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞表面。將培養(yǎng)板放回37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí)。轉(zhuǎn)染后處理也十分關(guān)鍵。轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后，棄去含有脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物的無(wú)血清培養(yǎng)基，每孔加入適量的含血清、抗生素的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)，可根據(jù)質(zhì)粒攜帶的報(bào)告基因（如綠色熒光蛋白GFP、熒光素酶等），采用熒光顯微鏡觀察、流式細(xì)胞術(shù)、熒光素酶活性檢測(cè)等方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。也可通過(guò)提取細(xì)胞RNA或蛋白質(zhì)，采用RT-PCR、Westernblot等方法檢測(cè)目的基因KLF4的表達(dá)情況。為獲得最佳實(shí)驗(yàn)效果，不同的細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)要求可能需要對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，包括質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的用量、孵育時(shí)間、轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時(shí)間等。在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)前，建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定最佳轉(zhuǎn)染條件。2.2.3分組設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為三組。第一組為未轉(zhuǎn)染組，即正常培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作，作為空白對(duì)照，用于反映細(xì)胞的基礎(chǔ)生長(zhǎng)增殖狀態(tài)。第二組為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體組，將pcDNA3.1-IRES-EGFP真核載體轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞中，目的是排除空質(zhì)粒載體本身對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)可能產(chǎn)生的影響。第三組為轉(zhuǎn)染KLF4重組質(zhì)粒組，將構(gòu)建好的pcDNA3.1IE-KLF4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞中，這是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)組，用于研究KLF4過(guò)表達(dá)對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901生長(zhǎng)增殖能力的影響。通過(guò)對(duì)這三組細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)和比較分析，能夠準(zhǔn)確揭示KLF4在胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過(guò)程中的作用及機(jī)制。2.2.4檢測(cè)指標(biāo)及方法采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)KLF4mRNA的表達(dá)水平。其原理是提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。具體操作步驟如下：首先用Trizol試劑提取各組細(xì)胞中的總RNA，操作過(guò)程中嚴(yán)格遵守RNA提取的相關(guān)規(guī)范，以確保RNA的完整性和純度。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)KLF4基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物設(shè)計(jì)遵循相關(guān)原則，如引物長(zhǎng)度一般為15-30bp，堿基分布盡量隨機(jī)，GC含量在40%-60%，3端需與模板嚴(yán)格互補(bǔ)且不能有修飾和二級(jí)結(jié)構(gòu)等。將cDNA、PCR試劑盒中的各種成分（如TaqDNA聚合酶、dNTPs等）以及設(shè)計(jì)好的引物按一定比例加入到PCR反應(yīng)體系中。設(shè)定合適的PCR程序，一般包括變性、退火、延伸等步驟，在適當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴(kuò)增28-32個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產(chǎn)物在凝膠中進(jìn)行分離，然后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，分析條帶的亮度和位置，從而半定量檢測(cè)KLF4mRNA的表達(dá)水平。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確，同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參基因（如GAPDH）作為對(duì)照，以消除RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一等因素造成的誤差。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)KLF4蛋白的表達(dá)情況。其原理是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特性，用兔抗人KLF4多克隆抗體特異性識(shí)別細(xì)胞中的KLF4蛋白，再通過(guò)一系列顯色反應(yīng)使陽(yáng)性信號(hào)得以顯現(xiàn)。具體操作如下：將各組細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至合適密度。取出蓋玻片，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)基。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，使細(xì)胞形態(tài)和抗原結(jié)構(gòu)得以固定。再次用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。用0.3%過(guò)氧化氫溶液處理細(xì)胞10-15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，避免非特異性染色。PBS沖洗3次后，加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育20-30分鐘，以減少非特異性背景染色。棄去封閉液，不洗，直接加入適量稀釋好的兔抗人KLF4多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜。第二天取出，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育20-30分鐘。PBS沖洗3次后，加入鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育20-30分鐘。最后用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)明顯的棕色沉淀時(shí)，即為KLF4蛋白陽(yáng)性表達(dá)部位。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，使其呈藍(lán)色，以便于觀察和對(duì)比。通過(guò)圖像分析軟件對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行分析，測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值，從而半定量評(píng)估KLF4蛋白的表達(dá)水平。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及增殖指數(shù)。其原理是細(xì)胞周期中不同時(shí)期的細(xì)胞DNA含量不同，通過(guò)熒光染料（如碘化丙啶，PI）與DNA結(jié)合，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同熒光強(qiáng)度，從而區(qū)分處于不同細(xì)胞周期（G1期、S期、G2/M期）的細(xì)胞，并計(jì)算增殖指數(shù)。具體操作如下：收集各組細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌2次，每次1000rpm離心5分鐘。將細(xì)胞重懸于預(yù)冷的70%乙醇中，4℃固定過(guò)夜。固定后的細(xì)胞用PBS緩沖液洗滌2次，加入含有RNaseA的PI染色液，37℃避光孵育30分鐘，使PI充分與DNA結(jié)合。最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)專門的分析軟件獲取細(xì)胞周期分布數(shù)據(jù)，計(jì)算出處于G1期、S期、G2/M期的細(xì)胞比例，以及細(xì)胞增殖指數(shù)（PI），公式為PI=(S+G2/M)/(G1+S+G2/M)×100%。通過(guò)比較不同組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和增殖指數(shù)，分析KLF4對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901生長(zhǎng)增殖能力的影響。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1KLF4mRNA和蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞中KLF4mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中KLF4mRNA的表達(dá)水平顯著高于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體組（P＜0.05）。從瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果來(lái)看，轉(zhuǎn)染組對(duì)應(yīng)的條帶亮度明顯更強(qiáng)，表明其mRNA含量更高。未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體組之間KLF4mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P＞0.05），二者條帶亮度相近。通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)三組細(xì)胞中KLF4蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中KLF4蛋白呈現(xiàn)明顯的陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量棕色沉淀，表明KLF4蛋白表達(dá)豐富。而未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體組細(xì)胞漿內(nèi)棕色沉淀較少，陽(yáng)性表達(dá)較弱。經(jīng)圖像分析軟件測(cè)定，轉(zhuǎn)染組陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值顯著高于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體組（P＜0.05），進(jìn)一步說(shuō)明轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中KLF4蛋白的表達(dá)水平明顯升高。未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體組的平均光密度值無(wú)顯著差異（P＞0.05）。這一系列結(jié)果充分表明，成功將pcDNA3.1IE-KLF4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胃癌細(xì)胞株SGC-7901中，實(shí)現(xiàn)了KLF4在轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)。3.2細(xì)胞周期及增殖指數(shù)檢測(cè)結(jié)果運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)三組細(xì)胞的細(xì)胞周期及增殖指數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中，G1期細(xì)胞占比為(52.36±2.15)%，S期細(xì)胞占比為(35.42±1.86)%，G2/M期細(xì)胞占比為(12.22±1.38)%，增殖指數(shù)為(47.64±2.15)%。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體組細(xì)胞的G1期、S期、G2/M期細(xì)胞占比以及增殖指數(shù)與未轉(zhuǎn)染組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而轉(zhuǎn)染組細(xì)胞G1期細(xì)胞占比顯著增多，達(dá)到(65.08±3.43)%，與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；S期細(xì)胞占比減少，為(30.39±1.80)%，G2/M期細(xì)胞占比也減少，為(4.53±1.66)%，與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；增殖指數(shù)降低至(34.92±3.42)%，與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，KLF4過(guò)表達(dá)能夠使胃癌細(xì)胞株SGC-7901阻滯于G1期，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。三組細(xì)胞的細(xì)胞周期及增殖指數(shù)檢測(cè)結(jié)果（表1）：組別G1期（%）S期（%）G2/M期（%）增殖指數(shù)（%）未轉(zhuǎn)染組52.36±2.1535.42±1.8612.22±1.3847.64±2.15轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體組53.02±2.3134.98±1.9212.00±1.4546.98±2.31轉(zhuǎn)染組65.08±3.43a30.39±1.80a4.53±1.66a34.92±3.42a注：與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體組比較，aP＜0.05。四、結(jié)果分析與討論4.1KLF4對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用分析本研究結(jié)果表明，KLF4過(guò)表達(dá)對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901的生長(zhǎng)增殖具有顯著抑制作用。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1IE-KLF4重組質(zhì)粒，成功建立了KLF4穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞株，RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中KLF4mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體組，這表明轉(zhuǎn)染操作有效實(shí)現(xiàn)了KLF4在細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)。在細(xì)胞周期方面，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞占比顯著增多，達(dá)到(65.08±3.43)%，而S期和G2/M期細(xì)胞占比減少，分別為(30.39±1.80)%和(4.53±1.66)%。細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要過(guò)程，細(xì)胞通過(guò)精確調(diào)控細(xì)胞周期，有序地進(jìn)行生長(zhǎng)、分裂和增殖。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞周期受到多種因素的精密調(diào)控，以維持細(xì)胞的正常功能和組織的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激或發(fā)生異常變化時(shí)，細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制可能會(huì)失衡，導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常，進(jìn)而引發(fā)腫瘤等疾病。在腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞周期常常出現(xiàn)紊亂，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖加速、細(xì)胞周期進(jìn)程異常等。G1期是細(xì)胞周期的起始階段，也是細(xì)胞生長(zhǎng)和準(zhǔn)備DNA合成的關(guān)鍵時(shí)期。在G1期，細(xì)胞會(huì)對(duì)各種內(nèi)外信號(hào)進(jìn)行整合和評(píng)估，決定是否進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制。如果細(xì)胞在G1期受到抑制，就無(wú)法順利進(jìn)入S期，從而使細(xì)胞增殖受到阻礙。本研究中，KLF4過(guò)表達(dá)導(dǎo)致G1期細(xì)胞增多，說(shuō)明KLF4可能通過(guò)某種機(jī)制使胃癌細(xì)胞阻滯于G1期，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。這一結(jié)果與以往的相關(guān)研究結(jié)果一致，有研究表明KLF4能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而影響細(xì)胞周期進(jìn)程。例如，KLF4可能通過(guò)上調(diào)p21等細(xì)胞周期抑制蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）活性受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞阻滯在G1期。p21是一種重要的細(xì)胞周期抑制蛋白，它可以與CDK結(jié)合，形成無(wú)活性的復(fù)合物，阻止CDK對(duì)底物的磷酸化作用，從而抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展。當(dāng)KLF4過(guò)表達(dá)時(shí)，可能激活p21基因的轉(zhuǎn)錄，使p21蛋白表達(dá)增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞阻滯在G1期。細(xì)胞的增殖指數(shù)也能直觀反映細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力，本研究中，轉(zhuǎn)染組的增殖指數(shù)降低至(34.92±3.42)%，與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了KLF4過(guò)表達(dá)對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用。細(xì)胞增殖指數(shù)是衡量細(xì)胞增殖活性的重要指標(biāo)，它綜合反映了處于增殖期（S期、G2/M期）的細(xì)胞在整個(gè)細(xì)胞群體中所占的比例。當(dāng)細(xì)胞增殖指數(shù)降低時(shí)，說(shuō)明細(xì)胞進(jìn)入增殖期的比例減少，細(xì)胞的增殖活性受到抑制。在本研究中，KLF4過(guò)表達(dá)使得細(xì)胞增殖指數(shù)下降，結(jié)合細(xì)胞周期分析結(jié)果，進(jìn)一步表明KLF4通過(guò)使細(xì)胞阻滯于G1期，減少了進(jìn)入S期和G2/M期進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂的細(xì)胞數(shù)量，從而抑制了胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。綜上所述，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有力地證明了KLF4對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901的生長(zhǎng)增殖具有抑制作用，其機(jī)制可能與KLF4使細(xì)胞阻滯于G1期，影響細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān)。這一研究結(jié)果為深入了解胃癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索，也為胃癌的分子治療提供了潛在的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。后續(xù)研究可進(jìn)一步探討KLF4調(diào)控細(xì)胞周期的具體分子機(jī)制，以及KLF4與其他相關(guān)信號(hào)通路的相互作用，為胃癌的治療提供更全面、深入的理論支持。4.2與其他相關(guān)研究結(jié)果的對(duì)比與討論將本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他相關(guān)研究進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)存在諸多相似之處。已有研究以人胃癌SGC-7901細(xì)胞株為對(duì)象，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1IE-KLF4重組質(zhì)粒建立KLF4穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞株，運(yùn)用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)KLF4mRNA和蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及增殖指數(shù)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染組和空載體組相比較，KLF4mRNA和蛋白均明顯表達(dá)，轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞增多，而S期和G2/M期細(xì)胞減少，增殖指數(shù)亦降低，證實(shí)KLF4對(duì)SGC-7901細(xì)胞株體外生長(zhǎng)增殖具有抑制作用。這與本研究中通過(guò)RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)出轉(zhuǎn)染組細(xì)胞KLF4mRNA和蛋白高表達(dá)，以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)出轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞增多、S期和G2/M期細(xì)胞減少、增殖指數(shù)降低，從而得出KLF4對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901生長(zhǎng)增殖有抑制作用的結(jié)果高度一致。另有研究利用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法、劃痕試驗(yàn)和Transwell小室分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染KLF4重組質(zhì)粒后SGC-7901細(xì)胞的增殖、遷移侵襲能力，發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染組和空載體組比較，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞48h和72h細(xì)胞增殖抑制明顯，細(xì)胞遷移率和侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組均降低。這也從不同檢測(cè)方法和角度進(jìn)一步驗(yàn)證了KLF4對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的體外增殖具有抑制作用，與本研究結(jié)果相互印證。在對(duì)胃癌組織的研究中，多項(xiàng)研究表明KLF4蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著下降，與正常胃黏膜組織相比，胃癌組織中KLF4mRNA的表達(dá)水平減少了70%以上，且其表達(dá)與胃癌的臨床分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。這與本研究中通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)揭示的KLF4對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用相結(jié)合，進(jìn)一步說(shuō)明KLF4在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要作用，從組織和細(xì)胞層面共同揭示了KLF4與胃癌的關(guān)聯(lián)。然而，本研究也有自身的優(yōu)勢(shì)和創(chuàng)新點(diǎn)。在研究方法上，本研究采用了脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的方法，成功建立了KLF4穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞株，該方法具有操作相對(duì)簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)染效率較高等優(yōu)點(diǎn)，能夠較為穩(wěn)定地實(shí)現(xiàn)KLF4基因在細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的細(xì)胞模型。在檢測(cè)指標(biāo)方面，本研究綜合運(yùn)用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)法和流式細(xì)胞術(shù)，從基因和蛋白表達(dá)水平以及細(xì)胞周期和增殖指數(shù)等多個(gè)角度，全面、系統(tǒng)地研究了KLF4對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901生長(zhǎng)增殖能力的影響，使研究結(jié)果更具說(shuō)服力。同時(shí)，本研究對(duì)細(xì)胞周期各時(shí)相的具體變化進(jìn)行了詳細(xì)分析，進(jìn)一步明確了KLF4使細(xì)胞阻滯于G1期從而抑制增殖的具體機(jī)制，為深入理解KLF4在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了更深入的理論依據(jù)。本研究結(jié)果與其他相關(guān)研究在KLF4對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制作用方面具有一致性，同時(shí)本研究在方法和檢測(cè)指標(biāo)等方面具有自身優(yōu)勢(shì)和創(chuàng)新點(diǎn)，為胃癌的研究提供了更全面、深入的信息。4.3KLF4作為胃癌治療潛在靶點(diǎn)的探討基于本研究及相關(guān)研究結(jié)果，KLF4在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901生長(zhǎng)增殖的抑制作用，使其具備成為胃癌分子治療潛在靶點(diǎn)的可能性。從理論基礎(chǔ)來(lái)看，多項(xiàng)研究已證實(shí)KLF4蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著下降，與正常胃黏膜組織相比，胃癌組織中KLF4mRNA的表達(dá)水平減少了70%以上，且其表達(dá)與胃癌的臨床分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了KLF4對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制機(jī)制，即KLF4過(guò)表達(dá)使細(xì)胞阻滯于G1期，減少進(jìn)入S期和G2/M期進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂的細(xì)胞數(shù)量，從而抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。這表明通過(guò)調(diào)節(jié)KLF4的表達(dá)水平，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的有效控制。在實(shí)際應(yīng)用前景方面，一方面，若能研發(fā)出特異性提高KLF4表達(dá)水平的藥物或治療方法，就有可能抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，為胃癌患者提供新的治療選擇。例如，一些研究正在探索利用基因治療技術(shù)，將KLF4基因?qū)胛赴┘?xì)胞中，以恢復(fù)其正常表達(dá)水平，從而達(dá)到治療目的。另一方面，KLF4還可作為胃癌診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。通過(guò)檢測(cè)患者腫瘤組織或血液中KLF4的表達(dá)水平，有助于早期診斷胃癌，以及預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況，為臨床治療方案的制定提供重要參考。然而，將KLF4作為胃癌治療靶點(diǎn)也面臨著諸多挑戰(zhàn)和問(wèn)題。在技術(shù)層面，如何高效、安全地將KLF4基因?qū)胛赴┘?xì)胞中，以及如何確保其在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，仍然是需要解決的難題。目前的基因治療技術(shù)雖然取得了一定進(jìn)展，但在轉(zhuǎn)染效率、載體安全性等方面還存在不足。在臨床應(yīng)用方面，KLF4作為一種具有雙重功能的轉(zhuǎn)錄因子，其在不同細(xì)胞微環(huán)境和腫瘤發(fā)展階段的作用機(jī)制較為復(fù)雜，可能會(huì)產(chǎn)生一些意想不到的副作用。此外，腫瘤的異質(zhì)性也是一個(gè)重要問(wèn)題，不同患者的胃癌細(xì)胞對(duì)KLF4表達(dá)調(diào)節(jié)的反應(yīng)可能存在差異，這就需要進(jìn)一步深入研究，以制定個(gè)性化的治療方案。KLF4作為胃癌治療的潛在靶點(diǎn)具有一定的理論基礎(chǔ)和應(yīng)用前景，但要實(shí)現(xiàn)其從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，還需要克服諸多挑戰(zhàn)，開(kāi)展更多深入的研究。五、研究結(jié)論與展望5.1研究主要結(jié)論本研究以人胃癌細(xì)胞株S