第四章微生物細(xì)胞的破碎

知識點：細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)，微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)，破碎率的測定。重點：工業(yè)生產(chǎn)中常用的幾種細(xì)胞破碎方法的原理，操作過程及常用設(shè)備，并能就實際生產(chǎn)情況予以合理的選擇。難點：常用破碎方法的合理選用。1精品ppt2精品ppt3精品ppt為了研究細(xì)胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各種微生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)（表1）：微生物革蘭氏陽性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白質(zhì)（6-8%）脂類（8.5-13.5%）多聚糖（80-90%）脂類蛋白質(zhì)一、細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)4精品ppt5精品ppt6精品ppt7精品ppt8精品ppt9精品ppt細(xì)菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難度越大，革蘭氏陰性細(xì)菌網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不及革蘭氏陽性細(xì)菌的堅固；酵母細(xì)胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度；由于霉菌細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強度比細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁有所提高。不同種類的細(xì)胞結(jié)構(gòu)差別很大，破碎的難易程度也不同，由難到易的大致排列順序為：植物細(xì)胞＞真菌（如霉菌、酵母菌）＞革蘭氏陽性細(xì)菌＞革蘭氏陰性細(xì)菌＞動物細(xì)胞。10精品ppt11精品ppt二、常用破碎方法分類作用機理適應(yīng)性機械法珠磨法固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難高壓勻漿法液體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和含有包含體的基因工程菌超聲破碎法液體剪切作用對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合非機械法酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價格高，通用性差化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜的滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差滲透壓法滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，不適合對冷凍敏感目的產(chǎn)物干燥法改變細(xì)胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活12精品ppt細(xì)胞破碎機理圖13精品ppt進(jìn)入珠磨機的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。1.珠磨法（Beadmill）原理：14精品ppt高速珠磨機15精品ppt實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎設(shè)備有Mickle高速組織搗碎機、Braun勻漿器；中試規(guī)模的細(xì)胞破碎可采用膠質(zhì)磨處理；在工業(yè)規(guī)模中，可采用高速珠磨機（瑞士WAB公司和德國西門子機械公司制造）。16精品ppt膠體磨德國進(jìn)口珠磨機17精品ppt18精品ppt破碎作用方程破碎作用是相對于時間的一級反應(yīng)速度過程，符合下列公式：

ln[1/(1-R)]=Kt

其中R—破碎率；

K一一級反應(yīng)速度常數(shù)；

t一時間。一級反應(yīng)速度常數(shù)K與許多操作參數(shù)有關(guān)，如如攪拌轉(zhuǎn)速、細(xì)胞懸浮液的濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠的裝量和珠體的直徑，以及溫度等。19精品ppt操作條件的選擇：珠體大小——根據(jù)細(xì)胞大小、濃度以及連續(xù)操作時不使珠體帶出來選擇。珠體裝量——裝量少時，細(xì)胞不易破碎；裝量大時，能量消耗大，研磨室熱擴散性能降低，引起溫度升高。溫度——溫度高時細(xì)胞較易破碎，但要考慮目的產(chǎn)物不受破壞。一般溫度控制在5～40℃內(nèi)時影響較小。攪拌轉(zhuǎn)速——過高將使能量消耗大增，而破碎率上升不明顯。

能耗

R n20精品ppt21精品ppt22精品ppt23精品ppt24精品ppt珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗減少大分子目的產(chǎn)物的失活減少由于高破碎率產(chǎn)生的細(xì)胞小碎片不易分離而給后續(xù)操作帶來的困難。25精品ppt采用高壓勻漿器（由高壓泵和勻漿閥組成，英國APV公司和美國Microfluidics公司均有產(chǎn)品出售）。2.高壓勻漿法（High-pressurehomogenization）——大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)使細(xì)胞破碎，細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每秒速度高達(dá)幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運動過程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞破碎。原理：26精品ppt高壓勻漿器27精品ppt28精品ppt大、中、小型高壓勻漿器29精品ppt破碎的動力學(xué)方程為：ln[1／（l－R）]＝KNPα

其中R——破碎率；

K——與溫度有關(guān)的速度常數(shù)；

P一操作壓力；

N一懸浮液通過勻漿器閥的次數(shù)。

α——與微生物種類有關(guān)的常數(shù)；破碎酵母菌,α值可取2.2?？梢?，影響破碎的主要因素是壓力、溫度和通過勻漿器閥的次數(shù)。30精品ppt31精品ppt32精品ppt在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對于酵母等難破碎的及高濃度的細(xì)胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。一般說來，酵母菌較細(xì)菌難破碎，處于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞較處于快速生長狀態(tài)的細(xì)胞難破碎，在復(fù)合培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)胞比在簡單合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)胞較難破碎。

易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌較小的革蘭氏陽性菌含有包含體的基因工程菌（因包含體堅硬，易損傷勻漿閥）不宜采用高壓勻漿法的細(xì)胞類型：33精品ppt思考問題：比較高壓勻漿法與珠磨法的異同點？34精品ppt35精品ppt3.噴霧撞擊破碎細(xì)胞彈性體剛性體噴霧撞擊破碎器結(jié)構(gòu)簡圖36精品ppt

細(xì)胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)（每分鐘數(shù)千攝氏度），形成粒徑小于5微米的微粒子。高速載氣，氮氣流速300m/s，將凍結(jié)的微粒子送入破碎室，高速沖向撞擊板，得以破碎。3.噴霧撞擊破碎37精品ppt噴霧撞擊特點：（1）細(xì)胞破碎僅發(fā)生在與撞擊板撞擊的一瞬，細(xì)胞破碎度均勻，可避免細(xì)胞反復(fù)受力發(fā)生過度破碎現(xiàn)象。（2）細(xì)胞破碎程度可通過無極調(diào)節(jié)載氣壓力（流速）控制，避免胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的破壞，適用于細(xì)胞器（葉綠體、線粒體）的回收。噴霧撞擊破碎特點38精品ppt噴霧撞擊適用于微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的破碎，通常處理懸浮液質(zhì)量控制濃度為100-200g/L。實驗室規(guī)模的撞擊破碎器間歇處理能力為50-500mL/h，而工業(yè)規(guī)模的處理能力為10L/h。與其他機械法一樣，此種破碎方法也會造成操作系統(tǒng)的溫度上升，破壞生物產(chǎn)品的生物活性，單程操作使溫度大約上升10攝氏度。因此，操作系統(tǒng)中必須設(shè)有冷卻系統(tǒng)，以保證生物產(chǎn)品的活性。39精品ppt利用發(fā)射15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。一般認(rèn)為超聲波破碎的機理是：在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。3.超聲破碎法（Ultrasonication）一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對酵母菌的效果較差，該法在實驗室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用（聲能傳遞和散熱）。超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)失活。40精品ppt41精品ppt超聲波破碎法42精品ppt3.超聲破碎法（Ultrasonication）其破碎率的相關(guān)因素:

聲頻、聲能；處理時間細(xì)胞濃度菌種類型

43精品ppt44精品ppt與破碎效率直接相關(guān)的參數(shù)振幅，與聲能有關(guān)，直接影響蛋白釋放的比速率黏度，影響能耗，抑制空穴現(xiàn)象表面張力，添加表面活性劑或者從細(xì)胞中釋放出蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)，會顯著影響超聲破碎效率。起泡在氣-液界面上會使蛋白質(zhì)變性或清除空穴現(xiàn)象。被處理懸浮液的體積。大體積需要高的聲能引起強烈的渦流和大氣泡的形成。45精品ppt珠粒的體積和直徑，對于剛性細(xì)胞的粉碎常添加細(xì)小的珠粒以產(chǎn)生輔助研磨效應(yīng)。探頭的形狀和材質(zhì)，一般是鈦金屬材料。細(xì)胞懸浮液的流速。由于其局限性，在工業(yè)上一般不采用，主要是用于實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎。與破碎效率直接相關(guān)的參數(shù)46精品ppt影響超聲對生物產(chǎn)品的回收有很多因素（1）溫度

避免方法

預(yù)冷

冷凝循環(huán)水（2）游離基的生成等化學(xué)效應(yīng).

應(yīng)對方式

添加游離基的清除劑{胱氨酸，谷胱甘肽或者利用氫氣頂吹細(xì)胞懸浮液來緩和}47精品ppt微波破碎基于微波加熱的瞬時性、選擇性、和高效性，控制適宜的微波條件而實現(xiàn)。植物細(xì)胞不同部位的物質(zhì)，對微波的吸收能力存在顯著差異。48精品ppt機械破碎作用機制不同，有各自的適用范圍和處理規(guī)模。適用范圍：菌體細(xì)胞，目標(biāo)產(chǎn)物。破碎大腸桿菌提取質(zhì)粒DNA，珠磨法完整質(zhì)粒收得率在90%,其他方法50%以下。因此針對目標(biāo)產(chǎn)物性質(zhì)（分子量、分子形態(tài)、穩(wěn)定性等）選擇細(xì)胞破碎法，并確定合適的操作條件非常重要。49精品ppt機械破碎的缺點需高能，并且產(chǎn)生高溫和高的剪切力，容易使不穩(wěn)定產(chǎn)品失活。破碎的有機體或者產(chǎn)物，非專一，產(chǎn)生碎片微粒尺寸的大范圍細(xì)分布，大量的細(xì)微顆粒給后續(xù)分離造成困難。50精品ppt4.酶溶法（EnzymaticLysis）（1）外加酶法

常用的溶酶溶菌酶β-1，3-葡聚糖酶β-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽鍵內(nèi)切酶殼多糖酶等溶菌酶主要用于細(xì)菌類細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物51精品ppt如：對酵母細(xì)胞采用酶法破碎時，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)-甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時若緩沖液的滲透壓變化，則細(xì)胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞時必須根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿?，并確定相應(yīng)的次序。酶溶法的優(yōu)點：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。缺點：溶酶價格高，溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶），產(chǎn)物抑制的存在。如在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。52精品ppt誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。影響自溶過程的主要因素有溫度、時間、pH值、激活劑和細(xì)胞代謝途徑等。常用加熱法和干燥法。缺點是：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。

（2）自溶法（Autolysis）53精品ppt某些化學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。5.化學(xué)滲透法（Chemicalpermeation）該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。54精品ppt如TritonX-100是一種非離子型清潔劑，對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。其他的表面活性劑，如牛黃膽酸鈉、十二烷基磺酸鈉等也可使細(xì)胞破碎。（1）表面活性劑可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。55精品ppt處理G-細(xì)菌，對細(xì)胞外層膜有破壞作用。G-細(xì)菌的外層膜結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來填補，從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性的增強。（2）EDTA螯合劑56精品ppt能分解細(xì)胞壁中的類脂，使胞壁膜溶脹，細(xì)胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級醇等。（3）有機溶劑（4）變性劑鹽酸胍（Guanidinehydrochloride）和脲（Urea）是常用的變性劑。變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。57精品ppt不同細(xì)胞可采用的化學(xué)滲透處理方式細(xì)胞類型變性劑清潔劑有機溶劑酶抗生素生物試劑螯合劑革蘭氏陰性細(xì)菌******革蘭氏陽性細(xì)菌***酵母菌******植物細(xì)胞****巨噬細(xì)胞****表示適用58精品ppt?各種試劑的不同作用機理，將幾種試劑合 理地搭配使用能有效地提高胞內(nèi)物質(zhì)的釋 放率。例：單獨用0.1mol/L鹽酸胍處理E.coli僅釋放約1%的蛋白質(zhì)0.5%TritonX-100處理蛋白質(zhì)釋放率為4%二者合用，蛋白質(zhì)釋放率可達(dá)53%左右59精品ppt通用性差；時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50%；有些化學(xué)試劑有毒。化學(xué)滲透法優(yōu)點：缺點：對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。60精品ppt將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25℃形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而引起的。此法主要用于實驗室，適應(yīng)范圍廣、破碎率高、細(xì)胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等優(yōu)點，但不適應(yīng)于對冷凍敏感的生化物質(zhì)。

6.其他方法1.X-press法61精品pptX-press法62精品ppt將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達(dá)平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹，甚至破裂。僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強度減弱。

2.滲透壓法（Osmoticpressure）63精品ppt滲透壓法64精品ppt細(xì)胞膜疏水鍵破裂胞內(nèi)結(jié)冰細(xì)胞膨脹而破裂適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。

3.反復(fù)凍結(jié)-融化法65精品ppt使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30℃的氣流中吹干；真空干燥多用于細(xì)菌。冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)如酶。4.干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥66精品ppt67精品ppt68精品ppt69精品ppt三、破碎率的測定與破碎技術(shù)的研究方向

細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。導(dǎo)電率隨著破碎率的增加而呈線性增加。1.破碎率的測定直接測定法目的產(chǎn)物測定法導(dǎo)電率測定法采用染色的方法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開來。如采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細(xì)胞呈紫色，而受損害的細(xì)胞呈亮紅