AFP調(diào)控的攜Mn-SOD溶瘤腺病毒：肝癌細胞殺傷新策略探究一、引言1.1研究背景肝癌作為全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計，在2018年中國有39萬多人新發(fā)肝癌，位于新發(fā)惡性腫瘤的第三位，同年有36萬多人死于肝癌，死亡人數(shù)也居惡性腫瘤第三位，且全世界47%的肝癌發(fā)生在中國。肝癌的高發(fā)病率和死亡率與其惡性程度高、預(yù)后差的特點密切相關(guān)，在中國，它是第2位的腫瘤死亡原因。目前，肝癌的治療方法多種多樣，包括手術(shù)切除、肝動脈栓塞、放射植入、化療、放療等傳統(tǒng)手段，以及新興的生物治療、靶向治療等。手術(shù)切除作為早期肝癌的首選治療方法，要求患者的腫瘤體積較小，病變局限于一葉或半肝，肝功能代償尚好，無腹水、黃疸，病變部位遠離血管、神經(jīng)且未發(fā)生轉(zhuǎn)移，肝硬化程度較輕。然而，肝癌患者多并發(fā)肝硬化，符合手術(shù)指征的患者較少，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高?；煶Ｓ盟幬锇╟ddp、5fu、阿霉素（adm）及其衍生物、絲裂霉素、vp16和氨甲喋呤等，多采用肝動脈給藥和（或）栓塞，并配合內(nèi)、外放射治療，適用于晚期肝癌無手術(shù)指征的患者，但具備所有化療的共同缺點，如消化道反應(yīng)、骨髓抑制、免疫抑制、毒性作用等。放療常配合化療使用，使用前提是對腫瘤的準確定位，同樣存在疲勞、皮膚干燥、免疫抑制、骨髓抑制、消化道反應(yīng)等副作用。中醫(yī)治療基本治則為軟堅散結(jié)，在增強體質(zhì)、延長壽命、緩解癥狀方面效果較理想，適用面廣，但其對于腫瘤的抑制作用不及放化療等西醫(yī)手段迅速。這些傳統(tǒng)治療方法雖在一定程度上能夠緩解病情，但由于存在易轉(zhuǎn)移、擴散和腫瘤不能根治等缺點，總體療效遠未如人意，無法滿足臨床需求，因此迫切需要尋找針對肝癌的新型治療方法。溶瘤腺病毒作為一種新興的癌癥治療策略，為肝癌治療帶來了新的希望。它是一類能直接感染腫瘤細胞并選擇性地繁殖和殺傷腫瘤細胞的病毒，具有低毒性和較高的治療效果。其作用機制主要是利用腫瘤細胞的內(nèi)部基因突變或代謝重編程選擇性地感染腫瘤細胞，然后在腫瘤細胞中復(fù)制殺死靶細胞，或通過刺激免疫系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)間接殺死腫瘤。例如，通過刪除或插入各種基因來構(gòu)建腫瘤選擇性復(fù)制的溶瘤腺病毒，像ONYX-015這種典型的工程腺病毒，利用基因編輯技術(shù)刪除E1B基因，使E1B蛋白無法形成，工程病毒只能在p53分裂細胞（如HCC細胞）中復(fù)制。然而，目前使用溶瘤腺病毒治療肝癌的效果并不理想，仍存在諸多問題，如病毒對腫瘤細胞的靶向性不夠精準，在正常細胞中也可能存在一定的復(fù)制和感染，導(dǎo)致副作用的產(chǎn)生；病毒在腫瘤細胞內(nèi)的復(fù)制效率有待提高，影響其對腫瘤細胞的殺傷能力；此外，機體的免疫反應(yīng)對病毒的清除作用也限制了其療效的發(fā)揮。因此，深入探究溶瘤腺病毒治療肝癌的分子機制，提高其治療效果，成為當前研究的重點和熱點。在肝癌細胞中，甲胎蛋白（AFP）和錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）發(fā)揮著重要作用，為溶瘤腺病毒治療肝癌的優(yōu)化提供了新的方向。AFP是一種胎兒肝臟合成的糖蛋白，在成年人體內(nèi)一般不表達，但在肝癌等某些腫瘤中，其表達水平會顯著升高。這一特性使得AFP可作為肝癌細胞的表面標志物，用作溶瘤腺病毒載體的靶向因子。通過將AFP基因啟動子及截短了的AFP基因增強子順序作為調(diào)控元件，調(diào)控腺病毒復(fù)制所需的早期基因E1A表達，能夠構(gòu)建出肝癌選擇性復(fù)制型腺病毒載體，提高溶瘤腺病毒對肝癌細胞的靶向性和選擇性。Mn-SOD是一種抗氧化酶，能夠清除細胞內(nèi)過量產(chǎn)生且有害的超氧陰離子，從而維護細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，對于細胞的生長和生命活動至關(guān)重要。近年來，越來越多的證據(jù)表明，通過調(diào)控Mn-SOD表達和活性，可對肝癌產(chǎn)生抑制作用。將Mn-SOD基因嵌入溶瘤腺病毒基因組中，使其在腫瘤細胞內(nèi)表達，有望增強溶瘤腺病毒對肝癌細胞的殺傷效果，同時減輕氧化應(yīng)激對正常細胞的損傷。綜上所述，本研究旨在構(gòu)建攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒，并通過AFP表達的靶向策略，深入探究其對肝癌細胞的殺傷作用及其分子機制，為肝癌的治療提供新的思路和方法，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在構(gòu)建一種攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒，并通過AFP表達的靶向策略，深入探究其對肝癌細胞的殺傷作用及其分子機制。具體而言，首先利用基因工程技術(shù)，將Mn-SOD基因嵌入溶瘤腺病毒基因組中，確保其在腫瘤細胞內(nèi)能夠穩(wěn)定表達。然后，通過一系列體外實驗，觀察該溶瘤腺病毒對肝癌細胞的生長抑制作用，并與普通溶瘤腺病毒進行對比，評估其在治療肝癌中的優(yōu)越性。進一步通過檢測相關(guān)蛋白表達的變化情況，深入探究攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒抑制肝癌細胞生長的分子機制，以及其與氧化應(yīng)激、細胞凋亡等生物學(xué)過程的關(guān)系。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。在理論方面，深入研究AFP調(diào)控的攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒對肝癌細胞的殺傷機制，有助于進一步揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，為肝癌的基礎(chǔ)研究提供新的思路和理論依據(jù)。同時，探究Mn-SOD在溶瘤腺病毒治療肝癌過程中的作用機制，也將豐富氧化應(yīng)激與腫瘤治療關(guān)系的研究內(nèi)容，拓展對腫瘤細胞生物學(xué)特性的認識。從臨床應(yīng)用角度來看，肝癌作為一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，目前的治療方法仍存在諸多局限性。本研究構(gòu)建的攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒，有望為肝癌的治療提供一種新的、更有效的治療策略。AFP的靶向策略可提高溶瘤腺病毒對肝癌細胞的特異性，減少對正常細胞的損傷，降低治療的副作用。Mn-SOD的引入則可能增強溶瘤腺病毒對肝癌細胞的殺傷效果，提高治療的成功率。這一研究成果若能成功轉(zhuǎn)化應(yīng)用，將為肝癌患者帶來新的希望，改善他們的預(yù)后和生活質(zhì)量，具有顯著的社會效益和經(jīng)濟效益。此外，本研究的方法和思路也可為其他腫瘤的基因治療研究提供借鑒和參考，推動整個腫瘤治療領(lǐng)域的發(fā)展。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1肝癌概述肝癌，作為一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病機制極為復(fù)雜，是多因素、多步驟相互作用的結(jié)果。大量研究表明，乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的慢性感染是誘發(fā)肝癌的主要病因之一。病毒持續(xù)感染導(dǎo)致肝臟慢性炎癥，進而引發(fā)肝細胞的損傷、修復(fù)與再生過程紊亂，增加了基因突變的風(fēng)險，最終促使肝癌的發(fā)生。在我國，約90%的肝癌患者存在乙型肝炎病毒感染的背景。長期大量飲酒也是肝癌的重要危險因素之一。酒精在肝臟代謝過程中產(chǎn)生的乙醛等有害物質(zhì)，會直接損傷肝細胞，引發(fā)脂肪變性、炎癥和纖維化，逐步發(fā)展為肝硬化，而肝硬化患者發(fā)生肝癌的風(fēng)險顯著增加。黃曲霉毒素的暴露也與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。黃曲霉毒素是一種由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的真菌毒素，具有極強的致癌性，尤其是黃曲霉毒素B1，它能夠與DNA結(jié)合，誘導(dǎo)基因突變，干擾細胞的正常代謝和增殖，從而促進肝癌的發(fā)生。遺傳因素在肝癌的發(fā)病中也起著一定作用。某些遺傳突變可能使個體對致癌因素更為敏感，增加了患肝癌的風(fēng)險。研究發(fā)現(xiàn)，一些家族性肝癌患者存在特定的基因突變，如CTNNB1、TP53等基因的突變，這些突變會影響細胞的信號傳導(dǎo)、增殖和凋亡等過程，導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。此外，代謝異常如非酒精性脂肪性肝病、糖尿病等也與肝癌的發(fā)生相關(guān)。非酒精性脂肪性肝病患者由于肝臟脂肪堆積，引發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，損傷肝細胞，增加肝癌的發(fā)病風(fēng)險。糖尿病患者體內(nèi)的高血糖環(huán)境和胰島素抵抗，可能促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，同時影響免疫系統(tǒng)的功能，降低機體對腫瘤的監(jiān)視和清除能力。從流行病學(xué)特征來看，肝癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率均居高不下。據(jù)統(tǒng)計，2020年全球新增肝癌病例約90.6萬例，死亡病例約83萬例。在我國，肝癌同樣是嚴重威脅人民健康的重大疾病，發(fā)病率和死亡率分別位居惡性腫瘤的第5位和第2位。肝癌的發(fā)病率存在明顯的地區(qū)差異，亞洲和非洲是高發(fā)地區(qū)，其中我國的肝癌病例數(shù)約占全球的50%以上。這種地區(qū)差異主要與乙肝病毒感染率、黃曲霉毒素暴露水平、生活方式和遺傳因素等有關(guān)。在我國，東南沿海地區(qū)的發(fā)病率相對較高，可能與該地區(qū)的氣候條件適宜黃曲霉生長，以及乙肝病毒的傳播較為廣泛有關(guān)。肝癌的發(fā)病還與年齡、性別等因素有關(guān)，男性的發(fā)病率明顯高于女性，約為女性的2-4倍。隨著年齡的增長，肝癌的發(fā)病率逐漸升高，40歲以上人群是肝癌的高發(fā)年齡段。目前，肝癌的治療手段眾多，但都存在一定的局限性。手術(shù)切除是早期肝癌的首選治療方法，對于腫瘤體積較小、病變局限、肝功能良好且無轉(zhuǎn)移的患者，手術(shù)切除有可能實現(xiàn)根治。然而，由于肝癌患者多合并肝硬化，肝臟儲備功能較差，許多患者在確診時已處于中晚期，無法進行手術(shù)切除。且手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率較高，5年復(fù)發(fā)率可達50%-70%，這主要是因為手術(shù)難以徹底清除所有癌細胞，殘留的癌細胞可能在術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。肝動脈栓塞化療（TACE）是中晚期肝癌的常用治療方法之一，通過將化療藥物和栓塞劑注入肝動脈，阻斷腫瘤的血供，同時使化療藥物在腫瘤局部高濃度聚集，從而達到殺傷腫瘤細胞的目的。但TACE治療也存在一些局限性，如對肝功能有一定損害，可能導(dǎo)致肝功能衰竭；部分患者對化療藥物耐藥，影響治療效果；多次TACE治療后，腫瘤可能會出現(xiàn)側(cè)支循環(huán)，降低治療的有效性。放療利用高能射線殺死腫瘤細胞，可用于無法手術(shù)切除或TACE治療效果不佳的患者。然而，放療在殺傷腫瘤細胞的同時，也會對周圍正常組織造成損傷，引發(fā)一系列副作用，如放射性肝炎、胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制等，限制了其臨床應(yīng)用?；熓褂眉毎拘运幬镆种颇[瘤細胞的增殖，但由于肝癌細胞對化療藥物的敏感性較低，且化療藥物缺乏特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時，也會對正常細胞造成損害，導(dǎo)致嚴重的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，患者的耐受性較差。此外，免疫治療、靶向治療等新興治療方法雖然在一定程度上提高了肝癌的治療效果，但也面臨著耐藥、療效有限等問題。因此，尋找更加有效的肝癌治療方法迫在眉睫。2.2溶瘤腺病毒2.2.1溶瘤腺病毒的原理溶瘤腺病毒作為一種極具潛力的腫瘤治療手段，其作用原理基于腫瘤細胞與正常細胞在生物學(xué)特性上的差異。腫瘤細胞由于發(fā)生了一系列的基因突變和信號通路的異常激活，使得其細胞周期調(diào)控、免疫監(jiān)視等機制出現(xiàn)缺陷。溶瘤腺病毒正是利用這些缺陷，實現(xiàn)對腫瘤細胞的特異性感染和殺傷。在正常細胞中，存在著完善的抗病毒防御機制。當病毒入侵時，細胞內(nèi)的模式識別受體（PRRs）能夠識別病毒的核酸或蛋白等病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），進而激活一系列的信號通路，如干擾素（IFN）信號通路。IFN信號通路的激活會誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，如蛋白激酶R（PKR）、2'-5'-寡腺苷酸合成酶（OAS）等。這些抗病毒蛋白能夠抑制病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而阻止病毒在正常細胞內(nèi)的增殖。例如，PKR能夠磷酸化真核起始因子2α（eIF2α），使其失活，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，阻斷病毒的復(fù)制。正常細胞的細胞周期調(diào)控機制也非常嚴格，細胞在進入S期進行DNA復(fù)制之前，會對自身的DNA損傷、染色體完整性等進行嚴格的檢查。如果發(fā)現(xiàn)異常，細胞會停滯在G1期或G2期，進行DNA修復(fù)或啟動細胞凋亡程序，以避免異常細胞的增殖。相比之下，腫瘤細胞由于基因突變等原因，其抗病毒防御機制和細胞周期調(diào)控機制存在缺陷。許多腫瘤細胞中p53基因發(fā)生突變或缺失，p53是一種重要的腫瘤抑制基因，它在細胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)和細胞凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當p53功能異常時，細胞無法正常感知和響應(yīng)DNA損傷，導(dǎo)致細胞周期紊亂，使得腫瘤細胞能夠持續(xù)增殖。腫瘤細胞中的IFN信號通路也常常受到抑制，導(dǎo)致其抗病毒能力下降。這使得溶瘤腺病毒能夠在腫瘤細胞中逃脫抗病毒防御機制的限制，實現(xiàn)特異性的感染和復(fù)制。溶瘤腺病毒感染腫瘤細胞后，利用腫瘤細胞內(nèi)的各種物質(zhì)和能量，進行大量的復(fù)制。隨著病毒的不斷復(fù)制，腫瘤細胞內(nèi)的病毒數(shù)量逐漸增多，最終導(dǎo)致腫瘤細胞的裂解死亡。腫瘤細胞裂解后，釋放出的子代病毒又可以繼續(xù)感染周圍的腫瘤細胞，形成一個級聯(lián)放大的殺傷過程。溶瘤腺病毒還能夠激活機體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤細胞裂解后，會釋放出腫瘤相關(guān)抗原（TAAs），這些抗原能夠被抗原呈遞細胞（APCs）攝取、加工和呈遞，激活T淋巴細胞等免疫細胞?；罨腡淋巴細胞能夠特異性地識別和殺傷腫瘤細胞，從而進一步增強對腫瘤的殺傷效果。為了提高溶瘤腺病毒對腫瘤細胞的靶向性和殺傷效果，科研人員常常對腺病毒進行基因工程改造。通過刪除腺病毒基因組中某些與病毒在正常細胞中復(fù)制和生存相關(guān)的基因，如E1B基因，使得改造后的腺病毒只能在p53功能缺失的腫瘤細胞中復(fù)制，而在正常細胞中則無法復(fù)制，從而提高了溶瘤腺病毒的安全性。將腫瘤特異性啟動子如AFP啟動子、hTERT啟動子等，替換腺病毒原有啟動子，來調(diào)控病毒增殖必需基因的表達，使病毒能夠特異性地在腫瘤細胞中啟動復(fù)制過程。還可以在腺病毒基因組中插入一些具有治療作用的基因，如免疫調(diào)節(jié)因子基因、腫瘤抑制基因等，增強溶瘤腺病毒的治療效果。例如，插入白細胞介素-12（IL-12）基因，能夠增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)；插入腫瘤抑制基因p53，能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。2.2.2溶瘤腺病毒在肝癌治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀溶瘤腺病毒在肝癌治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢和潛力，成為近年來研究的熱點之一。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，多種溶瘤腺病毒被設(shè)計和構(gòu)建出來，并在臨床前和臨床試驗中進行了廣泛的研究。在臨床前研究中，大量的體外細胞實驗和動物模型實驗表明，溶瘤腺病毒能夠有效地感染和殺傷肝癌細胞。研究人員構(gòu)建了一種以AFP啟動子調(diào)控E1A基因表達的溶瘤腺病毒，在體外實驗中，該病毒能夠特異性地感染AFP陽性的肝癌細胞，并在細胞內(nèi)大量復(fù)制，導(dǎo)致肝癌細胞的裂解死亡。進一步的動物實驗顯示，將該溶瘤腺病毒注射到肝癌荷瘤小鼠體內(nèi)，能夠顯著抑制腫瘤的生長，延長小鼠的生存期。還有研究將攜帶免疫調(diào)節(jié)因子如GM-CSF（粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子）的溶瘤腺病毒用于肝癌治療，發(fā)現(xiàn)其不僅能夠直接殺傷肝癌細胞，還能激活機體的免疫系統(tǒng)，增強對腫瘤的免疫監(jiān)視和殺傷能力。在肝癌荷瘤小鼠模型中，注射攜帶GM-CSF的溶瘤腺病毒后，小鼠腫瘤組織中浸潤的免疫細胞如CD8+T細胞、NK細胞等數(shù)量明顯增加，腫瘤生長受到明顯抑制。在臨床試驗方面，溶瘤腺病毒也取得了一定的成果。一些溶瘤腺病毒產(chǎn)品已經(jīng)進入臨床試驗階段，并顯示出了一定的安全性和有效性。例如，上海三維生物技術(shù)有限公司研發(fā)的重組人5型腺病毒注射液（H101），是全球首個上市的溶瘤腺病毒產(chǎn)品。H101通過刪除E1B55Kda基因片段，使其在p53功能正常的細胞中無法復(fù)制，而在p53基因缺失或突變的腫瘤細胞中能夠大量復(fù)制并發(fā)揮溶瘤作用。在一項針對晚期鼻咽癌的Ⅲ期臨床試驗中，H101聯(lián)合順鉑和5-氟尿嘧啶化療方案，相較于單純化療，顯著提高了患者的客觀緩解率和生存率。雖然H101主要用于鼻咽癌的治療，但也有一些研究探索了其在肝癌治療中的應(yīng)用。在一些小規(guī)模的臨床試驗中，將H101瘤內(nèi)注射或肝動脈注射用于肝癌患者，結(jié)果顯示部分患者的腫瘤得到了一定程度的控制，且安全性較好。然而，也有研究指出，單獨使用H101治療肝癌的效果有限，可能需要與其他治療方法聯(lián)合使用，以提高療效。盡管溶瘤腺病毒在肝癌治療中取得了一定進展，但目前仍存在一些問題亟待解決。溶瘤腺病毒對腫瘤細胞的靶向性仍有待提高。雖然通過基因工程改造，能夠使溶瘤腺病毒在一定程度上特異性地感染腫瘤細胞，但在實際應(yīng)用中，仍可能存在病毒感染正常細胞的情況，導(dǎo)致副作用的產(chǎn)生。例如，即使使用腫瘤特異性啟動子調(diào)控病毒復(fù)制，仍有部分正常細胞可能因為某些原因激活了啟動子，從而被病毒感染。病毒在腫瘤細胞內(nèi)的復(fù)制效率和傳播能力也需要進一步增強。腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，如腫瘤細胞的異質(zhì)性、缺氧、免疫抑制等因素，可能會影響溶瘤腺病毒在腫瘤組織中的擴散和復(fù)制，降低其治療效果。機體的免疫反應(yīng)對溶瘤腺病毒的清除作用也是一個重要問題。當溶瘤腺病毒進入體內(nèi)后，機體的免疫系統(tǒng)會識別并攻擊病毒，導(dǎo)致病毒在體內(nèi)的存活時間縮短，影響其對腫瘤細胞的持續(xù)殺傷作用。為了解決這些問題，研究人員正在不斷探索新的策略，如優(yōu)化病毒載體設(shè)計、聯(lián)合其他治療方法、調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)等。通過修飾腺病毒的外殼蛋白，改變其靶向性，提高對腫瘤細胞的感染效率；聯(lián)合免疫治療藥物，如免疫檢查點抑制劑，增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，提高溶瘤腺病毒的治療效果。2.3AFP與肝癌的關(guān)系甲胎蛋白（AFP）作為一種在胎兒發(fā)育過程中由肝臟和卵黃囊合成的糖蛋白，在維持胎兒正常生長發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常成年人中，AFP的表達水平極低，通常維持在較低的濃度范圍。然而，在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，AFP卻呈現(xiàn)出異常高表達的特征。大量臨床研究表明，約70%-90%的肝癌患者血清AFP水平顯著升高。這一現(xiàn)象與肝癌細胞的生物學(xué)特性密切相關(guān)。肝癌細胞由于發(fā)生了一系列的基因突變和表觀遺傳改變，導(dǎo)致AFP基因的表達調(diào)控機制出現(xiàn)異常。在肝癌細胞中，一些轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB、AP-1等，與AFP基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，激活A(yù)FP基因的轉(zhuǎn)錄，從而使得AFP的合成和分泌增加。一些信號通路如Wnt/β-catenin信號通路的異常激活，也會間接影響AFP基因的表達。在正常情況下，Wnt/β-catenin信號通路受到嚴格調(diào)控，β-catenin在細胞質(zhì)中被磷酸化并降解。但在肝癌細胞中，該信號通路異常激活，β-catenin進入細胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因的表達，其中就包括AFP基因。AFP在肝癌的診斷、監(jiān)測和治療等方面具有重要的臨床價值。在診斷方面，AFP是目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的肝癌腫瘤標志物之一。血清AFP水平的檢測對于肝癌的早期診斷具有重要意義。當血清AFP水平大于400μg/L，且持續(xù)升高，同時排除妊娠、活動性肝病、生殖腺胚胎源性腫瘤等其他可能導(dǎo)致AFP升高的因素時，結(jié)合影像學(xué)檢查如超聲、CT、MRI等，對肝癌的診斷具有較高的特異性和敏感性。在一項針對肝癌高危人群的篩查研究中，發(fā)現(xiàn)血清AFP檢測聯(lián)合超聲檢查，能夠早期發(fā)現(xiàn)肝癌，提高患者的生存率。AFP還可用于肝癌治療療效的監(jiān)測。在肝癌患者接受手術(shù)切除、化療、放療等治療后，定期檢測血清AFP水平，能夠反映治療的效果。如果治療有效，AFP水平通常會逐漸下降；若AFP水平持續(xù)升高或下降后又再次升高，則提示可能存在腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。在一項關(guān)于肝癌手術(shù)切除的研究中，術(shù)后監(jiān)測AFP水平發(fā)現(xiàn)，AFP持續(xù)正常的患者，其復(fù)發(fā)率明顯低于AFP升高的患者。由于AFP在肝癌細胞中高表達，使其成為肝癌治療的潛在靶點。以AFP為靶點的治療策略主要包括免疫治療和基因治療等。在免疫治療方面，研究人員開發(fā)了針對AFP的腫瘤疫苗，通過激發(fā)機體的免疫系統(tǒng)，使其能夠識別并攻擊表達AFP的肝癌細胞。一種AFP肽疫苗，在動物實驗和臨床試驗中都顯示出了一定的抗腫瘤效果，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的細胞免疫和體液免疫反應(yīng)，抑制肝癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移。基于AFP的免疫細胞治療也取得了一定的進展，如采用AFP特異性的T細胞過繼回輸治療肝癌患者，部分患者的病情得到了有效控制。在基因治療方面，利用AFP啟動子的特異性，構(gòu)建攜帶治療基因的載體，使其能夠在AFP陽性的肝癌細胞中特異性表達，從而實現(xiàn)對肝癌細胞的靶向治療。將AFP啟動子調(diào)控的溶瘤腺病毒用于肝癌治療，該病毒能夠在AFP陽性的肝癌細胞中特異性復(fù)制并發(fā)揮溶瘤作用，而在正常細胞中則無法復(fù)制，減少了對正常組織的損傷。2.4Mn-SOD的功能與作用機制Mn-SOD，作為超氧化物歧化酶家族中的重要成員，在細胞內(nèi)發(fā)揮著不可或缺的作用，其主要功能是催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧氣。超氧陰離子作為一種活性氧（ROS），是細胞有氧代謝過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。在正常生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)的線粒體呼吸鏈、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位會不斷產(chǎn)生超氧陰離子。雖然超氧陰離子在低濃度時可作為細胞內(nèi)的信號分子，參與細胞的增殖、分化等生理過程。但當細胞受到各種應(yīng)激刺激，如紫外線照射、化學(xué)物質(zhì)損傷、炎癥反應(yīng)等，超氧陰離子的產(chǎn)生會大量增加。過量的超氧陰離子具有極強的氧化活性，能夠攻擊細胞內(nèi)的各種生物大分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等。它可使蛋白質(zhì)的氨基酸殘基發(fā)生氧化修飾，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能改變，影響細胞內(nèi)各種酶的活性。在脂質(zhì)方面，超氧陰離子可引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使細胞膜的流動性和通透性發(fā)生改變，破壞細胞膜的完整性。對于核酸，超氧陰離子能導(dǎo)致DNA鏈的斷裂、堿基的氧化修飾等，進而影響基因的表達和細胞的正常功能。如果細胞內(nèi)的超氧陰離子不能及時被清除，會導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)的發(fā)生，對細胞造成嚴重的損傷，甚至引發(fā)細胞凋亡或壞死。Mn-SOD通過及時清除細胞內(nèi)過量的超氧陰離子，有效地維護了細胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，保障了細胞的正常生理功能。在細胞的能量代謝過程中，線粒體作為細胞的“能量工廠”，通過呼吸鏈進行氧化磷酸化產(chǎn)生ATP。但在這一過程中，電子傳遞鏈上的電子會偶爾泄漏，與氧氣結(jié)合生成超氧陰離子。Mn-SOD主要定位于線粒體基質(zhì)中，能夠迅速捕獲線粒體產(chǎn)生的超氧陰離子，將其轉(zhuǎn)化為過氧化氫。產(chǎn)生的過氧化氫可進一步被細胞內(nèi)的過氧化氫酶（CAT）或谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）催化分解為水和氧氣，從而徹底消除活性氧對細胞的潛在威脅。在細胞受到外界刺激時，如炎癥細胞因子的刺激，會激活細胞內(nèi)的NADPH氧化酶等酶系統(tǒng)，導(dǎo)致超氧陰離子的大量產(chǎn)生。此時，Mn-SOD會迅速響應(yīng)，通過其催化活性將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為相對穩(wěn)定的過氧化氫，減輕細胞的氧化損傷。Mn-SOD在抑制肝癌細胞生長方面具有重要的作用機制。研究表明，Mn-SOD的表達水平與肝癌細胞的增殖和侵襲能力密切相關(guān)。當Mn-SOD在肝癌細胞中高表達時，能夠顯著降低細胞內(nèi)的超氧陰離子水平，從而抑制肝癌細胞的增殖。這是因為超氧陰離子可激活細胞內(nèi)的一些增殖相關(guān)信號通路，如MAPK信號通路和PI3K/Akt信號通路。當超氧陰離子水平升高時，會使MAPK信號通路中的關(guān)鍵激酶如ERK1/2發(fā)生磷酸化激活，進而促進細胞周期相關(guān)蛋白的表達，推動細胞從G1期進入S期，加速細胞的增殖。而Mn-SOD降低超氧陰離子水平后，能夠抑制MAPK信號通路的激活，使細胞周期停滯在G1期，從而抑制肝癌細胞的增殖。PI3K/Akt信號通路也會受到超氧陰離子的激活，Akt的磷酸化可促進細胞的存活和增殖。Mn-SOD通過清除超氧陰離子，抑制PI3K/Akt信號通路的激活，減少抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，增加促凋亡蛋白Bax的表達，誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，從而抑制肝癌細胞的生長。Mn-SOD還能夠抑制肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，涉及細胞外基質(zhì)的降解、細胞的遷移和血管生成等多個環(huán)節(jié)。超氧陰離子可通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達，促進細胞外基質(zhì)的降解，為腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。Mn-SOD通過降低超氧陰離子水平，抑制MMPs的表達，減少細胞外基質(zhì)的降解，從而抑制肝癌細胞的侵襲能力。在腫瘤血管生成方面，超氧陰離子可促進血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達，刺激腫瘤血管的生成。Mn-SOD能夠抑制VEGF的表達，減少腫瘤血管的生成，阻斷腫瘤細胞獲取營養(yǎng)和氧氣的途徑，進而抑制肝癌細胞的轉(zhuǎn)移。三、攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒的構(gòu)建3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料細胞系：選用人胚腎293細胞（HEK293），其具有易于轉(zhuǎn)染和支持腺病毒復(fù)制的特點，常被用于腺病毒的包裝和擴增。人肝癌細胞系HepG2和Bel-7402，這兩種細胞系在肝癌研究中應(yīng)用廣泛，HepG2細胞具有較高的AFP表達水平，而Bel-7402細胞則在肝癌細胞生物學(xué)特性研究中具有重要價值，它們可用于后續(xù)對攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒的感染和殺傷實驗。病毒載體：選擇Ad5腺病毒載體及其衍生物作為基礎(chǔ)載體。Ad5腺病毒是一種被廣泛研究和應(yīng)用的腺病毒血清型，其基因組結(jié)構(gòu)和功能相對清楚，具有良好的基因承載能力和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。經(jīng)過改造的Ad5衍生物能夠更好地滿足溶瘤腺病毒的構(gòu)建需求，如通過缺失某些基因片段來增強其對腫瘤細胞的特異性，或通過修飾外殼蛋白來改變其靶向性。試劑：DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒等，這些試劑用于基因的切割、連接、擴增以及質(zhì)粒的提取和純化等操作。其中，DNA限制性內(nèi)切酶能夠識別特定的DNA序列并進行切割，為基因的重組提供基礎(chǔ)；T4DNA連接酶則用于連接切割后的DNA片段，實現(xiàn)基因的拼接。細胞培養(yǎng)基如DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基，以及胎牛血清、胰蛋白酶等細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑，用于細胞的培養(yǎng)和傳代。DMEM培養(yǎng)基富含多種營養(yǎng)成分，適合多種細胞的生長，RPMI-1640培養(yǎng)基則常用于培養(yǎng)懸浮細胞和一些特殊細胞系。胎牛血清為細胞提供生長所需的各種營養(yǎng)因子和生長因子，胰蛋白酶用于消化細胞，以便進行細胞的傳代和實驗操作。引物合成試劑用于合成針對Mn-SOD基因、AFP啟動子及相關(guān)病毒基因的引物，以便進行PCR擴增和基因驗證。引物的設(shè)計需要根據(jù)目標基因的序列進行，確保其特異性和有效性。儀器設(shè)備：PCR儀用于進行聚合酶鏈式反應(yīng)，實現(xiàn)基因的擴增；離心機用于細胞和核酸等物質(zhì)的分離和純化；凝膠電泳設(shè)備用于檢測DNA和蛋白質(zhì)的大小和純度；恒溫培養(yǎng)箱用于細胞的培養(yǎng)，提供適宜的溫度、濕度和氣體環(huán)境；超凈工作臺用于細胞和分子生物學(xué)實驗的無菌操作，防止雜菌污染。3.1.2基因工程技術(shù)構(gòu)建病毒的方法獲取Mn-SOD基因：從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取Mn-SOD基因的序列信息，根據(jù)其序列設(shè)計特異性引物。引物的設(shè)計遵循一定的原則，如引物長度一般在18-25個堿基之間，GC含量在40%-60%之間，避免引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)和引物二聚體的產(chǎn)生。以人cDNA文庫為模板，利用PCR技術(shù)擴增Mn-SOD基因。在PCR反應(yīng)體系中，加入模板cDNA、引物、dNTPs、DNA聚合酶和緩沖液等成分，經(jīng)過預(yù)變性、變性、退火、延伸等多個循環(huán)，實現(xiàn)Mn-SOD基因的擴增。將擴增得到的Mn-SOD基因片段進行凝膠電泳檢測，確定其大小和純度。通過凝膠回收試劑盒回收目的基因片段，去除PCR反應(yīng)中的雜質(zhì)和引物二聚體等。構(gòu)建重組質(zhì)粒：選擇合適的穿梭質(zhì)粒，如pShuttle系列質(zhì)粒。將回收的Mn-SOD基因片段和穿梭質(zhì)粒分別用相應(yīng)的DNA限制性內(nèi)切酶進行雙酶切。酶切反應(yīng)在適宜的緩沖液中進行，根據(jù)酶的特性設(shè)置合適的溫度和時間，確保酶切完全。酶切后的Mn-SOD基因片段和穿梭質(zhì)粒利用T4DNA連接酶進行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系中加入連接酶、ATP等成分，在一定溫度下反應(yīng)一段時間，使Mn-SOD基因片段插入到穿梭質(zhì)粒中，形成重組穿梭質(zhì)粒。將重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，如DH5α感受態(tài)細胞。通過熱激法或電轉(zhuǎn)化法等方法，使重組穿梭質(zhì)粒進入大腸桿菌細胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB平板上，進行篩選?？股氐倪x擇根據(jù)穿梭質(zhì)粒上攜帶的抗性基因確定，只有成功轉(zhuǎn)化了重組穿梭質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含有抗生素的平板上生長。挑取單菌落進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，利用PCR和酶切鑒定等方法，篩選出含有正確插入Mn-SOD基因的重組穿梭質(zhì)粒。同源重組與病毒包裝：將構(gòu)建好的重組穿梭質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒，如pAdEasy系列骨架質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)化到BJ5183感受態(tài)細胞中。在細胞內(nèi)，重組穿梭質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒通過同源重組的方式發(fā)生重組，形成重組腺病毒質(zhì)粒。將重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或電穿孔法等轉(zhuǎn)染技術(shù)，將重組腺病毒質(zhì)粒導(dǎo)入HEK293細胞。轉(zhuǎn)染后的HEK293細胞在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細胞的病變情況。隨著重組腺病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制和組裝，細胞會逐漸出現(xiàn)病變，如細胞變圓、脫落等。當細胞病變達到一定程度時，收集細胞培養(yǎng)上清液，其中含有大量的重組溶瘤腺病毒。通過多次凍融法或超速離心法等方法，對收集到的病毒上清液進行純化和濃縮，得到高滴度的攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒。3.2構(gòu)建過程在攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒的構(gòu)建過程中，將Mn-SOD基因嵌入溶瘤腺病毒基因組是關(guān)鍵步驟。首先，對獲取的Mn-SOD基因和選定的腺病毒載體進行酶切處理。根據(jù)Mn-SOD基因和腺病毒載體的序列特點，選擇合適的限制性內(nèi)切酶，如BamHI和EcoRI。將Mn-SOD基因和腺病毒載體分別置于含有相應(yīng)限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)體系中，在37℃恒溫條件下反應(yīng)2-3小時，使酶切反應(yīng)充分進行，確保Mn-SOD基因兩端和腺病毒載體的特定位置被準確切割，產(chǎn)生互補的粘性末端。酶切完成后，利用T4DNA連接酶將Mn-SOD基因與腺病毒載體進行連接。將經(jīng)過酶切的Mn-SOD基因片段和腺病毒載體片段混合于連接反應(yīng)體系中，加入T4DNA連接酶和ATP等成分，在16℃條件下連接過夜。T4DNA連接酶能夠催化Mn-SOD基因片段與腺病毒載體片段的粘性末端形成磷酸二酯鍵，從而實現(xiàn)兩者的連接，構(gòu)建出重組腺病毒載體。為了驗證病毒構(gòu)建是否成功，采用PCR技術(shù)對重組腺病毒載體進行初步鑒定。根據(jù)Mn-SOD基因的序列設(shè)計特異性引物，引物的5'端和3'端分別與Mn-SOD基因的兩端序列互補。以重組腺病毒載體為模板，在PCR反應(yīng)體系中加入引物、dNTPs、DNA聚合酶和緩沖液等成分。經(jīng)過預(yù)變性（95℃，5分鐘）、變性（95℃，30秒）、退火（根據(jù)引物Tm值設(shè)定，一般為55-65℃，30秒）、延伸（72℃，1-2分鐘，根據(jù)Mn-SOD基因長度確定）等30-35個循環(huán)，擴增出Mn-SOD基因片段。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，若在凝膠上出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，表明重組腺病毒載體中成功插入了Mn-SOD基因。進一步通過測序?qū)χ亟M腺病毒載體進行驗證。將經(jīng)過PCR初步鑒定為陽性的重組腺病毒載體送至專業(yè)的測序公司進行測序。測序結(jié)果與Mn-SOD基因的原始序列進行比對，若兩者完全一致，即表明Mn-SOD基因已準確無誤地嵌入溶瘤腺病毒基因組中，成功構(gòu)建了攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒。3.3病毒的鑒定與質(zhì)量控制對構(gòu)建成功的攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒進行全面的鑒定與嚴格的質(zhì)量控制，是確保后續(xù)實驗結(jié)果可靠性和有效性的關(guān)鍵。首先，運用PCR技術(shù)對病毒進行初步鑒定。根據(jù)Mn-SOD基因和腺病毒載體的特異性序列，設(shè)計兩對引物。其中一對引物針對Mn-SOD基因，上游引物序列為5'-ATGGCCTACGCCGCCGCCG-3'，下游引物序列為5'-TCACGCTCTTCGCTGCTGCT-3'；另一對引物針對腺病毒載體上的特定基因片段，如E1A基因，上游引物序列為5'-CCGAGTACGACCTGACGACG-3'，下游引物序列為5'-GTCGTCGTCGACGACGACGA-3'。以提取的病毒基因組DNA為模板，進行PCR擴增。在PCR反應(yīng)體系中，加入10×PCR緩沖液5μL、dNTPs（2.5mM）4μL、上下游引物（10μM）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL、模板DNA1μL，用ddH?O補足至50μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若在凝膠上出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，即Mn-SOD基因擴增產(chǎn)物約為600bp，E1A基因擴增產(chǎn)物約為400bp，則初步表明病毒中含有Mn-SOD基因且腺病毒載體結(jié)構(gòu)完整。為進一步驗證Mn-SOD及相關(guān)病毒蛋白的表達情況，采用Westernblot方法。將感染了攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒的肝癌細胞（如HepG2細胞）和未感染的對照細胞，在感染后48小時收集。用RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取30μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。分別加入抗Mn-SOD抗體（1:1000稀釋）、抗腺病毒E1A蛋白抗體（1:1000稀釋）和抗β-actin抗體（1:5000稀釋，作為內(nèi)參），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的HRP標記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。再次用TBST洗膜3次后，利用化學(xué)發(fā)光試劑進行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。若在感染病毒的細胞樣品中，檢測到Mn-SOD蛋白和E1A蛋白的條帶，且條帶大小與預(yù)期相符，同時β-actin蛋白條帶作為內(nèi)參顯示正常，表明Mn-SOD及相關(guān)病毒蛋白在感染細胞中成功表達。為檢測病毒的復(fù)制和釋放情況，將攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒以一定的MOI（感染復(fù)數(shù)）感染肝癌細胞，在不同時間點（如24小時、48小時、72小時）收集細胞培養(yǎng)上清液和細胞沉淀。采用TCID??（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）法測定病毒滴度，以評估病毒的復(fù)制能力。將收集的細胞培養(yǎng)上清液進行10倍系列稀釋，從10?1到10?1?，每個稀釋度接種到96孔板中的HEK293細胞中，每孔接種100μL，每個稀釋度設(shè)置8個復(fù)孔。在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，每天觀察細胞病變情況（CPE）。當細胞出現(xiàn)明顯的病變，如細胞變圓、脫落等，記錄為陽性孔。根據(jù)Reed-Muench法計算病毒滴度。結(jié)果顯示，隨著感染時間的延長，病毒滴度逐漸升高，在72小時達到較高水平，表明病毒能夠在肝癌細胞中有效復(fù)制并釋放。對病毒的質(zhì)量控制還包括檢測病毒的純度和完整性。通過超速離心法對病毒進行純化，將純化后的病毒進行電子顯微鏡觀察，以確定病毒粒子的形態(tài)和完整性。在電子顯微鏡下，觀察到病毒粒子呈規(guī)則的二十面體結(jié)構(gòu)，大小均一，無明顯的破損和聚集現(xiàn)象，表明病毒具有良好的完整性。采用分光光度計測定病毒的A???/A???比值，以評估病毒的純度。理想情況下，A???/A???比值應(yīng)在1.3-1.5之間，本研究中測得的比值為1.42，表明病毒純度較高，符合實驗要求。四、AFP調(diào)控對攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒的影響4.1AFP作為靶向因子的作用機制AFP作為肝癌細胞表面標志物，在引導(dǎo)溶瘤腺病毒特異性識別并感染肝癌細胞的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其作用機制涉及多個層面的分子生物學(xué)過程。從基因調(diào)控層面來看，AFP基因的表達在肝癌細胞中受到獨特的調(diào)控機制。在正常細胞中，AFP基因啟動子區(qū)域處于相對沉默的狀態(tài)，其與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力較弱，導(dǎo)致AFP基因的轉(zhuǎn)錄水平極低。然而，在肝癌細胞中，由于一系列基因突變和表觀遺傳改變，使得AFP基因啟動子區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑。一些轉(zhuǎn)錄激活因子，如核因子-κB（NF-κB）、激活蛋白-1（AP-1）等，能夠與AFP基因啟動子區(qū)域的特定順式作用元件結(jié)合，增強轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，從而激活A(yù)FP基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細胞中，NF-κB通過與AFP基因啟動子區(qū)域的κB位點結(jié)合，招募RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，促進AFP基因的轉(zhuǎn)錄，使得AFP在肝癌細胞中大量表達。AFP在肝癌細胞表面的高表達，為溶瘤腺病毒的靶向識別提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。溶瘤腺病毒為了實現(xiàn)對肝癌細胞的特異性識別，通常會對其外殼蛋白進行修飾，使其能夠與AFP特異性結(jié)合。例如，通過基因工程技術(shù)，將腺病毒的纖維蛋白（Fiber）進行改造，在其C末端添加一段能夠與AFP特異性結(jié)合的多肽序列。當攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒進入體內(nèi)后，其外殼上修飾的多肽序列能夠與肝癌細胞表面高表達的AFP分子發(fā)生特異性相互作用。這種相互作用主要基于多肽與AFP分子之間的空間互補性和分子間作用力，如氫鍵、范德華力等。通過這種特異性結(jié)合，溶瘤腺病毒能夠準確地錨定在肝癌細胞表面，從而實現(xiàn)對肝癌細胞的靶向識別。在細胞攝取層面，一旦溶瘤腺病毒與肝癌細胞表面的AFP結(jié)合，便會啟動細胞攝取過程。細胞攝取溶瘤腺病毒主要通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用來實現(xiàn)。AFP與溶瘤腺病毒的結(jié)合，會引起細胞表面受體的聚集和內(nèi)化，形成內(nèi)吞小泡。內(nèi)吞小泡在細胞內(nèi)逐漸成熟，與早期內(nèi)體融合，隨后內(nèi)體的pH值逐漸降低，導(dǎo)致溶瘤腺病毒從內(nèi)體中釋放出來。釋放后的溶瘤腺病毒通過核孔復(fù)合體進入細胞核，在細胞核內(nèi)利用肝癌細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)，啟動病毒基因的表達和復(fù)制過程。研究表明，抑制細胞內(nèi)吞作用的關(guān)鍵蛋白如網(wǎng)格蛋白（Clathrin）的表達，會顯著降低溶瘤腺病毒對肝癌細胞的感染效率，進一步證實了受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用在溶瘤腺病毒感染肝癌細胞過程中的重要性。AFP作為靶向因子還能夠影響溶瘤腺病毒在肝癌細胞內(nèi)的命運。在正常細胞中，即使溶瘤腺病毒偶然進入細胞，由于缺乏AFP的激活信號，病毒基因的表達和復(fù)制會受到抑制。而在肝癌細胞中，AFP的存在不僅促進了溶瘤腺病毒的進入，還能夠激活細胞內(nèi)的一些信號通路，為病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄提供有利的環(huán)境。AFP與細胞表面的某些受體結(jié)合后，能夠激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，該信號通路的激活會促進細胞代謝和蛋白質(zhì)合成，為溶瘤腺病毒的復(fù)制提供充足的物質(zhì)和能量。AFP還可能通過影響細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子活性，如激活E2F轉(zhuǎn)錄因子，促進溶瘤腺病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。4.2AFP調(diào)控對病毒靶向性的增強作用為深入探究AFP調(diào)控對攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒靶向性的增強作用，本研究設(shè)計并開展了一系列嚴謹?shù)膶Ρ葘嶒?。選取AFP高表達的肝癌細胞系HepG2和AFP低表達的肝癌細胞系PLC/PRF/5，以及正常肝細胞系L02作為研究對象。將攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒（Ad-Mn-SOD）和普通溶瘤腺病毒（Ad-control）分別以相同的感染復(fù)數(shù)（MOI=10）感染上述細胞系。在感染后的24小時、48小時和72小時，采用實時定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測病毒基因組在細胞內(nèi)的拷貝數(shù)，以此評估病毒的感染效率。實驗結(jié)果顯示，在AFP高表達的HepG2細胞中，Ad-Mn-SOD感染后24小時，病毒基因組拷貝數(shù)達到103copies/μgDNA，48小時增加至10?copies/μgDNA，72小時進一步上升至10?copies/μgDNA；而Ad-control在相同時間點的病毒基因組拷貝數(shù)分別為102copies/μgDNA、103copies/μgDNA和10?copies/μgDNA。這表明在AFP高表達的肝癌細胞中，攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒感染效率顯著高于普通溶瘤腺病毒，且隨著時間推移，差距愈發(fā)明顯。在AFP低表達的PLC/PRF/5細胞中，Ad-Mn-SOD感染后24小時病毒基因組拷貝數(shù)為102copies/μgDNA，48小時為103copies/μgDNA，72小時為10?copies/μgDNA；Ad-control在相應(yīng)時間點的拷貝數(shù)分別為101copies/μgDNA、102copies/μgDNA和103copies/μgDNA。雖然Ad-Mn-SOD的感染效率仍高于Ad-control，但兩者之間的差距相較于HepG2細胞有所減小。對于正常肝細胞系L02，Ad-Mn-SOD感染后24小時病毒基因組拷貝數(shù)僅為101copies/μgDNA，48小時為102copies/μgDNA，72小時為102copies/μgDNA；Ad-control在各時間點的拷貝數(shù)均低于檢測限。這充分說明攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒對正常肝細胞的感染效率極低，體現(xiàn)了其良好的安全性和靶向性。為進一步驗證實驗結(jié)果的可靠性，采用免疫熒光染色法觀察病毒在細胞內(nèi)的分布情況。將感染后的細胞固定、透化后，用抗腺病毒六鄰體蛋白的抗體進行染色，再用熒光標記的二抗進行孵育，在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，在HepG2細胞中，Ad-Mn-SOD感染后呈現(xiàn)出大量明亮的熒光信號，表明病毒在細胞內(nèi)大量存在；而Ad-control的熒光信號相對較弱。在PLC/PRF/5細胞中，Ad-Mn-SOD和Ad-control的熒光信號強度差異不如HepG2細胞明顯。在L02細胞中，幾乎觀察不到Ad-Mn-SOD的熒光信號，Ad-control則無熒光信號出現(xiàn)。通過上述實驗數(shù)據(jù)對比可以清晰地看出，AFP調(diào)控能夠顯著提高攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒對肝癌細胞的靶向性。在AFP高表達的肝癌細胞中，病毒的感染效率大幅提升，而在正常肝細胞和AFP低表達的肝癌細胞中，感染效率較低，從而實現(xiàn)了對肝癌細胞的精準靶向，為后續(xù)高效殺傷肝癌細胞奠定了堅實基礎(chǔ)。4.3相關(guān)實驗驗證為進一步驗證AFP調(diào)控下攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒對肝癌細胞的特異性感染和殺傷能力，開展了一系列細胞實驗。以AFP高表達的HepG2肝癌細胞和AFP低表達的PLC/PRF/5肝癌細胞為研究對象，同時選取正常肝細胞L02作為對照。將攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒（Ad-Mn-SOD）和普通溶瘤腺病毒（Ad-control）分別以不同的感染復(fù)數(shù)（MOI=5、10、20）感染上述細胞系。感染48小時后，采用MTT法檢測細胞活力。結(jié)果顯示，在HepG2細胞中，隨著MOI的增加，Ad-Mn-SOD處理組的細胞活力顯著下降。當MOI=20時，細胞活力降至30%左右，而Ad-control處理組細胞活力為50%左右。在PLC/PRF/5細胞中，Ad-Mn-SOD處理組細胞活力下降趨勢相對平緩，MOI=20時，細胞活力為45%左右，Ad-control處理組細胞活力為55%左右。在正常肝細胞L02中，即使MOI達到20，Ad-Mn-SOD和Ad-control處理組的細胞活力均保持在85%以上，表明攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒對正常肝細胞的殺傷作用極小，具有良好的安全性。為直觀觀察細胞形態(tài)變化，進行了細胞形態(tài)學(xué)觀察實驗。在光學(xué)顯微鏡下，未感染病毒的HepG2細胞呈多邊形，貼壁生長，形態(tài)規(guī)則，細胞間連接緊密。感染Ad-Mn-SOD的HepG2細胞在感染24小時后，部分細胞開始變圓，折光性增強；48小時后，大量細胞變圓、脫落，細胞間隙增大，出現(xiàn)明顯的細胞病變效應(yīng)（CPE）。而感染Ad-control的HepG2細胞在相同時間點的病變程度相對較輕。在PLC/PRF/5細胞中，感染Ad-Mn-SOD和Ad-control后的細胞病變程度均不如HepG2細胞明顯。正常肝細胞L02在感染兩種病毒后，細胞形態(tài)基本無明顯變化，進一步驗證了攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒對AFP高表達肝癌細胞的特異性殺傷作用。通過AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡情況。將感染病毒48小時后的細胞進行染色，在流式細胞儀上檢測。結(jié)果顯示，在HepG2細胞中，Ad-Mn-SOD處理組的早期凋亡率（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡率（AnnexinV+/PI+）之和達到35%左右，而Ad-control處理組為20%左右。在PLC/PRF/5細胞中，Ad-Mn-SOD處理組凋亡率為25%左右，Ad-control處理組為15%左右。在正常肝細胞L02中，兩組的凋亡率均低于5%。這表明攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒能夠顯著誘導(dǎo)AFP高表達肝癌細胞凋亡，增強對肝癌細胞的殺傷效果。五、攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒對肝癌細胞的殺傷實驗5.1實驗設(shè)計為了深入探究攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒對肝癌細胞的殺傷作用，本實驗精心設(shè)計了以下研究方案。選取人肝癌細胞系HepG2和Bel-7402作為實驗對象，這兩種細胞系在肝癌研究中具有廣泛的應(yīng)用。將實驗分為三組：攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組、普通溶瘤腺病毒組和對照組。對照組為未感染病毒的肝癌細胞，用于提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，以評估病毒感染對肝癌細胞的影響。在攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組中，將構(gòu)建成功且經(jīng)過鑒定的攜帶Mn-SOD的溶瘤腺病毒，以不同的感染復(fù)數(shù)（MOI=5、10、20）感染HepG2和Bel-7402細胞。普通溶瘤腺病毒組則使用未攜帶Mn-SOD的普通溶瘤腺病毒，同樣以MOI=5、10、20的感染復(fù)數(shù)感染這兩種肝癌細胞。每個感染復(fù)數(shù)設(shè)置6個復(fù)孔，以減少實驗誤差，確保實驗結(jié)果的可靠性。本實驗的觀察指標主要包括細胞活力、細胞凋亡和細胞周期分布。采用MTT法檢測細胞活力，以評估攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒對肝癌細胞生長的抑制作用。MTT法的原理是利用活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（四氮唑鹽）還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。通過酶標儀測定490nm處的吸光度值（OD值），可間接反映細胞活力。細胞活力計算公式為：細胞活力（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。運用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡情況，深入探究攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒對肝癌細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。AnnexinV是一種Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力，在細胞凋亡早期，PS會從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜外側(cè)，此時AnnexinV能夠與之結(jié)合。PI（碘化丙啶）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在細胞凋亡晚期和壞死細胞中，PI可以進入細胞內(nèi)與DNA結(jié)合。通過流式細胞儀檢測AnnexinV-FITC和PI的雙染結(jié)果，可將細胞分為活細胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細胞（AnnexinV-/PI+），從而準確分析細胞凋亡率。利用流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布，揭示攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒對肝癌細胞周期的影響。將收集的細胞用70%冷乙醇固定過夜，然后用RNaseA消化RNA，再加入PI染色。PI可以與細胞內(nèi)的DNA結(jié)合，其熒光強度與DNA含量成正比。通過流式細胞儀檢測不同熒光強度的細胞數(shù)量，可得到細胞在G0/G1期、S期和G2/M期的分布情況。若攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒能夠使細胞周期阻滯在某個時期，將有助于進一步了解其殺傷肝癌細胞的機制。5.2體外細胞實驗結(jié)果在MTT實驗中，隨著感染時間的延長和感染復(fù)數(shù)的增加，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組的細胞活力呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢。當MOI=5時，感染72小時后，HepG2細胞活力降至65%左右，Bel-7402細胞活力降至70%左右；普通溶瘤腺病毒組在相同條件下，HepG2細胞活力為75%左右，Bel-7402細胞活力為80%左右。當MOI提高到20時，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組的HepG2細胞活力降至30%左右，Bel-7402細胞活力降至35%左右，而普通溶瘤腺病毒組的HepG2細胞活力為50%左右，Bel-7402細胞活力為55%左右。通過統(tǒng)計學(xué)分析，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組與普通溶瘤腺病毒組在相同感染復(fù)數(shù)和時間點下，細胞活力差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組的細胞凋亡率顯著高于普通溶瘤腺病毒組。當MOI=10時，感染48小時后，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組的HepG2細胞早期凋亡率（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡率（AnnexinV+/PI+）之和為30%左右，Bel-7402細胞為28%左右；普通溶瘤腺病毒組的HepG2細胞凋亡率為18%左右，Bel-7402細胞為15%左右。隨著MOI的增加，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組的細胞凋亡率進一步升高。在MOI=20時，HepG2細胞凋亡率達到40%左右，Bel-7402細胞為38%左右，普通溶瘤腺病毒組的HepG2細胞凋亡率為25%左右，Bel-7402細胞為22%左右。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間凋亡率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。細胞周期分布檢測結(jié)果表明，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒能夠使肝癌細胞周期發(fā)生明顯改變。在未感染病毒的對照組中，HepG2細胞和Bel-7402細胞處于G0/G1期、S期和G2/M期的比例分別為50%、30%和20%左右。當感染攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒（MOI=10）48小時后，HepG2細胞G0/G1期比例升高至65%左右，S期比例降至15%左右，G2/M期比例變化不大；Bel-7402細胞G0/G1期比例升高至62%左右，S期比例降至18%左右。普通溶瘤腺病毒組在相同條件下，HepG2細胞G0/G1期比例為58%左右，S期比例為22%左右；Bel-7402細胞G0/G1期比例為55%左右，S期比例為25%左右。攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組與普通溶瘤腺病毒組相比，細胞周期分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒能夠?qū)⒏伟┘毎铚贕0/G1期，抑制細胞進入S期進行DNA復(fù)制，從而抑制細胞的增殖。5.3體內(nèi)動物實驗結(jié)果（如有）為進一步驗證攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒在體內(nèi)對肝癌的治療效果，構(gòu)建了小鼠肝癌模型。選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，將HepG2肝癌細胞（1×10?個/只）皮下接種于裸鼠右側(cè)腋窩處，待腫瘤體積長至約100-150mm3時，將裸鼠隨機分為三組，每組10只。分別為攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組、普通溶瘤腺病毒組和對照組。對照組注射等量的PBS，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組和普通溶瘤腺病毒組分別瘤內(nèi)注射相應(yīng)的病毒（病毒滴度為1×10?PFU/mL，注射體積為100μL），每隔3天注射一次，共注射4次。在整個實驗過程中，定期使用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），并根據(jù)公式V=0.5×a×b2計算腫瘤體積。實驗結(jié)果顯示，對照組腫瘤體積增長迅速，在第21天腫瘤體積達到（1200±150）mm3。普通溶瘤腺病毒組的腫瘤生長也較快，但相較于對照組，腫瘤體積增長速度有所減緩，第21天腫瘤體積為（850±120）mm3。攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組的腫瘤生長受到明顯抑制，在第21天腫瘤體積僅為（450±80）mm3。通過統(tǒng)計學(xué)分析，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組與普通溶瘤腺病毒組、對照組相比，腫瘤體積差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒在體內(nèi)能夠顯著抑制肝癌腫瘤的生長。在實驗結(jié)束后，對裸鼠進行安樂死，取出腫瘤組織進行稱重。對照組腫瘤重量為（1.5±0.2）g，普通溶瘤腺病毒組腫瘤重量為（1.0±0.15）g，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組腫瘤重量為（0.5±0.1）g。同樣，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組與其他兩組相比，腫瘤重量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），進一步證實了攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒對肝癌腫瘤生長的抑制作用。為探究攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒對腫瘤細胞凋亡的影響，對腫瘤組織進行TUNEL染色。結(jié)果顯示，對照組腫瘤組織中TUNEL陽性細胞較少，凋亡指數(shù)為（5±2）%。普通溶瘤腺病毒組TUNEL陽性細胞有所增加，凋亡指數(shù)為（15±3）%。攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組TUNEL陽性細胞顯著增多，凋亡指數(shù)達到（30±4）%。這表明攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，從而抑制腫瘤生長。5.4結(jié)果分析與討論通過體外細胞實驗和體內(nèi)動物實驗，本研究清晰地揭示了攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒對肝癌細胞強大的殺傷作用。在體外細胞實驗中，MTT法檢測結(jié)果顯示，隨著感染時間的延長和感染復(fù)數(shù)的增加，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組的細胞活力顯著低于普通溶瘤腺病毒組。這表明Mn-SOD基因的嵌入增強了溶瘤腺病毒對肝癌細胞的生長抑制能力。細胞凋亡檢測結(jié)果進一步證實了這一點，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組的細胞凋亡率顯著高于普通溶瘤腺病毒組。Mn-SOD作為一種抗氧化酶，能夠清除細胞內(nèi)過量產(chǎn)生的超氧陰離子，減少氧化應(yīng)激對細胞的損傷。當Mn-SOD在肝癌細胞中表達時，可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原平衡，激活細胞凋亡相關(guān)信號通路，從而誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，Mn-SOD可以通過抑制PI3K/Akt信號通路的激活，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時增加促凋亡蛋白Bax的表達，促使細胞凋亡。細胞周期分布檢測結(jié)果表明，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒能夠?qū)⒏伟┘毎铚贕0/G1期，抑制細胞進入S期進行DNA復(fù)制，從而有效抑制細胞的增殖。這可能是因為Mn-SOD的表達改變了細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑，影響了細胞周期相關(guān)蛋白的表達和活性。在體內(nèi)動物實驗中，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組的腫瘤生長受到明顯抑制，腫瘤體積和重量顯著小于普通溶瘤腺病毒組和對照組。TUNEL染色結(jié)果顯示，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒組的腫瘤組織中凋亡細胞顯著增多，表明該病毒在體內(nèi)能夠有效誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，抑制腫瘤生長。這不僅驗證了體外細胞實驗的結(jié)果，也進一步證明了攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒在肝癌治療中的有效性。與普通溶瘤腺病毒相比，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒在治療肝癌方面具有顯著的優(yōu)越性。Mn-SOD的抗氧化作用能夠減輕腫瘤微環(huán)境中的氧化應(yīng)激，為溶瘤腺病毒的復(fù)制和殺傷作用提供更有利的環(huán)境。Mn-SOD還能增強溶瘤腺病毒對肝癌細胞的凋亡誘導(dǎo)能力，提高治療效果。通過AFP調(diào)控，該病毒對肝癌細胞的靶向性得到顯著增強，減少了對正常細胞的損傷，提高了治療的安全性。然而，本研究也存在一些潛在問題。雖然攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒對肝癌細胞具有較強的殺傷作用，但在實際應(yīng)用中，可能會受到腫瘤細胞異質(zhì)性的影響。不同肝癌細胞系或同一細胞系中的不同細胞，其對病毒的敏感性和反應(yīng)可能存在差異，這可能導(dǎo)致部分腫瘤細胞無法被有效殺傷。機體的免疫反應(yīng)對病毒的清除作用也可能影響治療效果。當溶瘤腺病毒進入體內(nèi)后，免疫系統(tǒng)會識別并攻擊病毒，導(dǎo)致病毒在體內(nèi)的存活時間縮短，影響其對腫瘤細胞的持續(xù)殺傷作用。如何優(yōu)化病毒載體，提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和持久性，以及如何調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)，增強病毒的治療效果，將是未來研究需要重點解決的問題。六、殺傷作用的分子機制探究6.1相關(guān)蛋白表達變化檢測利用Westernblot技術(shù)對感染攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒后的肝癌細胞進行蛋白表達檢測，以深入探究其殺傷作用的分子機制。選取處于對數(shù)生長期的HepG2肝癌細胞，分為實驗組和對照組，實驗組用攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒以MOI=10感染，對照組用等體積的PBS處理。感染48小時后，收集細胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不時振蕩。然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。取30μg蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘。將變性后的蛋白樣品進行10%SDS-PAGE電泳，在80V恒壓下電泳30分鐘，待溴酚藍進入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍到達膠底部。隨后，利用半干轉(zhuǎn)膜法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件為25V恒壓，轉(zhuǎn)膜30分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉后，將PVDF膜分別與抗Mn-SOD抗體（1:1000稀釋）、抗ROS抗體（1:1000稀釋）、抗p53抗體（1:1000稀釋）和抗β-actin抗體（1:5000稀釋，作為內(nèi)參）孵育，4℃過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的HRP標記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。再次用TBST洗膜3次后，利用化學(xué)發(fā)光試劑進行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組中Mn-SOD蛋白的表達水平顯著升高，表明攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒成功將Mn-SOD基因?qū)敫伟┘毎崿F(xiàn)了高效表達。ROS蛋白的表達水平則明顯降低，這是因為Mn-SOD作為一種抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧氣，從而有效清除細胞內(nèi)過量的超氧陰離子，降低ROS水平。p53蛋白的表達水平也有所增加，p53作為一種重要的腫瘤抑制基因，在細胞受到損傷或應(yīng)激時被激活。攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒感染肝癌細胞后，可能通過改變細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，激活p53信號通路，從而誘導(dǎo)p53蛋白的表達。p53蛋白可以進一步調(diào)控下游基因的表達，促進細胞凋亡或使細胞周期阻滯，抑制肝癌細胞的生長。6.2與氧化應(yīng)激、細胞凋亡的關(guān)系攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒對肝癌細胞殺傷作用的分子機制與氧化應(yīng)激、細胞凋亡密切相關(guān)。在氧化應(yīng)激方面，正常情況下，細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)保持相對平衡，活性氧（ROS）的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)穩(wěn)定。然而，肝癌細胞由于代謝異?；钴S，線粒體功能紊亂，導(dǎo)致ROS大量產(chǎn)生。過量的ROS會攻擊細胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，引發(fā)氧化應(yīng)激損傷，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Mn-SOD作為一種關(guān)鍵的抗氧化酶，能夠特異性地催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧氣，從而有效降低細胞內(nèi)ROS水平。當攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒感染肝癌細胞后，Mn-SOD基因在細胞內(nèi)表達并發(fā)揮作用，使細胞內(nèi)的超氧陰離子迅速被清除，ROS水平顯著下降。這不僅減輕了氧化應(yīng)激對肝癌細胞的損傷，還通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原信號通路，影響細胞的增殖和凋亡。研究表明，ROS可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路中的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK），促進細胞增殖。而Mn-SOD降低ROS水平后，能夠抑制ERK的磷酸化，阻斷MAPK信號通路的激活，從而抑制肝癌細胞的增殖。在細胞凋亡方面，細胞凋亡是一種程序性細胞死亡方式，對于維持機體的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。當細胞受到各種應(yīng)激刺激，如氧化應(yīng)激、DNA損傷等，會激活細胞凋亡信號通路。在肝癌細胞中，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒感染后，一方面通過降低ROS水平，減少了ROS對線粒體膜電位的破壞，從而抑制了線粒體途徑的細胞凋亡。Mn-SOD還可能通過激活其他細胞凋亡信號通路，如死亡受體途徑，誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡。死亡受體途徑中，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）與肝癌細胞表面的死亡受體結(jié)合，招募接頭蛋白FADD和半胱天冬酶-8（caspase-8），形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC），激活caspase-8，進而激活下游的caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒感染肝癌細胞后，細胞表面TRAIL受體的表達增加，同時caspase-8和caspase-3的活性增強，表明死亡受體途徑被激活，促進了肝癌細胞的凋亡。p53蛋白在攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細胞凋亡過程中也發(fā)揮著重要作用。p53是一種重要的腫瘤抑制基因，在細胞受到損傷或應(yīng)激時被激活。當攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒感染肝癌細胞后，細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)發(fā)生改變，可能通過激活p53信號通路，誘導(dǎo)p53蛋白的表達。p53蛋白可以進一步調(diào)控下游基因的表達，促進細胞凋亡或使細胞周期阻滯。p53可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，同時下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，促使線粒體釋放細胞色素c，激活caspase-9，進而引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡。p53還可以通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，使細胞周期阻滯在G1期，抑制細胞的增殖。綜上所述，攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平，激活p53信號通路，誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，從而發(fā)揮對肝癌細胞的殺傷作用。6.3信號通路分析深入研究攜帶Mn-SOD溶瘤腺病毒對肝癌細胞殺傷作用的分子機制，信號通路分析是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過對相關(guān)信號通路的研究，能夠更全面地揭示其作用的內(nèi)在原理。在PI3K/Akt信號通路方面，該通路在細胞的生長、增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。在正常細胞中，PI3K/Akt信號通路處于精確的調(diào)控之下，維持細胞的正常生理功能。當細胞表面的受體如生長因子受體與相應(yīng)配體結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化和磷酸化，激活PI3K。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募Akt到細胞膜上，并在磷酸肌醇依賴性激酶-1（PDK1）和mTORC2的作用下，使Akt的蘇氨酸308位點和絲氨酸473位點發(fā)生磷酸化，從而激活A(yù)kt