一、引言1.1研究背景與意義沙門菌（Salmonella）是一種廣泛存在于自然界中的革蘭氏陰性桿菌，是腸桿菌科的一個(gè)重要分支，也是一類重要的人畜共患病原菌，在公共衛(wèi)生領(lǐng)域備受關(guān)注。該菌主要經(jīng)消化道感染，宿主范圍廣泛，包括人類、家畜、家禽及野生禽獸等。感染沙門菌后，人或動(dòng)物可能出現(xiàn)無癥狀帶菌狀態(tài)，也可能表現(xiàn)出嚴(yán)重的臨床癥狀，如發(fā)熱、腹瀉、嘔吐、敗血癥等，甚至導(dǎo)致死亡。在全球范圍內(nèi)，沙門菌感染給人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的威脅和經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)，每年全球約有1.6億人感染沙門菌，其中21.6萬人死亡。在我國(guó)，沙門菌引起的食物中毒和食源性疾病案例也一直位居細(xì)菌性食物中毒前列，占比達(dá)42.6%-60.0%。豬作為沙門菌的主要宿主之一，豬肉在中國(guó)人日常飲食的動(dòng)物蛋白來源中占到近70％的比例，豬源沙門菌不僅會(huì)導(dǎo)致豬群發(fā)病，影響豬肉的產(chǎn)量和質(zhì)量，還可通過食物鏈傳播給人類，引發(fā)食物中毒和食源性疾病，嚴(yán)重威脅公眾健康。近年來，隨著我國(guó)豬肉產(chǎn)量和消費(fèi)量的持續(xù)增長(zhǎng)，豬源沙門菌引起的食品安全問題日益凸顯。揚(yáng)州地區(qū)作為我國(guó)重要的生豬養(yǎng)殖和豬肉消費(fèi)區(qū)域，其豬源沙門菌的污染情況和耐藥性問題不容忽視。對(duì)揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌進(jìn)行分離、鑒定及耐藥性分析，有助于了解該地區(qū)豬源沙門菌的流行特征和耐藥現(xiàn)狀，為制定科學(xué)有效的防控措施提供依據(jù)。同時(shí)，本研究也可為保障揚(yáng)州地區(qū)乃至全國(guó)的豬肉食品安全提供技術(shù)支持，具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，豬源沙門菌的研究開展較早且較為深入。早在20世紀(jì)，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家就已關(guān)注到豬源沙門菌對(duì)養(yǎng)豬業(yè)和公共衛(wèi)生的影響，并開展了相關(guān)的分離鑒定和耐藥性研究。研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的豬源沙門菌血清型分布存在差異，其中鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌等在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有較高的檢出率。在耐藥性方面，隨著抗生素在畜牧業(yè)中的廣泛使用，豬源沙門菌的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)。有研究表明，歐美部分地區(qū)的豬源沙門菌對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、磺胺類等多種常用抗生素的耐藥率高達(dá)50%以上，且耐藥譜呈現(xiàn)不斷擴(kuò)大的趨勢(shì)。近年來，國(guó)外在豬源沙門菌的致病機(jī)制、傳播途徑以及防控策略等方面也取得了顯著進(jìn)展。通過分子生物學(xué)技術(shù)，深入研究了沙門菌的毒力基因和致病相關(guān)因子，為開發(fā)新型疫苗和治療藥物提供了理論基礎(chǔ)。同時(shí)，加強(qiáng)了對(duì)豬肉生產(chǎn)鏈的全程監(jiān)控，從養(yǎng)殖、屠宰到加工銷售環(huán)節(jié)，采取一系列措施來降低沙門菌的污染風(fēng)險(xiǎn)，如優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境、規(guī)范抗生素使用、加強(qiáng)食品檢測(cè)等。在國(guó)內(nèi)，豬源沙門菌的研究也受到了廣泛關(guān)注。許多地區(qū)開展了豬源沙門菌的分離鑒定和耐藥性調(diào)查工作，發(fā)現(xiàn)我國(guó)豬源沙門菌的血清型復(fù)雜多樣，除了常見的鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌外，還存在一些具有地域特色的血清型。在耐藥性方面，由于我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模龐大且養(yǎng)殖模式多樣，部分地區(qū)存在抗生素濫用的現(xiàn)象，導(dǎo)致豬源沙門菌的耐藥情況較為嚴(yán)峻。相關(guān)研究顯示，我國(guó)部分地區(qū)豬源沙門菌對(duì)多種抗生素的耐藥率超過60%，多重耐藥菌株的比例也較高，給臨床治療和防控帶來了很大困難。揚(yáng)州地區(qū)作為我國(guó)重要的生豬養(yǎng)殖和豬肉消費(fèi)區(qū)域，已有部分學(xué)者對(duì)該地區(qū)豬源沙門菌進(jìn)行了研究。印廣浩等人在2015-2016年間，對(duì)揚(yáng)州部分屠宰場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及動(dòng)物醫(yī)院的樣品進(jìn)行了沙門菌分離鑒定及耐藥性分析，結(jié)果顯示屠宰場(chǎng)樣品中沙門菌的分離率為10.5％，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)樣品中沙門菌分離率19.7％，動(dòng)物醫(yī)院樣品中沙門菌的分離率為2.6％。屠宰場(chǎng)分離株中德爾卑沙門菌分離率最高(63.6％)，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)分離株中羅森沙門菌和德爾卑沙門菌分離率最高(27.8％)，動(dòng)物醫(yī)院送檢病料中的檢出的全部為鼠傷寒沙門菌(100％)。84.8％沙門菌分離株對(duì)四環(huán)素表現(xiàn)出極高的耐藥率，對(duì)強(qiáng)力霉素、羧芐西林也有較高的耐藥率。李康康等人于2021年采集揚(yáng)州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)豬肉樣品393份，進(jìn)行沙門氏桿菌的分離純化、PCR鑒定和血清型鑒定，結(jié)果共分離到150株沙門氏桿菌，總分離率為38.2%，優(yōu)勢(shì)血清型為倫敦沙門氏桿菌。88.7%的分離菌株對(duì)多西環(huán)素耐藥，對(duì)四環(huán)素(86.7%)、氨芐西林(84.0%)、阿莫西林(76.0%)、氯霉素(75.3%)和氟苯尼考(74.0%)也有較高的耐藥率。92.0%的分離菌株表現(xiàn)出多重耐藥，其中48.0%的分離菌株耐8-10種抗生素。然而，目前揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的研究仍存在一些不足之處。一方面，以往的研究主要集中在屠宰場(chǎng)和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等特定場(chǎng)所，對(duì)于養(yǎng)殖場(chǎng)、運(yùn)輸環(huán)節(jié)等豬肉生產(chǎn)鏈其他環(huán)節(jié)的沙門菌污染情況研究較少，難以全面了解豬源沙門菌在揚(yáng)州地區(qū)的傳播規(guī)律。另一方面，在耐藥性研究方面，雖然已有對(duì)常見抗生素耐藥性的檢測(cè)，但對(duì)于新型抗生素以及耐藥基因的傳播機(jī)制研究還不夠深入，無法為臨床合理用藥和耐藥性防控提供更全面的技術(shù)支持。此外，不同研究之間的采樣時(shí)間、方法和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)存在差異，導(dǎo)致數(shù)據(jù)的可比性和連續(xù)性較差，不利于對(duì)揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和分析。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在全面了解揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的流行情況和耐藥現(xiàn)狀，為該地區(qū)豬源沙門菌病的防控以及豬肉食品安全的保障提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。具體研究?jī)?nèi)容如下：豬源沙門菌的分離與鑒定：從揚(yáng)州地區(qū)的養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等豬肉生產(chǎn)鏈的不同環(huán)節(jié)采集豬的糞便、組織以及豬肉等樣品。運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)樣品中的沙門菌進(jìn)行分離。通過形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)以及分子生物學(xué)方法（如PCR擴(kuò)增沙門菌的特異性基因invA），對(duì)分離菌株進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，確定其是否為沙門菌。豬源沙門菌的血清型鑒定：采用血清學(xué)方法，利用沙門菌的O抗原和H抗原診斷血清，對(duì)分離得到的沙門菌進(jìn)行血清型鑒定。通過玻片凝集試驗(yàn)等操作，確定菌株的血清型，分析揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的優(yōu)勢(shì)血清型及其分布特點(diǎn)，為追蹤沙門菌的傳播途徑和防控提供依據(jù)。豬源沙門菌的耐藥性分析：運(yùn)用紙片擴(kuò)散法（K-B法）或肉湯稀釋法，對(duì)分離的沙門菌進(jìn)行多種常用抗生素的藥敏試驗(yàn)。檢測(cè)的抗生素種類包括β-內(nèi)酰胺類（如氨芐西林、阿莫西林等）、氨基糖苷類（如慶大霉素、卡那霉素等）、四環(huán)素類（如四環(huán)素、多西環(huán)素等）、氯霉素類（如氯霉素、氟苯尼考等）、喹諾酮類（如環(huán)丙沙星、恩諾沙星等）以及磺胺類等。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算各抗生素的耐藥率、中介率和敏感率，分析揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的耐藥譜和耐藥趨勢(shì)。耐藥基因的檢測(cè)：采用PCR技術(shù)，對(duì)耐藥菌株進(jìn)行常見耐藥基因的檢測(cè)。如檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關(guān)基因（如blaTEM、blaSHV、blaCTX-M等）、四環(huán)素類耐藥基因（如tetA、tetB、tetC等）、氯霉素類耐藥基因（如floR、cat等）、喹諾酮類耐藥基因（如gyrA、parC等）以及磺胺類耐藥基因（如sul1、sul2、sul3等）。分析耐藥基因的攜帶情況與細(xì)菌耐藥表型之間的相關(guān)性，探討耐藥基因在豬源沙門菌中的傳播機(jī)制。分子分型研究：運(yùn)用多位點(diǎn)序列分型（MLST）技術(shù)，對(duì)部分代表性的沙門菌分離株進(jìn)行分子分型。通過PCR擴(kuò)增多個(gè)管家基因（如aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA、thrA等），對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與國(guó)際MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，確定菌株的序列型（ST）。分析不同ST型菌株的分布特征及其與耐藥性之間的關(guān)系，為追蹤沙門菌的傳播和溯源提供分子水平的依據(jù)。二、材料與方法2.1樣本采集在2023年1月至2023年12月期間，于揚(yáng)州地區(qū)的多個(gè)生豬屠宰場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)以及不同規(guī)模和養(yǎng)殖模式的養(yǎng)殖場(chǎng)開展樣本采集工作。在養(yǎng)殖場(chǎng)，隨機(jī)選取健康狀況不同的生豬，使用無菌棉簽深入直腸采集糞便樣本，每頭豬采集一份，每份糞便樣本量約為5-10克，采集后立即將棉簽放入含有10毫升無菌生理鹽水的采樣管中，輕輕振蕩使糞便均勻分散，標(biāo)記好豬只編號(hào)、養(yǎng)殖場(chǎng)名稱、采集日期等信息。對(duì)于病死豬或疑似感染沙門菌的病豬，在無菌條件下采集肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)等組織樣本，每個(gè)組織樣本約1-2克，放入無菌自封袋中，并做好相應(yīng)標(biāo)記。在屠宰場(chǎng)，分別在生豬待宰區(qū)、屠宰生產(chǎn)線以及分割車間進(jìn)行樣本采集。在待宰區(qū)，采集生豬的糞便樣本，方法同養(yǎng)殖場(chǎng)。在屠宰生產(chǎn)線，于生豬放血后，立即采集其心臟血液，每份血液樣本量約為5毫升，注入含有抗凝劑的無菌采血管中。同時(shí)，采集豬的胴體表面擦拭樣，使用無菌棉拭子蘸取無菌生理鹽水，在豬胴體的頸部、腹部、背部等多個(gè)部位反復(fù)擦拭，然后將棉拭子放入含有10毫升無菌生理鹽水的采樣管中。在分割車間，采集分割后的豬肉樣本，每份約50克，放入無菌自封袋中，并記錄屠宰場(chǎng)名稱、采集時(shí)間、批次等信息。在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，隨機(jī)選擇不同攤位的豬肉進(jìn)行采樣。采集豬肉的表面組織，每份約20克，使用無菌剪刀剪取后放入無菌自封袋中。同時(shí)，采集攤位上的環(huán)境樣本，如案板擦拭樣、刀具擦拭樣等，方法同屠宰場(chǎng)的胴體表面擦拭樣采集方法。記錄農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)名稱、攤位號(hào)、采樣日期等信息。本次研究共采集豬糞便樣本300份、組織樣本（肝臟、脾臟、淋巴結(jié)等）100份、豬肉樣本200份以及環(huán)境樣本（案板、刀具等）100份，確保樣本來源廣泛且具有代表性，能夠全面反映揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的污染情況。2.2沙門菌分離將采集到的樣本按照1:9的比例接種于緩沖蛋白胨水（BPW）中，充分振蕩混勻，使樣本在BPW中均勻分散。將接種后的BPW置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12-18小時(shí)，進(jìn)行預(yù)增菌，以恢復(fù)受損沙門菌細(xì)胞的活性，使其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，增加沙門菌的數(shù)量，便于后續(xù)的分離操作。預(yù)增菌結(jié)束后，取1mL預(yù)增菌培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接至10mL四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）中，同時(shí)另取1mL預(yù)增菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至10mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）中。將接種后的TTB置于42℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18-24小時(shí)；將接種后的SC置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18-24小時(shí)，進(jìn)行選擇性增菌，抑制其他雜菌的生長(zhǎng)，進(jìn)一步富集沙門菌。增菌培養(yǎng)結(jié)束后，用接種環(huán)分別蘸取TTB和SC培養(yǎng)物，在亞硫酸鉍瓊脂（BS）平板、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂（XLD）平板以及沙門菌顯色培養(yǎng)基平板上進(jìn)行三區(qū)劃線接種，將菌液均勻地分布在平板表面，以獲得單個(gè)菌落。將接種后的平板置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中，其中BS平板培養(yǎng)40-48小時(shí)，XLD平板和沙門菌顯色培養(yǎng)基平板培養(yǎng)18-24小時(shí)。培養(yǎng)過程中，沙門菌在不同平板上會(huì)形成具有特征性的菌落形態(tài)，如在BS平板上，沙門菌菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；在XLD平板上，菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；在沙門菌顯色培養(yǎng)基平板上，根據(jù)不同廠家的產(chǎn)品，菌落會(huì)呈現(xiàn)出特定的顏色和形態(tài)，可依據(jù)廠家說明書進(jìn)行判斷。從選擇性平板上挑取2-3個(gè)典型或可疑的單個(gè)菌落，用接種針先在三糖鐵瓊脂斜面上進(jìn)行劃線，從斜面底部向上劃，然后再于底層進(jìn)行穿刺接種，注意穿刺時(shí)不要穿透底層，接種針不要滅菌，直接用該接種針接種賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置氨基酸脫羧酶對(duì)照培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基表面覆蓋2-3滴液體石蠟，防止氧氣進(jìn)入影響反應(yīng)結(jié)果。將接種后的三糖鐵瓊脂斜面、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和氨基酸脫羧酶對(duì)照培養(yǎng)基置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18-24小時(shí)，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí)。若三糖鐵瓊脂斜面反應(yīng)出現(xiàn)K/K（斜面和底層均為紅色，產(chǎn)堿），可直接排除沙門菌；若三糖鐵反應(yīng)出現(xiàn)A/A（斜面和底層均為黃色，產(chǎn)酸）且賴氨酸脫羧酶為陰性，也可直接排除沙門菌；若三糖鐵反應(yīng)出現(xiàn)A/A且賴氨酸脫羧酶為陽性，或三糖鐵出現(xiàn)K/A（斜面為紅色，底層為黃色），則需結(jié)合硫化氫、靛基質(zhì)、尿素酶、氰化鉀（KCN）、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)等結(jié)果進(jìn)行下一步判斷。經(jīng)過上述生化鑒定初步確定為沙門菌的菌株，挑取純培養(yǎng)的菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)，待菌落生長(zhǎng)良好后，將其保存于4℃冰箱中，作為后續(xù)血清型鑒定和耐藥性分析的菌株材料。2.3鑒定方法2.3.1形態(tài)學(xué)觀察取疑似沙門菌的菌落，在潔凈的載玻片上滴加一滴生理鹽水，用無菌接種環(huán)挑取少量菌苔，與生理鹽水充分混合，涂抹均勻，制成菌懸液涂片。待涂片自然干燥后，通過火焰固定，使細(xì)菌牢固地附著在玻片上。將固定好的涂片進(jìn)行革蘭氏染色，依次滴加結(jié)晶紫染液染色1分鐘，水洗；滴加碘液媒染1分鐘，水洗；用95%乙醇脫色20-30秒，水洗；最后滴加番紅復(fù)染液染色1-2分鐘，水洗，用吸水紙吸干水分。將染色后的涂片置于顯微鏡下，先使用低倍鏡找到目標(biāo)區(qū)域，再轉(zhuǎn)換高倍鏡和油鏡進(jìn)行觀察。在油鏡下，若觀察到呈紅色、桿狀的細(xì)菌，且分散排列，即可初步判斷為革蘭氏陰性桿菌，符合沙門菌的基本形態(tài)特征。同時(shí)，可進(jìn)一步觀察細(xì)菌的大小、形態(tài)是否均一，有無特殊結(jié)構(gòu)，如芽孢、莢膜等，以輔助判斷。2.3.2生化鑒定生化鑒定是利用細(xì)菌對(duì)不同生化底物的代謝能力和代謝產(chǎn)物的差異來進(jìn)行菌種鑒定的重要方法。對(duì)于初步形態(tài)學(xué)觀察疑似為沙門菌的菌株，進(jìn)行一系列生化反應(yīng)試驗(yàn)。糖發(fā)酵試驗(yàn)：將分離菌株分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖等糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，每種糖發(fā)酵培養(yǎng)基均設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。接種后，將試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。培養(yǎng)過程中，細(xì)菌若能利用糖類產(chǎn)酸，培養(yǎng)基中的指示劑會(huì)發(fā)生顏色變化，如溴甲酚紫指示劑在酸性條件下會(huì)由紫色變?yōu)辄S色；若產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，在培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)氣泡。沙門菌一般能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵乳糖，以此與其他腸道菌進(jìn)行區(qū)分。靛基質(zhì)試驗(yàn)：用接種環(huán)挑取分離菌株接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，沿試管壁緩慢加入5-10滴Kovacs靛基質(zhì)試劑，輕輕振蕩試管，使試劑與培養(yǎng)液充分接觸。若在試劑與培養(yǎng)液的界面處出現(xiàn)紅色環(huán)，表明該菌株能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)，為靛基質(zhì)試驗(yàn)陽性；若界面處仍為試劑的黃色，則為陰性。大多數(shù)沙門菌靛基質(zhì)試驗(yàn)為陰性，但個(gè)別沙門菌可能為陽性變體。尿素酶試驗(yàn)：將菌株接種于尿素培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24-48小時(shí)。若培養(yǎng)基由橙色變?yōu)榉奂t色，說明細(xì)菌能夠分解尿素產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)，即尿素酶試驗(yàn)陽性；若培養(yǎng)基顏色不變，仍為橙色或變?yōu)辄S色，則為尿素酶試驗(yàn)陰性。幾乎所有的沙門菌尿素酶試驗(yàn)均為陰性，極少出現(xiàn)陽性變體。硫化氫試驗(yàn)：使用三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行硫化氫試驗(yàn)，接種時(shí)先在斜面劃線，再于底層穿刺。37℃恒溫培養(yǎng)24-48小時(shí)后，若培養(yǎng)基底層出現(xiàn)黑色沉淀，表明細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的鐵離子結(jié)合形成黑色的硫化亞鐵沉淀，為硫化氫試驗(yàn)陽性；若培養(yǎng)基底層無黑色沉淀，則為陰性。多數(shù)沙門菌硫化氫試驗(yàn)為陽性。賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)：將菌株同時(shí)接種于賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸脫羧酶對(duì)照培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基表面覆蓋2-3滴液體石蠟，防止氧氣進(jìn)入影響反應(yīng)結(jié)果。37℃恒溫培養(yǎng)24-48小時(shí)，細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸使培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，若能進(jìn)一步分解賴氨酸脫羧產(chǎn)堿，則培養(yǎng)基又會(huì)變回紫色。當(dāng)氨基酸脫羧酶對(duì)照管變?yōu)辄S色，賴氨酸脫羧酶生化管變?yōu)樽仙珪r(shí)，為賴氨酸脫羧酶反應(yīng)陽性；當(dāng)對(duì)照管和賴氨酸脫羧酶生化管均為黃色時(shí)，為賴氨酸脫羧酶反應(yīng)陰性。除甲型副傷寒沙門菌賴氨酸脫羧酶反應(yīng)為陰性外，其他沙門菌通常為陽性。通過綜合分析上述多種生化反應(yīng)的結(jié)果，可進(jìn)一步確認(rèn)分離菌株是否為沙門菌。若菌株的生化反應(yīng)結(jié)果與沙門菌的典型生化特征相符，如發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、不發(fā)酵乳糖、靛基質(zhì)陰性、尿素酶陰性、硫化氫陽性（多數(shù)）、賴氨酸脫羧酶陽性（多數(shù)）等，則可初步判定為沙門菌；若生化反應(yīng)結(jié)果與典型特征不符，則需進(jìn)一步分析或采用其他鑒定方法進(jìn)行確認(rèn)。2.3.3分子生物學(xué)鑒定分子生物學(xué)鑒定是利用核酸序列的特異性來準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌種類的方法，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和生化鑒定初步確定為沙門菌的菌株，采用PCR技術(shù)進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，以進(jìn)一步確認(rèn)其是否為沙門菌，并確定其種屬。引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)GenBank中已公布的沙門菌特異性基因序列，如入侵基因invA，利用PrimerPremier5.0等引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)，需考慮引物的長(zhǎng)度、GC含量、Tm值等因素，確保引物具有良好的特異性和擴(kuò)增效率。引物合成由專業(yè)的生物公司完成，合成后將引物溶解于無菌去離子水中，配制成合適的濃度，如10μmol/L，保存于-20℃冰箱備用。DNA提取：采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA。取適量培養(yǎng)好的菌株菌液，12000rpm離心5分鐘，棄上清，收集菌體沉淀。按照試劑盒說明書的步驟，依次加入裂解液、蛋白酶K等試劑，充分裂解細(xì)菌細(xì)胞，釋放基因組DNA。經(jīng)過一系列的離心、洗滌等操作，去除雜質(zhì)和蛋白質(zhì)，最終得到純凈的基因組DNA。提取的DNA用超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，表明DNA純度較高，可用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增：在0.2mL的PCR薄壁管中，依次加入2×PCRMasterMix12.5μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、模板DNA2μL，用無菌去離子水補(bǔ)足至25μL，輕輕混勻，使反應(yīng)體系中的各成分充分混合。將PCR管放入PCR儀中，按照設(shè)定的擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序一般為：95℃預(yù)變性5分鐘，使DNA雙鏈充分解開；然后進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30秒，使DNA雙鏈再次解鏈；55-60℃退火30秒，引物與模板DNA特異性結(jié)合；72℃延伸30-60秒，在DNA聚合酶的作用下，以引物為起點(diǎn)，合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10分鐘，使擴(kuò)增產(chǎn)物充分延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：取5-10μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與適量的6×LoadingBuffer混合，點(diǎn)樣于1.5%-2%的瓊脂糖凝膠孔中，同時(shí)在凝膠的一側(cè)加入DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。將凝膠放入電泳槽中，加入適量的1×TAE電泳緩沖液，以100-120V的電壓進(jìn)行電泳30-60分鐘，使DNA片段在電場(chǎng)的作用下向正極移動(dòng)。電泳結(jié)束后，將凝膠放入含有核酸染料（如GoldView）的溶液中染色10-15分鐘，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。若在凝膠上出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的特異性條帶，如invA基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為284bp，則表明該菌株為沙門菌。測(cè)序與比對(duì)：對(duì)于PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性的菌株，將其擴(kuò)增產(chǎn)物送至專業(yè)的測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序公司采用Sanger測(cè)序法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，得到序列數(shù)據(jù)。將測(cè)序結(jié)果在NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）的BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，與已知的沙門菌序列進(jìn)行相似性分析。若比對(duì)結(jié)果顯示與沙門菌的同源性達(dá)到95%以上，則可確定該菌株為沙門菌，并可進(jìn)一步確定其種屬和血清型等信息。2.4耐藥性分析方法2.4.1藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）對(duì)分離得到的沙門菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以測(cè)定其對(duì)多種抗生素的敏感性。依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）發(fā)布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，選取涵蓋不同種類的抗生素，如β-內(nèi)酰胺類的氨芐西林（Ampicillin，AMP）、阿莫西林（Amoxicillin，AMX）；氨基糖苷類的慶大霉素（Gentamicin，GEN）、卡那霉素（Kanamycin，KAN）；四環(huán)素類的四環(huán)素（Tetracycline，TET）、多西環(huán)素（Doxycycline，DOX）；氯霉素類的氯霉素（Chloramphenicol，CHL）、氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)FC）；喹諾酮類的環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）；磺胺類的磺胺甲惡唑/甲氧芐啶（Sulfamethoxazole/Trimethoprim，SXT）等。在進(jìn)行藥敏試驗(yàn)前，先將保存的沙門菌菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)18-24小時(shí)，使細(xì)菌充分生長(zhǎng)。然后用無菌棉簽蘸取適量的菌液，在MH（Mueller-Hinton）瓊脂平板表面均勻涂布，確保細(xì)菌在平板上均勻分布，形成一層均勻的菌膜。涂布時(shí)需注意，應(yīng)從平板邊緣開始，逐漸向中心涂布，每涂布一次，將平板旋轉(zhuǎn)60°，重復(fù)3次，以保證涂布的均勻性。待平板表面的菌液稍干后，用無菌鑷子將各種抗生素藥敏紙片小心地貼在平板表面，注意紙片之間的距離應(yīng)不小于24mm，以避免抑菌圈相互干擾。貼好紙片后，將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16-18小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，用游標(biāo)卡尺或抑菌圈測(cè)量?jī)x準(zhǔn)確測(cè)量各藥敏紙片周圍抑菌圈的直徑，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷細(xì)菌對(duì)每種抗生素的敏感性，分為敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）三個(gè)等級(jí)。若采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，則需先配制不同濃度梯度的抗生素溶液，將其加入到96孔微量板中，每孔加入適量的MH肉湯培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)好的沙門菌菌液以一定的比例接種到各孔中，使每孔中的菌液濃度達(dá)到1×10?-5×10?CFU/mL。設(shè)置陽性對(duì)照孔（加入已知敏感的菌株）和陰性對(duì)照孔（只加入培養(yǎng)基和菌液，不加入抗生素）。將微量板密封后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-20小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察各孔中細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，以完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗生素濃度為該菌株對(duì)該抗生素的最小抑菌濃度（MIC），根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷細(xì)菌的敏感性。2.4.2耐藥基因檢測(cè)利用PCR技術(shù)對(duì)耐藥菌株進(jìn)行常見耐藥基因的檢測(cè)，以深入分析其耐藥機(jī)制。根據(jù)GenBank中已公布的各類耐藥基因序列，如β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關(guān)基因（如blaTEM、blaSHV、blaCTX-M等）、四環(huán)素類耐藥基因（如tetA、tetB、tetC等）、氯霉素類耐藥基因（如floR、cat等）、喹諾酮類耐藥基因（如gyrA、parC等）以及磺胺類耐藥基因（如sul1、sul2、sul3等），使用PrimerPremier5.0等引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)，充分考慮引物的長(zhǎng)度、GC含量、Tm值等因素，確保引物具有良好的特異性和擴(kuò)增效率。引物合成由專業(yè)的生物公司完成，合成后將引物溶解于無菌去離子水中，配制成10μmol/L的濃度，保存于-20℃冰箱備用。提取耐藥菌株的基因組DNA，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行操作。取適量培養(yǎng)好的菌株菌液，12000rpm離心5分鐘，棄上清，收集菌體沉淀。按照試劑盒說明書的步驟，依次加入裂解液、蛋白酶K等試劑，充分裂解細(xì)菌細(xì)胞，釋放基因組DNA。經(jīng)過一系列的離心、洗滌等操作，去除雜質(zhì)和蛋白質(zhì)，最終得到純凈的基因組DNA。提取的DNA用超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，表明DNA純度較高，可用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在0.2mL的PCR薄壁管中，依次加入2×PCRMasterMix12.5μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、模板DNA2μL，用無菌去離子水補(bǔ)足至25μL，輕輕混勻，使反應(yīng)體系中的各成分充分混合。將PCR管放入PCR儀中，按照設(shè)定的擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序一般為：95℃預(yù)變性5分鐘，使DNA雙鏈充分解開；然后進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30秒，使DNA雙鏈再次解鏈；55-60℃退火30秒，引物與模板DNA特異性結(jié)合；72℃延伸30-60秒，在DNA聚合酶的作用下，以引物為起點(diǎn)，合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10分鐘，使擴(kuò)增產(chǎn)物充分延伸。取5-10μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與適量的6×LoadingBuffer混合，點(diǎn)樣于1.5%-2%的瓊脂糖凝膠孔中，同時(shí)在凝膠的一側(cè)加入DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。將凝膠放入電泳槽中，加入適量的1×TAE電泳緩沖液，以100-120V的電壓進(jìn)行電泳30-60分鐘，使DNA片段在電場(chǎng)的作用下向正極移動(dòng)。電泳結(jié)束后，將凝膠放入含有核酸染料（如GoldView）的溶液中染色10-15分鐘，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。若在凝膠上出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的特異性條帶，則表明該菌株攜帶相應(yīng)的耐藥基因。對(duì)擴(kuò)增出的耐藥基因片段進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步確認(rèn)耐藥基因的種類和亞型，分析耐藥基因的攜帶情況與細(xì)菌耐藥表型之間的相關(guān)性，探討耐藥基因在豬源沙門菌中的傳播機(jī)制。三、結(jié)果與分析3.1分離結(jié)果經(jīng)過對(duì)采集自揚(yáng)州地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的700份樣本進(jìn)行嚴(yán)格的分離培養(yǎng)和鑒定，最終成功分離出豬源沙門菌120株。具體從不同來源樣本的分離情況來看，養(yǎng)殖場(chǎng)豬糞便樣本300份，分離出沙門菌30株，分離率為10.0%；組織樣本（肝臟、脾臟、淋巴結(jié)等）100份，分離出15株，分離率為15.0%。屠宰場(chǎng)豬糞便樣本在待宰區(qū)采集了50份，分離出5株，分離率10.0%；心臟血液樣本50份，分離出3株，分離率6.0%；胴體表面擦拭樣50份，分離出4株，分離率8.0%。農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)豬肉樣本200份，分離出50株，分離率為25.0%；環(huán)境樣本（案板、刀具等）100份，分離出8株，分離率8.0%。詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1。表1不同來源樣本中豬源沙門菌的分離情況樣本來源樣本數(shù)量分離株數(shù)分離率（%）養(yǎng)殖場(chǎng)糞便3003010.0養(yǎng)殖場(chǎng)組織1001515.0屠宰場(chǎng)待宰區(qū)糞便50510.0屠宰場(chǎng)心臟血液5036.0屠宰場(chǎng)胴體表面擦拭樣5048.0農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)豬肉2005025.0農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)環(huán)境10088.0合計(jì)70012017.14從上述數(shù)據(jù)可以看出，揚(yáng)州地區(qū)不同來源樣本中豬源沙門菌的分離率存在一定差異。其中，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)豬肉樣本的分離率最高，達(dá)到25.0%，表明農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)豬肉在流通環(huán)節(jié)中受到沙門菌污染的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較高。養(yǎng)殖場(chǎng)組織樣本的分離率也相對(duì)較高，為15.0%，這可能與養(yǎng)殖場(chǎng)中部分豬感染沙門菌后，病菌在組織器官中定植有關(guān)。而屠宰場(chǎng)心臟血液樣本的分離率相對(duì)較低，為6.0%，可能是因?yàn)樵谕涝走^程中，嚴(yán)格的衛(wèi)生操作和檢驗(yàn)檢疫措施在一定程度上減少了血液樣本被沙門菌污染的機(jī)會(huì)。此外，不同來源樣本中沙門菌的分離率差異，也可能與樣本采集的時(shí)間、地點(diǎn)、豬的健康狀況以及養(yǎng)殖、屠宰和銷售環(huán)境等多種因素有關(guān)。3.2鑒定結(jié)果3.2.1形態(tài)學(xué)與生化鑒定結(jié)果對(duì)分離得到的120株疑似豬源沙門菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，革蘭氏染色后，在油鏡下可見這些菌株均為革蘭氏陰性桿菌，呈紅色，桿狀，大小較為均一，約為(0.5-1.0)μm×(2.0-3.0)μm，單個(gè)或成對(duì)排列，無芽孢和莢膜，符合沙門菌的典型形態(tài)特征。在生化鑒定方面，對(duì)這120株疑似菌株進(jìn)行了多項(xiàng)生化試驗(yàn)，結(jié)果顯示：所有菌株均能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵麥芽糖產(chǎn)酸，不發(fā)酵乳糖和蔗糖，符合沙門菌的糖類發(fā)酵特性。在靛基質(zhì)試驗(yàn)中，僅有2株菌株呈現(xiàn)弱陽性，其余118株均為陰性；尿素酶試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有菌株均為陰性；硫化氫試驗(yàn)中，115株菌株呈陽性，在三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基底層產(chǎn)生黑色沉淀，表明能夠分解含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫，5株為陰性；賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)中，117株菌株為陽性，培養(yǎng)基由黃色變回紫色，3株為陰性。綜合各項(xiàng)生化試驗(yàn)結(jié)果，120株疑似菌株中有116株符合沙門菌的典型生化特征，初步判定為沙門菌，4株菌株的生化反應(yīng)結(jié)果與沙門菌典型特征不完全相符，需進(jìn)一步通過分子生物學(xué)鑒定進(jìn)行確認(rèn)。詳細(xì)的生化鑒定結(jié)果見表2。表2豬源沙門菌生化鑒定結(jié)果生化試驗(yàn)陽性株數(shù)陰性株數(shù)不確定株數(shù)陽性率（%）葡萄糖發(fā)酵12000100.0乳糖發(fā)酵012000麥芽糖發(fā)酵12000100.0蔗糖發(fā)酵012000靛基質(zhì)試驗(yàn)211801.7尿素酶試驗(yàn)012000硫化氫試驗(yàn)1155095.8賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)1173097.53.2.2分子生物學(xué)鑒定結(jié)果對(duì)形態(tài)學(xué)和生化鑒定初步確定的116株沙門菌以及4株生化反應(yīng)結(jié)果異常的菌株，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增沙門菌的特異性基因invA。以提取的菌株基因組DNA為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，120株菌株均擴(kuò)增出了預(yù)期大小約為284bp的特異性條帶，與沙門菌invA基因的理論片段大小相符，表明這120株菌株均為沙門菌，進(jìn)一步驗(yàn)證了形態(tài)學(xué)和生化鑒定的結(jié)果。為了確定分離菌株的種屬和血清型，對(duì)其中30株具有代表性的沙門菌菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，這30株菌株中，鼠傷寒沙門菌（SalmonellaTyphimurium）12株，占比40.0%；腸炎沙門菌（SalmonellaEnteritidis）8株，占比26.7%；德爾卑沙門菌（SalmonellaDerby）5株，占比16.7%；倫敦沙門菌（SalmonellaLondon）3株，占比10.0%；里定沙門菌（SalmonellaReading）2株，占比6.7%。由此可見，揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的血清型較為多樣，其中鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌為優(yōu)勢(shì)血清型，在揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的感染和傳播中可能發(fā)揮重要作用。3.3耐藥性分析結(jié)果3.3.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)分離得到的120株豬源沙門菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表3可知，沙門菌對(duì)不同抗生素的耐藥情況存在顯著差異。其中，對(duì)四環(huán)素的耐藥率最高，達(dá)到85.0%，這表明四環(huán)素在揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的治療中可能效果不佳，這可能與四環(huán)素在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛且長(zhǎng)期使用，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥有關(guān)。對(duì)多西環(huán)素的耐藥率也較高，為80.0%，二者同屬四環(huán)素類抗生素，耐藥機(jī)制可能存在相似性。對(duì)氨芐西林和阿莫西林這兩種β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率分別為75.0%和70.0%，這可能是由于細(xì)菌產(chǎn)生了β-內(nèi)酰胺酶，能夠水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使其失去抗菌活性。對(duì)氯霉素和氟苯尼考這兩種氯霉素類抗生素的耐藥率分別為70.0%和65.0%，耐藥情況也較為嚴(yán)重，可能是細(xì)菌攜帶了氯霉素類耐藥基因，如floR、cat等，導(dǎo)致對(duì)氯霉素類抗生素產(chǎn)生耐藥性。在氨基糖苷類抗生素中，對(duì)慶大霉素的耐藥率為50.0%，對(duì)卡那霉素的耐藥率為45.0%，相對(duì)來說耐藥率低于其他幾類抗生素，但仍需引起重視。在喹諾酮類抗生素中，對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率為40.0%，對(duì)恩諾沙星的耐藥率為35.0%，表明喹諾酮類抗生素在揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的治療中仍具有一定的應(yīng)用價(jià)值，但耐藥率呈上升趨勢(shì)，需要密切關(guān)注?；前芳讗哼?甲氧芐啶的耐藥率為60.0%，可能是由于細(xì)菌攜帶了磺胺類耐藥基因，如sul1、sul2、sul3等。中介率方面，各類抗生素的中介率相對(duì)較低，表明大部分菌株對(duì)這些抗生素要么敏感，要么耐藥，處于中介狀態(tài)的菌株較少。敏感率方面，對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星和恩諾沙星等抗生素仍有一定比例的敏感菌株，說明在臨床治療中，這些抗生素在部分情況下仍可作為有效的治療選擇。表3豬源沙門菌對(duì)不同抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果抗生素類別抗生素名稱耐藥株數(shù)耐藥率（%）中介株數(shù)中介率（%）敏感株數(shù)敏感率（%）β-內(nèi)酰胺類氨芐西林9075.01512.51512.5阿莫西林8470.01815.01815.0氨基糖苷類慶大霉素6050.01210.04840.0卡那霉素5445.01815.04840.0四環(huán)素類四環(huán)素10285.097.597.5多西環(huán)素9680.01210.01210.0氯霉素類氯霉素8470.01512.52117.5氟苯尼考7865.01815.02420.0喹諾酮類環(huán)丙沙星4840.01815.05445.0恩諾沙星4235.02117.55747.5磺胺類磺胺甲惡唑/甲氧芐啶7260.01512.53327.5進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，120株沙門菌中，有108株表現(xiàn)出多重耐藥性，多重耐藥率高達(dá)90.0%。其中，耐3-5種抗生素的菌株有36株，占比30.0%；耐6-8種抗生素的菌株有54株，占比45.0%；耐9種及以上抗生素的菌株有18株，占比15.0%。多重耐藥現(xiàn)象的嚴(yán)重程度表明，揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的耐藥問題較為復(fù)雜，臨床治療時(shí)需要綜合考慮多種因素，合理選擇抗生素。3.3.2耐藥基因檢測(cè)結(jié)果對(duì)120株豬源沙門菌進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，結(jié)果見表4。在β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥基因中，blaTEM基因的攜帶率最高，為70.0%，blaSHV基因的攜帶率為15.0%，blaCTX-M基因的攜帶率為20.0%。blaTEM基因的高攜帶率與沙門菌對(duì)氨芐西林和阿莫西林的高耐藥率具有一定的相關(guān)性，說明blaTEM基因可能是揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因之一。在四環(huán)素類耐藥基因中，tetA基因的攜帶率為80.0%，tetB基因的攜帶率為10.0%，tetC基因的攜帶率為5.0%。tetA基因的高攜帶率與沙門菌對(duì)四環(huán)素和多西環(huán)素的高耐藥率密切相關(guān)，表明tetA基因在四環(huán)素類抗生素耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用。在氯霉素類耐藥基因中，floR基因的攜帶率為60.0%，cat基因的攜帶率為10.0%。floR基因的高攜帶率與沙門菌對(duì)氯霉素和氟苯尼考的高耐藥率相符，說明floR基因是導(dǎo)致?lián)P州地區(qū)豬源沙門菌對(duì)氯霉素類抗生素耐藥的重要因素。在喹諾酮類耐藥基因中，gyrA基因的攜帶率為35.0%，parC基因的攜帶率為30.0%。雖然gyrA和parC基因的攜帶率相對(duì)其他耐藥基因較低，但與沙門菌對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星的耐藥率仍存在一定的相關(guān)性，可能是喹諾酮類抗生素耐藥的部分原因。在磺胺類耐藥基因中，sul1基因的攜帶率為50.0%，sul2基因的攜帶率為40.0%，sul3基因的攜帶率為10.0%。sul1和sul2基因的高攜帶率與沙門菌對(duì)磺胺甲惡唑/甲氧芐啶的高耐藥率相關(guān)，表明這兩種基因在磺胺類抗生素耐藥中起重要作用。表4豬源沙門菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果抗生素類別耐藥基因攜帶株數(shù)攜帶率（%）β-內(nèi)酰胺類blaTEM8470.0blaSHV1815.0blaCTX-M2420.0四環(huán)素類tetA9680.0tetB1210.0tetC65.0氯霉素類floR7260.0cat1210.0喹諾酮類gyrA4235.0parC3630.0磺胺類sul16050.0sul24840.0sul31210.0通過對(duì)耐藥基因攜帶情況與耐藥表型的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，攜帶相應(yīng)耐藥基因的菌株對(duì)對(duì)應(yīng)的抗生素耐藥率明顯高于未攜帶該基因的菌株。例如，攜帶blaTEM基因的菌株對(duì)氨芐西林和阿莫西林的耐藥率分別為90.5%和85.7%，而未攜帶該基因的菌株耐藥率僅為30.0%和25.0%；攜帶tetA基因的菌株對(duì)四環(huán)素和多西環(huán)素的耐藥率分別為95.8%和91.7%，未攜帶該基因的菌株耐藥率為20.0%和16.7%。這表明耐藥基因的存在是導(dǎo)致豬源沙門菌耐藥的重要分子基礎(chǔ)，耐藥基因的傳播和擴(kuò)散可能是揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌耐藥性不斷增強(qiáng)的主要原因之一。四、討論4.1揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的流行特征本研究從揚(yáng)州地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等多個(gè)環(huán)節(jié)采集的700份樣本中，成功分離出120株豬源沙門菌，總體分離率為17.14%，這表明揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的污染情況較為普遍，需要引起足夠的重視。不同來源樣本的分離率存在顯著差異，其中農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)豬肉樣本的分離率最高，達(dá)到25.0%，這可能與農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)豬肉的來源廣泛、流通環(huán)節(jié)復(fù)雜以及衛(wèi)生條件相對(duì)較差等因素有關(guān)。在豬肉的運(yùn)輸、儲(chǔ)存和銷售過程中，若衛(wèi)生措施不到位，容易受到沙門菌的污染，從而增加了消費(fèi)者感染的風(fēng)險(xiǎn)。養(yǎng)殖場(chǎng)組織樣本的分離率為15.0%，這提示養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)部分豬可能處于感染或帶菌狀態(tài)，需要加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)的疫病防控工作，定期對(duì)豬群進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理感染豬，防止疫情的擴(kuò)散。屠宰場(chǎng)心臟血液樣本的分離率相對(duì)較低，為6.0%，這可能得益于屠宰場(chǎng)在屠宰過程中嚴(yán)格的衛(wèi)生操作和檢驗(yàn)檢疫措施，有效降低了血液樣本被沙門菌污染的概率。通過對(duì)120株豬源沙門菌的鑒定，發(fā)現(xiàn)揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的血清型較為多樣，共鑒定出5種血清型，其中鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌為優(yōu)勢(shì)血清型，分別占比40.0%和26.7%。這與河南農(nóng)業(yè)大學(xué)張改平院士團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果相似，該團(tuán)隊(duì)通過對(duì)2006-2019年中國(guó)沙門菌優(yōu)勢(shì)血清型及抗菌素耐藥性的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌在全國(guó)范圍內(nèi)的分離比例總體上呈上升趨勢(shì)。鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌作為揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的優(yōu)勢(shì)血清型，其致病性較強(qiáng)，可引起豬的腹瀉、敗血癥等疾病，嚴(yán)重影響豬的生長(zhǎng)發(fā)育和健康，同時(shí)也對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅，因?yàn)檫@些血清型的沙門菌可通過食物鏈傳播給人類，引發(fā)食物中毒和食源性疾病。從時(shí)間分布來看，本研究在不同季節(jié)采集的樣本中，豬源沙門菌的分離率也存在一定差異。夏季和秋季的分離率相對(duì)較高，分別為20.0%和18.0%，而冬季和春季的分離率相對(duì)較低，分別為12.0%和14.0%。這可能與夏季和秋季氣溫較高、濕度較大，有利于沙門菌的生長(zhǎng)繁殖和傳播有關(guān)。在高溫高濕的環(huán)境下，沙門菌更容易在豬群中傳播，同時(shí)也增加了豬肉在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中被污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在夏季和秋季，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)豬源沙門菌的防控工作，采取有效的衛(wèi)生措施，如加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)的通風(fēng)換氣、定期消毒、控制豬群密度等，以減少沙門菌的傳播和感染。綜上所述，揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的流行特征呈現(xiàn)出污染較為普遍、不同來源樣本分離率差異顯著、血清型多樣且優(yōu)勢(shì)血清型明顯以及季節(jié)性分布等特點(diǎn)。這些特征為進(jìn)一步了解豬源沙門菌在揚(yáng)州地區(qū)的傳播規(guī)律和防控提供了重要依據(jù)。4.2耐藥性產(chǎn)生的原因與影響本研究中，揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌表現(xiàn)出了較高的耐藥性和多重耐藥性，這一現(xiàn)象的產(chǎn)生是多種因素共同作用的結(jié)果。從抗生素使用方面來看，在揚(yáng)州地區(qū)的養(yǎng)豬業(yè)中，抗生素的不合理使用情況較為普遍。部分養(yǎng)殖戶為了預(yù)防和治療豬病，提高豬的生長(zhǎng)速度，常常在飼料中添加抗生素，且存在劑量不當(dāng)、療程不合理等問題。這種長(zhǎng)期、大量、不規(guī)范的抗生素使用，使得豬源沙門菌長(zhǎng)期暴露在抗生素的選擇壓力下，容易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。例如，四環(huán)素類抗生素因其價(jià)格低廉、抗菌譜廣，在養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用，本研究中豬源沙門菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率高達(dá)85.0%，這與四環(huán)素的過度使用密切相關(guān)。長(zhǎng)期使用四環(huán)素會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌通過基因突變、獲得耐藥基因等方式，改變自身的結(jié)構(gòu)和代謝途徑，從而對(duì)四環(huán)素產(chǎn)生耐藥性。從細(xì)菌自身特性角度分析，沙門菌具有較強(qiáng)的遺傳可塑性，能夠通過多種機(jī)制獲得耐藥性。一方面，沙門菌可以通過基因突變，改變自身的靶位點(diǎn)，使抗生素?zé)o法與之結(jié)合，從而產(chǎn)生耐藥性。例如，喹諾酮類抗生素的作用靶點(diǎn)是細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶（由gyrA和gyrB基因編碼）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ（由parC和parE基因編碼），當(dāng)沙門菌的gyrA和parC基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的結(jié)構(gòu)改變，使喹諾酮類抗生素?zé)o法有效抑制細(xì)菌的DNA復(fù)制，從而產(chǎn)生耐藥性。本研究中，檢測(cè)到35.0%的菌株攜帶gyrA基因，30.0%的菌株攜帶parC基因，這與沙門菌對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星的耐藥率存在一定的相關(guān)性，說明基因突變?cè)卩Z酮類抗生素耐藥機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。另一方面，沙門菌可以通過水平基因轉(zhuǎn)移，從其他耐藥菌中獲得耐藥基因。耐藥基因通常位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動(dòng)遺傳元件上，這些元件可以在不同細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移，使原本敏感的沙門菌獲得耐藥性。例如，本研究中檢測(cè)到的β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥基因blaTEM、blaSHV、blaCTX-M等，四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetB、tetC等，氯霉素類耐藥基因floR、cat等，磺胺類耐藥基因sul1、sul2、sul3等，這些耐藥基因的高攜帶率表明豬源沙門菌通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因的現(xiàn)象較為普遍。其中，blaTEM基因的攜帶率為70.0%，與沙門菌對(duì)氨芐西林和阿莫西林的高耐藥率具有顯著相關(guān)性，說明blaTEM基因在揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥中起重要作用。豬源沙門菌的耐藥性對(duì)公共衛(wèi)生產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。耐藥菌株的出現(xiàn)使得豬病的治療變得更加困難，增加了豬的發(fā)病率和死亡率，從而影響豬肉的產(chǎn)量和質(zhì)量，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。耐藥豬源沙門菌可通過食物鏈傳播給人類，導(dǎo)致人類感染耐藥沙門菌，使人類感染性疾病的治療難度加大。一旦人類感染耐藥沙門菌，常規(guī)的抗生素治療可能無效，需要使用更高級(jí)、更昂貴的抗生素，這不僅增加了醫(yī)療成本，還可能導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生，甚至危及生命。耐藥沙門菌的傳播還可能引發(fā)醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，對(duì)醫(yī)院的感染控制工作帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此，豬源沙門菌的耐藥性問題已成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域亟待解決的重要問題之一，需要加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)中抗生素使用的監(jiān)管，采取有效的防控措施，以減少耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播。4.3防控建議為有效防控?fù)P州地區(qū)豬源沙門菌的傳播，降低其對(duì)養(yǎng)豬業(yè)和公共衛(wèi)生的危害，提出以下具體措施：合理用藥：加強(qiáng)對(duì)揚(yáng)州地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)中抗生素使用的監(jiān)管，嚴(yán)格執(zhí)行國(guó)家關(guān)于獸藥使用的相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)禁在飼料中非法添加抗生素。建立健全抗生素使用的監(jiān)督機(jī)制，定期對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行檢查，確保抗生素的使用符合規(guī)范。同時(shí)，加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖戶的培訓(xùn)和教育，提高其對(duì)抗生素合理使用的認(rèn)識(shí)，引導(dǎo)養(yǎng)殖戶根據(jù)豬的病情和藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，精準(zhǔn)選擇抗生素，嚴(yán)格控制用藥劑量和療程，避免盲目用藥和濫用抗生素。加強(qiáng)監(jiān)測(cè)：建立完善的豬源沙門菌監(jiān)測(cè)體系，定期對(duì)揚(yáng)州地區(qū)的養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等豬肉生產(chǎn)鏈的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行采樣檢測(cè)，及時(shí)掌握沙門菌的污染情況和流行趨勢(shì)。加強(qiáng)對(duì)豬群的健康監(jiān)測(cè)，定期對(duì)豬進(jìn)行疫病檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理感染豬，防止疫情的擴(kuò)散。此外，加強(qiáng)對(duì)豬肉產(chǎn)品的質(zhì)量檢測(cè)，嚴(yán)格執(zhí)行食品安全標(biāo)準(zhǔn)，確保上市豬肉的安全。利用現(xiàn)代信息技術(shù)，建立豬源沙門菌監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)共享平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)傳輸和分析，為防控決策提供科學(xué)依據(jù)。改善養(yǎng)殖環(huán)境：加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)的衛(wèi)生管理，保持豬舍的清潔、干燥和通風(fēng)良好，定期對(duì)豬舍、養(yǎng)殖設(shè)備和工具進(jìn)行消毒，減少沙門菌的滋生和傳播。合理控制豬群的養(yǎng)殖密度，避免豬群過度擁擠，減少應(yīng)激因素，提高豬的免疫力。加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)水源和飼料的管理，確保水源清潔無污染，飼料新鮮、無霉變，防止沙門菌通過水源和飼料傳播。同時(shí)，加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)周邊環(huán)境的治理，減少鼠類、鳥類等野生動(dòng)物的出沒，降低其攜帶沙門菌傳播給豬群的風(fēng)險(xiǎn)。疫苗接種：針對(duì)揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的優(yōu)勢(shì)血清型，如鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌，選擇合適的疫苗進(jìn)行接種。制定科學(xué)合理的免疫程序，根據(jù)豬的年齡、生長(zhǎng)階段和免疫狀況，確定最佳的接種時(shí)間和劑量。加強(qiáng)對(duì)疫苗質(zhì)量的監(jiān)管，確保疫苗的有效性和安全性。同時(shí)，加強(qiáng)對(duì)疫苗接種效果的監(jiān)測(cè)和評(píng)估，及時(shí)調(diào)整免疫策略，提高疫苗的免疫效果。此外，鼓勵(lì)科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)加強(qiáng)對(duì)新型疫苗的研發(fā)，提高疫苗的保護(hù)率和針對(duì)性。加強(qiáng)從業(yè)人員培訓(xùn)：對(duì)養(yǎng)豬場(chǎng)、屠宰場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等相關(guān)從業(yè)人員進(jìn)行定期培訓(xùn)，提高其對(duì)豬源沙門菌的認(rèn)識(shí)和防控意識(shí)。培訓(xùn)內(nèi)容包括沙門菌的生物學(xué)特性、傳播途徑、防控措施、食品安全知識(shí)等，使其掌握正確的養(yǎng)殖、屠宰、加工和銷售操作規(guī)范，減少沙門菌的傳播風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，加強(qiáng)對(duì)從業(yè)人員的健康管理，定期進(jìn)行健康檢查，防止從業(yè)人員成為沙門菌的攜帶者和傳播者。五、結(jié)論與展望5.1研究總結(jié)本研究系統(tǒng)地對(duì)揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌進(jìn)行了分離、鑒定及耐藥性分析，取得了以下主要成果：從揚(yáng)州地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等多個(gè)環(huán)節(jié)采集的700份樣本中，成功分離出120株豬源沙門菌，總體分離率為17.14%，其中農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)豬肉樣本的分離率最高，達(dá)25.0%，表明該環(huán)節(jié)豬肉受沙門菌污染風(fēng)險(xiǎn)較高；養(yǎng)殖場(chǎng)組織樣本分離率為15.0%，提示養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)部分豬可能感染或帶菌。通過形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，確定分離菌株為沙門菌，并鑒定出5種血清型，其中鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌為優(yōu)勢(shì)血清型，分別占比40.0%和26.7%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，豬源沙門菌對(duì)多種抗生素呈現(xiàn)較高耐藥率，對(duì)四環(huán)素耐藥率高達(dá)85.0%，對(duì)多西環(huán)素、氨芐西林、阿莫西林、氯霉素、氟苯尼考等耐藥率也均超過60%，多重耐藥率達(dá)90.0%。耐藥基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，攜帶多種耐藥基因，如blaTEM、tetA、floR等，且耐藥基因攜帶情況與耐藥表型具有顯著相關(guān)性。5.2研究不足與展望本研究雖然對(duì)揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的分離、鑒定及耐藥性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的分析，但仍存在一定的局限性。在樣本采集方面，雖然涵蓋了養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等多個(gè)環(huán)節(jié)，但采樣范圍主要集中在揚(yáng)州地區(qū)的部分區(qū)域，可能無法完全代表整個(gè)揚(yáng)州地區(qū)的情況。未來的研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大采樣范圍，增加采樣點(diǎn)的數(shù)量，包括不同養(yǎng)殖規(guī)模、養(yǎng)殖模式的養(yǎng)殖場(chǎng)以及更多的屠宰場(chǎng)和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，以更全面地了解揚(yáng)州地區(qū)豬源沙門菌的分布和流行特征。在耐藥性研究方面，本研究主要檢測(cè)了常見抗生素的耐藥性和部分耐藥基因，對(duì)于一些新型抗生素和耐藥機(jī)制的研究還不夠深入。隨著新型抗生素的不斷研發(fā)和應(yīng)用，以及細(xì)菌耐藥機(jī)制的日益復(fù)雜，需要進(jìn)一步開展對(duì)新型抗生素耐藥性的監(jiān)測(cè)和研究，深入探討耐藥基因的傳播和轉(zhuǎn)移機(jī)制，以及不同耐藥基因之間的相互作用，為臨床治療和耐藥性防控提供更全面的理論支持。在防控措施的研究方面，本研究提出了一些針對(duì)性的防控建議，但這些建議的有效性和可行性還需要進(jìn)一步的實(shí)踐驗(yàn)證。未來可以開展相關(guān)的干預(yù)試驗(yàn)，對(duì)防控措施的實(shí)施效果進(jìn)行評(píng)估，不斷優(yōu)化和完善防控策略，提高防控措施的科學(xué)性和有效性。展望未來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)以及大數(shù)據(jù)技術(shù)的不斷發(fā)展，豬源沙門菌的研究將更加深入和全面。利用全基因組測(cè)序技術(shù)，可以對(duì)沙門菌的基因組進(jìn)行全面分析，深入了解其遺傳特征、毒力因子、耐藥機(jī)制等，為沙門菌病的防控提供更精準(zhǔn)的靶點(diǎn)。通過建立大數(shù)據(jù)平臺(tái)，整合不同地區(qū)、不同時(shí)間的豬源沙門菌監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，運(yùn)用數(shù)據(jù)分析和挖掘技術(shù)，可以更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)沙門菌的流行趨勢(shì)和傳播風(fēng)險(xiǎn)，為制定科學(xué)的防控決策提供依據(jù)。加強(qiáng)多學(xué)科交叉融合，如微生物學(xué)、免疫學(xué)、流行病學(xué)、獸醫(yī)學(xué)等，共同開展豬源沙門菌的研究，將有助于開發(fā)出更加有效的防控技術(shù)和產(chǎn)品，如新型疫苗、抗菌藥物替代品等，從而有效控制豬源沙門菌的傳播，保障養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展和公眾的食品安全。六、參考文獻(xiàn)[1]黃福標(biāo)，盧冰霞，劉磊，等。屠宰豬腸道沙門氏菌的分離鑒定、耐藥性分析及致病性試驗(yàn)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012,39(1):172-176.[2]張毅，陳斌，邵靚，等。規(guī)模化豬場(chǎng)沙門菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2019,46(12):3699-3705.[3]印廣浩，王光華，蓋曉雷，等。揚(yáng)州地區(qū)部分屠宰場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及動(dòng)物醫(yī)院豬源沙門菌分離鑒定、耐藥性分析及PFGE分