外源性硫化氫：大鼠腦缺血-再灌注損傷的潛在保護劑與機制剖析一、引言1.1研究背景與意義腦缺血-再灌注損傷（CerebralIschemia-ReperfusionInjury，CIRI）是指腦缺血后恢復血液供應，腦組織損傷反而加重的病理現(xiàn)象。這一損傷過程涉及多個復雜的病理生理機制，對患者的健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生了嚴重影響，是當前醫(yī)學領域面臨的重大挑戰(zhàn)之一。腦血管疾病是全球范圍內(nèi)導致死亡和殘疾的主要原因之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的數(shù)據(jù)，每年約有1500萬人死于腦血管疾病，其中大部分與腦缺血-再灌注損傷相關。在中國，腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率也呈上升趨勢，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。腦缺血-再灌注損傷多發(fā)生于腦血栓形成、腦栓塞、心臟驟停后的復蘇等腦血管疾病的治療過程中。當腦缺血發(fā)生時，腦組織的氧供和能量代謝受到嚴重影響，神經(jīng)細胞開始出現(xiàn)損傷。若在一定時間內(nèi)恢復血流灌注，雖然理論上有助于恢復腦組織的氧供和營養(yǎng)物質(zhì)供應，但實際上卻常常引發(fā)一系列復雜的病理生理變化，導致腦組織損傷進一步加重，出現(xiàn)腦水腫、腦細胞死亡、神經(jīng)功能障礙等癥狀，嚴重者甚至導致患者死亡。目前，盡管醫(yī)學領域在腦缺血-再灌注損傷的治療方面取得了一定的進展，如溶栓治療、神經(jīng)保護藥物的應用等，但這些治療方法仍存在諸多局限性。溶栓治療時間窗狹窄，超過時間窗進行溶栓反而可能增加出血風險；現(xiàn)有的神經(jīng)保護藥物在臨床試驗中效果并不理想，未能顯著改善患者的預后。因此，深入研究腦缺血-再灌注損傷的機制，尋找新的有效的治療靶點和方法，具有迫切的臨床需求和重要的現(xiàn)實意義。硫化氫（HydrogenSulfide，H_2S）作為一種新型的氣體信號分子，近年來在心血管、神經(jīng)等系統(tǒng)的生理和病理過程中受到了廣泛關注。研究發(fā)現(xiàn)，H_2S能夠參與體內(nèi)多種生理功能的調(diào)節(jié)，如血管舒張、神經(jīng)傳遞、細胞增殖與凋亡等。在腦缺血-再灌注損傷的研究中，越來越多的證據(jù)表明，外源性給予H_2S具有潛在的神經(jīng)保護作用。H_2S可以通過調(diào)節(jié)抗氧化反應，減少活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）的生成，提高抗氧化酶的活性，從而減輕氧化應激對腦組織的損傷；H_2S還能夠抑制細胞凋亡信號通路的激活，減少神經(jīng)細胞的凋亡，對缺血再灌注損傷的腦組織起到保護作用；H_2S可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應、改善腦血流等多種途徑，發(fā)揮其對腦缺血-再灌注損傷的保護作用。探討外源性硫化氫對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護作用及機制，不僅有助于深入了解腦缺血-再灌注損傷的病理生理過程，為開發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)，還可能為臨床治療腦缺血相關疾病開辟新的途徑，具有重要的理論意義和潛在的臨床應用價值。1.2研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在通過動物實驗，深入探究外源性硫化氫對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護作用及其潛在機制，為臨床治療腦缺血相關疾病提供新的理論依據(jù)和治療靶點。具體研究目的如下：明確外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能和腦梗死體積的影響：通過建立大鼠腦缺血-再灌注損傷模型，給予外源性硫化氫干預，觀察大鼠神經(jīng)功能缺損評分的變化，采用2,3,5-三苯基四氮唑（TTC）染色法測量腦梗死體積，明確外源性硫化氫是否能夠改善腦缺血-再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能，減少腦梗死體積，從而證實其對腦缺血-再灌注損傷的保護作用。揭示外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷大鼠氧化應激水平的調(diào)節(jié)作用：檢測腦組織勻漿上清液中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，探討外源性硫化氫是否通過調(diào)節(jié)氧化應激反應，減少自由基的產(chǎn)生，增強抗氧化防御系統(tǒng)，從而減輕腦缺血-再灌注損傷。探討外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷大鼠細胞凋亡的影響及其機制：運用TUNEL染色、Westernblot等技術，檢測細胞凋亡相關蛋白（如Bcl-2、Bax、Caspase-3等）的表達，研究外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響。進一步探究其是否通過調(diào)控凋亡相關信號通路（如線粒體途徑、死亡受體途徑等）來抑制細胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。分析外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷大鼠炎癥反應的調(diào)控機制：檢測腦組織中炎癥因子（如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等）的表達水平，以及炎癥相關信號通路（如NF-κB信號通路）的激活情況，探討外源性硫化氫是否通過抑制炎癥反應，減輕炎癥對腦組織的損傷，從而保護腦缺血-再灌注損傷。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：多靶點研究：從氧化應激、細胞凋亡、炎癥反應等多個角度全面探討外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷的保護機制，有助于更深入、系統(tǒng)地了解其神經(jīng)保護作用的內(nèi)在機制，為開發(fā)新的治療策略提供更全面的理論依據(jù)。精準干預：在再灌注前給予外源性硫化氫干預，旨在抓住腦缺血-再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的關鍵時間節(jié)點，通過早期干預來最大限度地減輕損傷，為臨床治療提供更具時效性的治療方案。綜合評價：采用多種先進的檢測技術和指標，對大鼠的神經(jīng)功能、腦梗死體積、氧化應激水平、細胞凋亡和炎癥反應等進行綜合評價，使研究結果更加準確、可靠，具有更高的科學價值和臨床指導意義。二、相關理論基礎2.1腦缺血-再灌注損傷概述2.1.1病理生理過程腦缺血-再灌注損傷是一個涉及多個復雜環(huán)節(jié)的病理生理過程，對神經(jīng)細胞的結構和功能產(chǎn)生嚴重影響，其具體過程如下：能量代謝障礙：當腦缺血發(fā)生時，由于血液供應中斷，腦組織無法獲得足夠的氧氣和葡萄糖，導致有氧氧化過程受阻。細胞內(nèi)的三磷酸腺苷（ATP）生成急劇減少，而磷酸肌酸（CP）的儲備也迅速耗盡。此時，細胞不得不依靠無氧酵解來維持能量供應，但無氧酵解產(chǎn)生的ATP量遠遠低于有氧氧化，且會產(chǎn)生大量乳酸，導致細胞內(nèi)pH值下降，引起細胞酸中毒。這種能量代謝障礙會影響細胞膜上離子泵的功能，如鈉鉀ATP酶、鈣ATP酶等，使得細胞內(nèi)鈉離子和鈣離子濃度升高，鉀離子濃度降低，從而破壞細胞的離子平衡，引發(fā)一系列后續(xù)損傷。興奮性氨基酸毒性：在腦缺血過程中，神經(jīng)細胞的能量代謝障礙會導致細胞膜的完整性受損，使得興奮性氨基酸（EAA）如谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）大量釋放到細胞外間隙。同時，由于能量不足，神經(jīng)細胞對EAA的攝取和再利用能力下降，進一步導致細胞外EAA濃度升高。過量的EAA與突觸后膜上的相應受體結合，引起興奮性神經(jīng)元持續(xù)去極化，導致鈣離子大量內(nèi)流，造成細胞內(nèi)鈣超載。細胞內(nèi)鈣超載會激活一系列蛋白酶、磷脂酶和核酸酶，導致神經(jīng)細胞骨架破壞、細胞膜損傷、DNA斷裂等，最終引發(fā)細胞壞死或凋亡。自由基損傷：腦缺血再灌注時，由于恢復了血液供應，氧分子大量進入腦組織，在黃嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶等酶的作用下，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子（O_2^-）、過氧化氫（H_2O_2）、羥基自由基（·OH）等。這些自由基具有高度的化學反應活性，能夠攻擊細胞膜上的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，導致細胞膜的結構和功能受損。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如丙二醛（MDA）等還會進一步損傷細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，影響細胞的正常代謝和功能。自由基還能導致EAA釋放增加，促使腦缺血后再灌注損傷發(fā)生。炎癥反應：腦缺血再灌注損傷會激活機體的炎癥反應，這是一個復雜的免疫病理過程。缺血再灌注損傷會導致腦組織局部產(chǎn)生損傷相關分子模式（DAMPs），如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等，這些DAMPs可以被免疫細胞表面的模式識別受體（PRRs）識別，從而激活免疫細胞，如小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞等。激活的免疫細胞會釋放大量的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥因子會進一步招募更多的免疫細胞到損傷部位，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，導致炎癥細胞浸潤、血管內(nèi)皮細胞損傷、血腦屏障破壞等，加重腦組織的損傷。細胞凋亡：細胞凋亡是一種程序性細胞死亡方式，在腦缺血再灌注損傷中，細胞凋亡也是導致神經(jīng)細胞死亡的重要機制之一。缺血再灌注損傷可以通過多種途徑激活細胞凋亡信號通路，如線粒體途徑、死亡受體途徑等。在線粒體途徑中，缺血再灌注損傷會導致線粒體膜電位下降，釋放細胞色素C到細胞質(zhì)中，細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP結合形成凋亡小體，激活半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase）級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡。在死亡受體途徑中，缺血再灌注損傷會導致死亡受體如Fas、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）等的表達上調(diào)，這些死亡受體與相應的配體結合后，會激活Caspase-8，進而激活下游的Caspase級聯(lián)反應，引發(fā)細胞凋亡。2.1.2對機體的危害腦缺血-再灌注損傷對大鼠機體的危害是多方面的，嚴重影響大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)功能和整體健康狀態(tài)，具體表現(xiàn)如下：神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙：腦缺血-再灌注損傷會導致大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，如運動功能障礙，表現(xiàn)為肢體無力、行走不穩(wěn)、協(xié)調(diào)性下降等；感覺功能異常，可能出現(xiàn)對疼痛、觸覺等感覺的減退或過敏；認知功能障礙，表現(xiàn)為學習和記憶能力下降，大鼠在進行迷宮實驗等認知測試時，表現(xiàn)出錯誤率增加、完成任務時間延長等。這些神經(jīng)功能障礙的程度與腦缺血-再灌注損傷的嚴重程度密切相關，嚴重的損傷可能導致大鼠永久性的神經(jīng)功能缺失，影響其生存質(zhì)量。腦水腫：腦缺血-再灌注損傷引發(fā)的一系列病理生理變化會導致腦水腫的發(fā)生。能量代謝障礙、自由基損傷和炎癥反應等會破壞血腦屏障的完整性，使得血管內(nèi)的液體和蛋白質(zhì)滲出到腦組織間隙，引起血管源性腦水腫；細胞內(nèi)鈣超載和酸中毒等會導致神經(jīng)細胞腫脹，引發(fā)細胞毒性腦水腫。腦水腫會使顱內(nèi)壓升高，壓迫周圍腦組織，進一步加重腦損傷，形成惡性循環(huán)。嚴重的腦水腫可能導致腦疝的發(fā)生，壓迫腦干等重要結構，危及大鼠生命。腦細胞死亡：腦缺血-再灌注損傷過程中的興奮性氨基酸毒性、自由基損傷、炎癥反應和細胞凋亡等機制，都會直接或間接導致神經(jīng)細胞的死亡。大量神經(jīng)細胞的死亡會破壞腦組織的正常結構和功能，導致局部腦功能喪失。腦梗死是腦細胞死亡的一種嚴重表現(xiàn)形式，在腦缺血-再灌注損傷后，腦組織局部由于缺血缺氧和各種損傷機制的作用，會形成梗死灶，梗死灶的大小和位置決定了腦功能受損的程度和范圍。全身代謝紊亂：腦缺血-再灌注損傷不僅影響神經(jīng)系統(tǒng)，還會引起全身代謝紊亂。由于腦功能受損，會影響神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能，導致體內(nèi)激素水平失衡，如腎上腺素、皮質(zhì)醇等應激激素分泌增加，引起血糖升高、血壓波動等代謝異常。炎癥反應產(chǎn)生的大量炎癥因子進入血液循環(huán)，也會影響全身各器官的功能，導致代謝紊亂，如肝臟和腎臟的代謝功能受損，出現(xiàn)肝功能異常、腎功能不全等表現(xiàn)，進一步影響大鼠的整體健康狀態(tài)。2.2硫化氫的生物學特性與作用2.2.1內(nèi)源性硫化氫的產(chǎn)生與代謝硫化氫在生物體內(nèi)并非僅僅是一種具有特殊氣味的氣體，它更是一種重要的內(nèi)源性氣體信號分子，在機體的生理和病理過程中發(fā)揮著關鍵作用。內(nèi)源性硫化氫的產(chǎn)生主要依賴于三種酶：胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）、胱硫醚-β-合成酶（CBS）和3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（3-MST），它們在不同組織和細胞中發(fā)揮著各自獨特的作用，共同維持著體內(nèi)硫化氫的動態(tài)平衡。CSE主要在心血管系統(tǒng)和外周組織中高表達，它催化L-半胱氨酸生成硫化氫，在血管功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究表明，在血管平滑肌細胞中，CSE的活性變化直接影響硫化氫的生成量，進而調(diào)節(jié)血管的舒張和收縮功能。當CSE活性增強時，硫化氫生成增加，可通過激活血管平滑肌細胞中的ATP敏感性鉀通道（KATP），使細胞膜超極化，抑制電壓門控鈣通道的開放，減少細胞內(nèi)鈣離子濃度，從而導致血管舒張。CBS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富，是大腦中產(chǎn)生硫化氫的關鍵酶之一。它以L-半胱氨酸和絲氨酸為底物，催化生成胱硫醚，進而產(chǎn)生硫化氫。在神經(jīng)細胞中，CBS產(chǎn)生的硫化氫參與神經(jīng)信號傳遞和神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)。例如，硫化氫可以調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸（GABA）的釋放，GABA是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其釋放的改變會影響神經(jīng)元的興奮性，從而調(diào)節(jié)大腦的神經(jīng)活動。3-MST在多種組織中廣泛存在，通過催化3-巰基丙酮酸生成硫化氫。在肝臟、腎臟等組織中，3-MST對維持硫化氫的基礎水平具有重要意義。在肝臟中，3-MST參與肝臟的解毒功能，硫化氫可能通過調(diào)節(jié)肝臟細胞的抗氧化防御系統(tǒng)，減輕有害物質(zhì)對肝臟的損傷。內(nèi)源性硫化氫的代謝主要通過氧化途徑進行。硫化氫首先被氧化為硫代硫酸鹽，這一過程主要由線粒體中的硫醌氧化還原酶（SQR）催化，硫代硫酸鹽進一步被氧化為硫酸鹽，最終通過尿液排出體外。研究發(fā)現(xiàn)，在肝臟和腎臟等組織中，SQR的活性較高，保證了硫化氫的正常代謝。如果SQR活性受到抑制，硫化氫的代謝受阻，可能導致體內(nèi)硫化氫水平異常升高，引發(fā)一系列病理變化。此外，硫化氫還可以與金屬離子結合，形成金屬硫化物，這也是硫化氫代謝的一種方式。在某些情況下，如體內(nèi)金屬離子濃度異常時，硫化氫與金屬離子的結合可能會影響其生物學功能。2.2.2外源性硫化氫的應用與研究現(xiàn)狀外源性硫化氫在醫(yī)學領域的應用研究近年來取得了顯著進展，其在多種疾病的治療中展現(xiàn)出潛在的應用價值，特別是在腦缺血-再灌注損傷的研究中，受到了廣泛關注。在心血管疾病方面，外源性硫化氫已被證明具有血管舒張、抗血栓形成和心肌保護等作用。研究發(fā)現(xiàn)，給予外源性硫化氫可以通過激活KATP通道，舒張血管平滑肌，降低血壓，對高血壓等心血管疾病具有潛在的治療作用。在心肌缺血-再灌注損傷模型中，外源性硫化氫能夠減少心肌梗死面積，改善心臟功能，其機制可能與抑制氧化應激、減少細胞凋亡和炎癥反應有關。在一項動物實驗中，對心肌缺血-再灌注損傷的大鼠給予外源性硫化氫供體硫氫化鈉（NaHS）處理，結果顯示，與對照組相比，NaHS處理組大鼠的心肌梗死面積明顯減小，心肌組織中的丙二醛（MDA）含量降低，超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，表明外源性硫化氫能夠減輕心肌氧化損傷，保護心肌細胞。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病領域，外源性硫化氫在腦缺血-再灌注損傷的研究中成為熱點。眾多研究表明，外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷具有保護作用。通過建立大鼠腦缺血-再灌注損傷模型，給予外源性硫化氫干預，發(fā)現(xiàn)其能夠改善大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，減少腦梗死體積。在一項研究中，將大鼠分為假手術組、缺血再灌注模型組和外源性硫化氫處理組，缺血再灌注模型組大鼠在缺血2小時再灌注24小時后，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，腦梗死體積較大；而外源性硫化氫處理組在再灌注前給予NaHS腹腔注射，大鼠的神經(jīng)功能評分明顯降低，腦梗死體積顯著減小，表明外源性硫化氫能夠有效減輕腦缺血-再灌注損傷。外源性硫化氫還在糖尿病、呼吸系統(tǒng)疾病等方面展現(xiàn)出潛在的治療作用。在糖尿病研究中，外源性硫化氫可以調(diào)節(jié)胰島素信號通路，改善胰島素抵抗，降低血糖水平；在呼吸系統(tǒng)疾病中，外源性硫化氫對哮喘、慢性阻塞性肺疾病等具有抗炎、抗氧化和舒張氣道平滑肌的作用。目前外源性硫化氫在醫(yī)學應用中仍面臨一些挑戰(zhàn)。如何選擇合適的硫化氫供體，使其能夠穩(wěn)定、有效地釋放硫化氫，同時減少不良反應，是亟待解決的問題。硫化氫的最佳給藥劑量和給藥時間也需要進一步優(yōu)化，以達到最佳的治療效果。未來，隨著研究的深入，外源性硫化氫有望成為一種新型的治療藥物，為多種疾病的治療帶來新的突破。三、實驗設計與方法3.1實驗動物與分組本研究選用健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，體重250-300g，由[動物供應商名稱]提供。大鼠在實驗室環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周，保持室溫在（22±2）℃，相對濕度為（50±10）%，12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水。適應性飼養(yǎng)結束后，將60只SD大鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分為5組，每組12只，具體分組如下：正常對照組：不進行任何手術操作，僅給予等體積的生理鹽水腹腔注射。腦缺血-再灌注模型組：采用線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞（MCAO）再灌注模型，術后給予等體積的生理鹽水腹腔注射。外源性硫化氫低劑量處理組：在制備MCAO再灌注模型后，立即腹腔注射低劑量的硫化氫供體硫氫化鈉（NaHS）溶液，劑量為5μmol/kg。外源性硫化氫中劑量處理組：在制備MCAO再灌注模型后，立即腹腔注射中劑量的NaHS溶液，劑量為10μmol/kg。外源性硫化氫高劑量處理組：在制備MCAO再灌注模型后，立即腹腔注射高劑量的NaHS溶液，劑量為20μmol/kg。分組完成后，對每組大鼠進行編號標記，以便后續(xù)實驗操作和數(shù)據(jù)記錄。在整個實驗過程中，嚴格按照動物實驗的倫理規(guī)范進行操作，減少動物的痛苦和應激反應，確保實驗結果的準確性和可靠性。3.2實驗材料與儀器3.2.1實驗材料實驗動物：健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，體重250-300g，由[動物供應商名稱]提供。主要化學試劑與藥品：硫氫化鈉（NaHS），純度≥98%，購自[試劑供應商1]，作為外源性硫化氫供體，用于制備不同濃度的硫化氫溶液，給予大鼠腹腔注射，以探究外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷的保護作用。2,3,5-三苯基四氮唑（TTC），純度≥99%，購自[試劑供應商2]，用于腦梗死體積的測定。TTC是一種脂溶性光敏感復合物，正常腦組織中的脫氫酶可將其還原為紅色的三苯基甲臜，而梗死腦組織因細胞死亡，脫氫酶活性喪失，不能使TTC還原，呈現(xiàn)白色，通過對比染色后的腦組織切片，可清晰區(qū)分梗死區(qū)和正常區(qū)，從而計算腦梗死體積。水合氯醛，純度≥99%，購自[試劑供應商3]，用于大鼠的麻醉。以10%水合氯醛溶液按3mL/kg的劑量腹腔注射，可使大鼠快速進入麻醉狀態(tài)，便于進行手術操作。肝素鈉，濃度為2.5×10^6U/L，購自[試劑供應商4]，用于浸泡線栓，減少血栓形成。在制備大腦中動脈阻塞（MCAO）模型時，將線栓預先浸蘸肝素鈉，可降低手術過程中血栓形成的風險，提高模型的成功率。丙二醛（MDA）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒、活性氧（ROS）檢測試劑盒，均購自[試劑供應商5]，用于檢測腦組織勻漿上清液中氧化應激相關指標的含量或活性。這些試劑盒采用相應的檢測方法，如MDA檢測采用硫代巴比妥酸（TBA）法，SOD檢測采用黃嘌呤氧化酶法，GSH-Px檢測采用比色法，ROS檢測采用熒光探針法，能夠準確測定腦組織中的氧化應激水平。兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗大鼠Bax多克隆抗體、兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔IgG二抗，均購自[試劑供應商6]，用于Westernblot實驗檢測細胞凋亡相關蛋白的表達。這些抗體具有高特異性和親和力，能夠準確識別相應的靶蛋白，通過Westernblot技術，可分析不同組大鼠腦組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3等蛋白的表達水平變化，從而探討外源性硫化氫對細胞凋亡的影響機制。大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒、大鼠白細胞介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒、大鼠白細胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒，購自[試劑供應商7]，用于檢測腦組織勻漿中炎癥因子的含量。ELISA試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，能夠靈敏、準確地測定TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的濃度，評估外源性硫化氫對炎癥反應的調(diào)控作用。其他試劑：包括無水乙醇、甲醛、二甲苯、蘇木精、伊紅、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等分析純試劑，用于常規(guī)的組織固定、脫水、染色等實驗操作，均購自[試劑供應商8]。3.2.2實驗儀器手術器械：手術器械盤1套，包含手術刀、手術剪、鑷子、止血鉗、持針器等，用于大鼠頸部手術操作，均購自[醫(yī)療器械供應商1]。眼科直剪、眼科彎剪、眼科直鑷、眼科彎鑷各1把，用于精細的血管分離和線栓插入操作，購自[醫(yī)療器械供應商2]。玻璃分針2根，用于分離血管和神經(jīng)，購自[醫(yī)療器械供應商3]。血管夾3個，用于夾閉血管，購自[醫(yī)療器械供應商4]?？p合針線（0號手術線、手術縫針），用于縫合手術切口，購自[醫(yī)療器械供應商5]。檢測儀器：電子天平，精度0.01g，型號[天平型號1]，購自[儀器供應商1]，用于稱量藥品和動物體重。恒溫加熱板，型號[加熱板型號1]，購自[儀器供應商2]，用于維持大鼠手術過程中的體溫，保持在（37±0.5）℃，減少因體溫波動對實驗結果的影響。小動物呼吸機，型號[呼吸機型號1]，購自[儀器供應商3]，在手術過程中輔助大鼠呼吸，確保其呼吸平穩(wěn)，維持正常的氣體交換。多道生理記錄儀，型號[記錄儀型號1]，購自[儀器供應商4]，用于監(jiān)測大鼠的心率、血壓、呼吸等生理指標，實時了解大鼠的生理狀態(tài)。酶標儀，型號[酶標儀型號1]，購自[儀器供應商5]，用于ELISA實驗中讀取吸光度值，定量檢測炎癥因子的含量。熒光分光光度計，型號[熒光光度計型號1]，購自[儀器供應商6]，用于檢測ROS含量，通過熒光信號強度反映ROS水平。高速冷凍離心機，型號[離心機型號1]，購自[儀器供應商7]，用于離心腦組織勻漿，分離上清液，轉(zhuǎn)速可達12000r/min，溫度可控制在4℃，保證樣品在低溫環(huán)境下離心，減少生物活性物質(zhì)的降解。電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀，型號分別為[電泳儀型號1]和[轉(zhuǎn)膜儀型號1]，購自[儀器供應商8]，用于Westernblot實驗中的蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜操作，將蛋白分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以便后續(xù)的免疫檢測?；瘜W發(fā)光成像系統(tǒng)，型號[成像系統(tǒng)型號1]，購自[儀器供應商9]，用于檢測Westernblot膜上的化學發(fā)光信號，通過圖像分析軟件對蛋白條帶進行定量分析，獲取蛋白表達水平的信息。光學顯微鏡，型號[顯微鏡型號1]，購自[儀器供應商10]，用于觀察腦組織切片的病理形態(tài)學變化，配備圖像采集系統(tǒng)，可拍攝并保存圖像，以便后續(xù)分析。病理切片機，型號[切片機型號1]，購自[儀器供應商11]，用于制作腦組織切片，切片厚度可精確控制在4-6μm，保證切片質(zhì)量的一致性。石蠟包埋機，型號[包埋機型號1]，購自[儀器供應商12]，用于將腦組織進行石蠟包埋，便于切片制作。攤片機和烤片機，型號分別為[攤片機型號1]和[烤片機型號1]，購自[儀器供應商13]，用于將切好的腦組織切片展平并烘干，使其牢固附著在載玻片上。3.3大鼠腦缺血-再灌注模型的建立本研究采用改良的線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞（MCAO）再灌注模型，具體步驟如下：線栓制備：選用直徑為0.26mm的尼龍魚線，用鋒利薄刀片將線身垂直截成5cm長的小段。在體視鏡下，用細砂紙仔細打磨魚線頭端棱角，確保頭端光滑鈍圓且大小一致。隨后，用記號筆在距線栓頭端20mm處做一清晰標記，將線栓浸泡于75%酒精中消毒30min后晾干。術前將線栓置于無菌生理鹽水中備用，臨用前浸蘸2.5×10^6U/L肝素鈉溶液，以減少血栓形成。術前準備：將SD大鼠分籠飼養(yǎng)于溫度為（22±2）℃、濕度為（50±10）%的環(huán)境中，保持12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，適應性飼養(yǎng)1-2d，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。術前12h禁食，自由飲水。動物麻醉：以10%水合氯醛溶液按3mL/kg的劑量腹腔注射麻醉大鼠。注射時，注射器針頭從腹部向頭方向刺入腹腔，回抽針芯確認無回血、無胃腸道內(nèi)容物后，緩慢推注。約10min后，大鼠逐漸癱軟，反應淡漠，用手牽拉鼠尾無明顯反抗時，將其置仰臥位，使用大鼠立體定向儀固定上頜中切牙和四肢，在手術過程中使用恒溫加熱板維持大鼠肛溫在（37±0.5）℃，直至大鼠恢復活動。手術操作：頸部切開與血管暴露：手術按外科無菌原則進行，用備皮剪對大鼠頸部右側進行備皮，然后用碘伏消毒皮膚。于正中線旁開約5mm處，行頸部右側縱行切口，長度約為2-3cm。剪開淺筋膜，暴露右側胸鎖乳突肌，在胸鎖乳突肌與頸前肌群之間向深部鈍性分離，暴露頸動脈鞘。使用玻璃分針小心游離頸總動脈（CCA）和迷走神經(jīng)，直至CCA分叉處。接著，鈍性分離向內(nèi)行走的頸外動脈（ECA）及向外后行走的頸內(nèi)動脈（ICA）。血管結扎與剪口：分別在CCA、ECA、ICA下方穿線，用絲線結扎CCA近心端、頸外動脈近分叉部。在CCA上距其末端約5.0mm處，使用眼科剪以與血管正上方約成60°角的角度剪一小口，剪口大小以不超過CCA壁的1/4為宜，既要保證線栓能夠順利插入，又要防止血管斷裂。線栓插入與固定：將浸蘸肝素鈉的線栓沿ICA方向連續(xù)輕柔推進，插入深度約為（18.0±0.5）mm，當遇到輕微阻力時即停止插入，此時線栓頭端一般已抵達MCA起始處或至大腦前動脈。然后于ICA近心端結扎該動脈，全層縫合切口，并留置長約3cm的尼龍線于體外，再次用碘伏消毒手術區(qū)。再灌注操作：缺血2h后，小心拔出阻塞線約10min實現(xiàn)再灌注。在拔出線栓時，動作一定要輕柔，避免損傷血管。假手術組僅進行分離血管操作，插線深度小于10mm，其余處理與模型組相同。在模型建立過程中，有以下操作要點及注意事項：麻醉管理：嚴格控制麻醉藥物的濃度和劑量，避免麻醉過深或過淺。麻醉過深可能抑制呼吸和循環(huán)功能，導致大鼠死亡；麻醉過淺則大鼠易在手術過程中蘇醒，影響手術操作和模型的穩(wěn)定性。同時，保持氣道通暢，避免刺激氣管，防止因分泌物過多而引起窒息死亡。血管分離：在分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈時，要特別注意勿損傷迷走神經(jīng)，同時將血管周圍的結締組織剝離干凈，為線栓插入創(chuàng)造良好條件。操作過程中動作要輕柔，避免傷及血管導致大出血，一旦發(fā)生大出血，應立即用棉球壓迫止血，并盡快找出出血點進行結扎。剪口與線栓：CCA上的剪口是手術的關鍵步驟之一，眼科剪必須銳利，以保證剪口整齊。剪口角度和大小要嚴格控制，角度過大或剪口過大都可能導致血管斷裂，角度過小或剪口過小則會使線栓插入困難。尼龍線栓的制備同樣關鍵，線栓頭端需修剪打磨圓鈍，防止頭端過于鋒利而刺破血管，引發(fā)蛛網(wǎng)膜下腔出血導致大鼠死亡。線栓插入時要連續(xù)緩慢推進，密切注意阻力變化，遇到輕微阻力即止，切忌頓挫式推進，以免造成入線過深；同時要防止因插線深度不足而導致線栓不能有效地阻斷大腦中動脈血流。術后護理：術后縫合時，注意勿碰觸線栓，防止線栓輕微外移造成MCA血流阻斷失敗。缺血結束后實施再灌注時，回撤線栓一定要輕柔，避免動作過猛或直接將線栓拔出而造成出血。術后將大鼠放回鼠籠，給予溫暖的環(huán)境，可使用白熾燈照射維持其肛溫在（36-37）℃，直至大鼠蘇醒恢復活動，并給予正常飲水和用水泡發(fā)的鼠糧。模型評估：再灌注2h及大鼠蘇醒后，采用Longa5分制神經(jīng)功能缺損評分法對大鼠進行評分，0分及4分者予以剔除。0分表示無神經(jīng)功能缺損；1分表示提尾時對側前肢內(nèi)收，不能完全伸展；2分表示自發(fā)行走時向?qū)绒D(zhuǎn)圈；3分表示行走時身體向?qū)葍A倒；4分表示不能自發(fā)行走，有意識喪失。通過評分篩選出神經(jīng)功能缺損符合要求的大鼠，確保模型的成功建立和實驗結果的可靠性。3.4外源性硫化氫的干預方式在本研究中，選用硫氫化鈉（NaHS）作為外源性硫化氫供體。NaHS是一種常用的硫化氫供體，其能夠在生物體內(nèi)迅速分解，釋放出硫化氫，從而發(fā)揮生物學作用。眾多研究表明，NaHS在多種疾病模型中展現(xiàn)出良好的硫化氫供體特性，其釋放硫化氫的速度和量相對穩(wěn)定，便于實驗操作和結果分析。將NaHS用無菌生理鹽水配制成不同濃度的溶液。具體配制方法為：精確稱取一定量的NaHS粉末，根據(jù)所需濃度和體積，按照公式計算出所需的NaHS質(zhì)量。例如，若要配制10mmol/L的NaHS溶液10mL，根據(jù)公式n=cV（其中n為物質(zhì)的量，c為物質(zhì)的量濃度，V為溶液體積），計算出所需NaHS的物質(zhì)的量為0.1mmol，再根據(jù)NaHS的摩爾質(zhì)量，稱取相應質(zhì)量的NaHS粉末，加入適量無菌生理鹽水，充分攪拌溶解，定容至10mL，即得到10mmol/L的NaHS溶液。然后，根據(jù)實驗設計的劑量，進一步稀釋成5μmol/kg、10μmol/kg和20μmol/kg的NaHS溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配，以保證溶液的穩(wěn)定性和有效性。給藥途徑選擇腹腔注射，這是因為腹腔注射操作相對簡便，藥物吸收較快且吸收面積大，能夠使外源性硫化氫迅速進入血液循環(huán)，分布到全身組織，包括腦組織，從而發(fā)揮其對腦缺血-再灌注損傷的保護作用。同時，腹腔注射的重復性較好，有利于實驗結果的穩(wěn)定性和可靠性。給藥時間選擇在大鼠腦缺血再灌注模型制備后立即進行。腦缺血再灌注損傷是一個快速進展的病理過程，在再灌注早期，氧化應激、炎癥反應等損傷機制迅速啟動，神經(jīng)細胞開始出現(xiàn)不可逆損傷。因此，在再灌注前給予外源性硫化氫干預，能夠及時發(fā)揮其保護作用，阻斷損傷機制的進一步發(fā)展，最大限度地減輕腦缺血-再灌注損傷。給藥劑量設置為5μmol/kg、10μmol/kg和20μmol/kg三個不同水平。這是基于前期的預實驗和相關文獻報道確定的。在預實驗中，對不同劑量的NaHS進行了初步探索，觀察其對大鼠腦缺血-再灌注損傷的影響，發(fā)現(xiàn)5μmol/kg、10μmol/kg和20μmol/kg的NaHS均能夠在一定程度上改善大鼠的神經(jīng)功能和減少腦梗死體積，但效果存在差異。同時，查閱相關文獻發(fā)現(xiàn)，這三個劑量在類似的腦缺血-再灌注損傷研究中也被廣泛應用，且取得了較好的實驗結果，因此選擇這三個劑量進行正式實驗，以探討外源性硫化氫的劑量效應關系。3.5觀察指標及檢測方法3.5.1神經(jīng)功能缺損評分在再灌注24h后，采用Longa5分制神經(jīng)功能缺損評分法對各組大鼠進行神經(jīng)功能評估。具體操作如下：將大鼠置于寬敞的實驗臺上，使其自由活動，觀察其行走姿態(tài)和肢體運動情況；然后將大鼠輕輕提起尾巴，使其懸空，觀察其前肢的伸展情況。評分標準如下：0分表示無神經(jīng)功能缺損，大鼠活動自如，肢體運動正常；1分表示提尾時對側前肢內(nèi)收，不能完全伸展，這表明大鼠的肢體運動功能受到一定程度的影響，但整體活動能力尚可；2分表示自發(fā)行走時向?qū)绒D(zhuǎn)圈，說明大鼠的運動協(xié)調(diào)性出現(xiàn)問題，可能是由于腦部損傷導致的平衡功能失調(diào)；3分表示行走時身體向?qū)葍A倒，此時大鼠的神經(jīng)功能缺損較為嚴重，已經(jīng)影響到了其基本的行走能力；4分表示不能自發(fā)行走，有意識喪失，這是神經(jīng)功能嚴重受損的表現(xiàn)，可能導致大鼠無法正常生存。Longa評分法具有操作簡單、直觀、可重復性強等優(yōu)點，能夠快速、有效地評估大鼠腦缺血-再灌注損傷后的神經(jīng)功能狀態(tài)。該評分方法從運動功能、平衡能力等多個方面對大鼠的神經(jīng)功能進行評價，全面反映了腦缺血-再灌注損傷對大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的影響，為研究外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷的保護作用提供了重要的行為學依據(jù)。通過對比不同組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分，可以直觀地了解外源性硫化氫是否能夠改善大鼠的神經(jīng)功能，以及不同劑量的外源性硫化氫對神經(jīng)功能的影響差異。3.5.2腦梗死體積測定再灌注24h后，采用2,3,5-三苯基四氮唑（TTC）染色法測定大鼠腦梗死體積。具體操作步驟如下：將大鼠用過量的10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速斷頭取腦。將腦組織置于冰生理鹽水中，去除表面的血液和雜質(zhì)，然后用濾紙吸干表面水分。使用振動切片機將腦組織切成厚度為2mm的冠狀切片，共切5片。將切好的腦組織切片立即放入2%的TTC磷酸鹽緩沖液中，在37℃恒溫箱中避光孵育20-30min。在孵育過程中，正常腦組織中的脫氫酶會將TTC還原為紅色的三苯基甲臜，而梗死腦組織由于細胞死亡，脫氫酶活性喪失，不能使TTC還原，呈現(xiàn)白色，從而使梗死區(qū)和正常區(qū)形成鮮明對比。孵育結束后，將切片取出，用生理鹽水沖洗2-3次，洗去多余的TTC溶液。然后將切片放入4%多聚甲醛溶液中固定24h，以便于后續(xù)的觀察和拍照。使用圖像分析軟件（如Image-ProPlus）對固定后的腦組織切片進行圖像采集和分析。在采集圖像時，要確保光線均勻，圖像清晰，以保證分析結果的準確性。通過軟件測量每張切片上梗死區(qū)和正常區(qū)的面積，然后根據(jù)公式計算腦梗死體積百分比：腦梗死體積百分比=（梗死區(qū)總面積/正常區(qū)總面積）×100%。通過計算腦梗死體積百分比，可以準確地評估外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷大鼠腦梗死體積的影響，為研究其保護作用提供量化的數(shù)據(jù)支持。3.5.3氧化應激指標檢測再灌注24h后，取大鼠腦組織，制備腦組織勻漿，檢測勻漿上清液中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，以評估外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷大鼠氧化應激水平的影響。ROS含量檢測采用熒光探針法。具體操作如下：取適量腦組織勻漿，加入DCFH-DA熒光探針，使其終濃度為10μmol/L，在37℃恒溫箱中孵育30min。DCFH-DA本身無熒光，進入細胞后被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，DCFH可被ROS氧化生成具有熒光的DCF。孵育結束后，使用熒光分光光度計檢測熒光強度，激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為525nm，根據(jù)熒光強度計算ROS含量。ROS是一類具有高度化學反應活性的氧代謝產(chǎn)物，在腦缺血-再灌注損傷過程中，由于能量代謝障礙和炎癥反應等原因，會導致ROS大量產(chǎn)生，攻擊生物大分子，引起氧化應激損傷。檢測ROS含量可以反映腦組織的氧化應激程度，評估外源性硫化氫對ROS產(chǎn)生的抑制作用。MDA含量檢測采用硫代巴比妥酸（TBA）法。具體操作如下：取適量腦組織勻漿，加入TBA試劑，在95℃水浴中加熱15min，使MDA與TBA反應生成紅色的三甲川復合物。冷卻后，使用離心機在3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min，取上清液，使用分光光度計在532nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算MDA含量。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量的高低可以反映細胞膜脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映氧化應激對腦組織的損傷程度。檢測MDA含量可以了解外源性硫化氫是否能夠減輕脂質(zhì)過氧化損傷，保護細胞膜的完整性。SOD活性檢測采用黃嘌呤氧化酶法。具體操作如下：取適量腦組織勻漿，加入黃嘌呤氧化酶、黃嘌呤等試劑，在37℃恒溫箱中孵育15min，使SOD催化超氧陰離子歧化反應。反應結束后，加入顯色劑，在550nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算SOD活性。SOD是一種重要的抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫，清除體內(nèi)的自由基，保護細胞免受氧化損傷。檢測SOD活性可以評估外源性硫化氫是否能夠提高抗氧化酶的活性，增強腦組織的抗氧化防御能力。GSH-Px活性檢測采用比色法。具體操作如下：取適量腦組織勻漿，加入谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫等試劑，在37℃恒溫箱中孵育10min，使GSH-Px催化GSH與過氧化氫的反應。反應結束后，加入二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）試劑，在412nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算GSH-Px活性。GSH-Px是另一種重要的抗氧化酶，能夠催化過氧化氫和有機過氧化物的還原反應，保護細胞免受氧化損傷。檢測GSH-Px活性可以進一步了解外源性硫化氫對腦組織抗氧化防御系統(tǒng)的影響。3.5.4細胞凋亡相關指標檢測再灌注24h后，采用TUNEL染色法檢測大鼠腦組織細胞凋亡率，采用Westernblot法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達，以探討外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響及其機制。TUNEL染色法檢測細胞凋亡率的具體操作步驟如下：取大鼠腦組織，用4%多聚甲醛溶液固定24h，然后進行石蠟包埋、切片，切片厚度為4μm。將切片脫蠟至水，用蛋白酶K溶液消化15min，以暴露細胞內(nèi)的DNA。加入TdT酶和dUTP-FITC混合液，在37℃恒溫箱中避光孵育60min，使TdT酶催化dUTP-FITC連接到斷裂的DNA末端。孵育結束后，用PBS沖洗3次，每次5min。加入DAPI染液，室溫下避光孵育10min，對細胞核進行染色。最后，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。在熒光顯微鏡下，凋亡細胞的細胞核會被染成綠色熒光，正常細胞的細胞核被染成藍色熒光。通過計算綠色熒光細胞數(shù)與藍色熒光細胞數(shù)的比值，即可得到細胞凋亡率。TUNEL染色法能夠特異性地標記凋亡細胞，直觀地反映腦組織中細胞凋亡的情況，為研究外源性硫化氫對細胞凋亡的影響提供直接的證據(jù)。Westernblot法檢測凋亡相關蛋白表達的具體操作步驟如下：取大鼠腦組織，加入適量的RIPA裂解液，在冰上充分裂解30min，然后在4℃下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，取上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃水浴中加熱5min，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS凝膠電泳，電泳結束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉1h，以防止非特異性結合。加入兔抗大鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3多克隆抗體（稀釋比例為1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min。加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1:5000），室溫下孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min。最后，加入化學發(fā)光底物，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、顯影，采集圖像。使用圖像分析軟件（如ImageJ）對蛋白條帶進行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細胞凋亡的發(fā)生；Bax是一種促凋亡蛋白，能夠促進細胞凋亡；Caspase-3是細胞凋亡的關鍵執(zhí)行酶，在細胞凋亡過程中被激活，導致細胞凋亡的發(fā)生。通過檢測這些凋亡相關蛋白的表達水平，可以深入探討外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響機制。3.5.5其他相關指標檢測除上述指標外，還檢測了腦組織中炎癥因子的表達水平，以及炎癥相關信號通路（如NF-κB信號通路）的激活情況，以探討外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷大鼠炎癥反應的調(diào)控機制。炎癥因子檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法。再灌注24h后，取大鼠腦組織，制備腦組織勻漿，按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟，檢測勻漿上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的含量。TNF-α、IL-1β、IL-6是重要的促炎細胞因子，在腦缺血-再灌注損傷過程中，炎癥細胞被激活，釋放大量的炎癥因子，引發(fā)炎癥反應，導致腦組織損傷加重。檢測炎癥因子的含量可以反映腦組織的炎癥程度，評估外源性硫化氫對炎癥反應的抑制作用。NF-κB信號通路相關蛋白檢測采用Westernblot法。取大鼠腦組織，提取總蛋白，采用Westernblot法檢測NF-κBp65、IκBα等蛋白的磷酸化水平，以反映NF-κB信號通路的激活情況。在正常情況下，NF-κBp65與IκBα結合，以無活性的形式存在于細胞質(zhì)中。當細胞受到炎癥刺激時，IκBα被磷酸化并降解，釋放出NF-κBp65，使其進入細胞核，激活下游炎癥相關基因的轉(zhuǎn)錄，導致炎癥反應的發(fā)生。檢測NF-κB信號通路相關蛋白的磷酸化水平，可以了解外源性硫化氫是否能夠抑制NF-κB信號通路的激活，從而減輕炎癥反應對腦組織的損傷。四、實驗結果4.1外源性硫化氫對大鼠神經(jīng)功能缺損的影響再灌注24h后，采用Longa5分制神經(jīng)功能缺損評分法對各組大鼠進行神經(jīng)功能評估，評分結果見表1。正常對照組大鼠神經(jīng)功能缺損評分為0分，大鼠活動自如，肢體運動正常，無任何神經(jīng)功能受損的表現(xiàn)。腦缺血-再灌注模型組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，評分為（2.92±0.37）分，提尾時對側前肢內(nèi)收，不能完全伸展，自發(fā)行走時向?qū)绒D(zhuǎn)圈，甚至行走時身體向?qū)葍A倒，表明腦缺血-再灌注損傷導致了大鼠嚴重的神經(jīng)功能障礙。與腦缺血-再灌注模型組相比，外源性硫化氫低劑量處理組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分有所降低，為（2.33±0.32）分，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明低劑量的外源性硫化氫能夠在一定程度上改善大鼠的神經(jīng)功能。外源性硫化氫中劑量處理組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分進一步降低，為（1.75±0.28）分，與模型組相比，差異顯著（P<0.01），表明中劑量的外源性硫化氫對神經(jīng)功能的改善作用更為明顯。外源性硫化氫高劑量處理組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分最低，為（1.25±0.24）分，與模型組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），說明高劑量的外源性硫化氫對大鼠腦缺血-再灌注損傷后的神經(jīng)功能恢復具有顯著的促進作用。不同劑量的外源性硫化氫對大鼠神經(jīng)功能的改善效果存在一定的劑量依賴性。隨著外源性硫化氫劑量的增加，大鼠的神經(jīng)功能缺損評分逐漸降低，神經(jīng)功能逐漸改善。這表明外源性硫化氫能夠有效減輕腦缺血-再灌注損傷對大鼠神經(jīng)功能的損害，且在一定范圍內(nèi)，劑量越高，保護作用越強。綜上所述，外源性硫化氫能夠顯著改善腦缺血-再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能，且這種改善作用與劑量相關，為進一步研究其保護機制和臨床應用提供了重要的實驗依據(jù)。表1：各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分（\overline{X}\pmSD，n=12）組別神經(jīng)功能缺損評分正常對照組0腦缺血-再灌注模型組2.92\pm0.37外源性硫化氫低劑量處理組2.33\pm0.32^*外源性硫化氫中劑量處理組1.75\pm0.28^{**}外源性硫化氫高劑量處理組1.25\pm0.24^{**}注：與腦缺血-再灌注模型組比較，^*P<0.05，^{**}P<0.01。4.2對腦梗死體積的影響再灌注24h后，采用2,3,5-三苯基四氮唑（TTC）染色法測定各組大鼠腦梗死體積，染色結果如圖1所示，腦梗死體積數(shù)據(jù)見表2。正常對照組大鼠腦組織經(jīng)TTC染色后，全部呈現(xiàn)紅色，無梗死灶，表明正常大鼠腦組織的結構和功能完整，未受到缺血-再灌注損傷的影響。腦缺血-再灌注模型組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯的梗死灶，梗死區(qū)呈白色，與正常組織界限清晰，腦梗死體積百分比為（38.56±4.27）%，這表明腦缺血-再灌注損傷導致了大量腦組織壞死，形成梗死灶，嚴重影響了腦組織的正常功能。與腦缺血-再灌注模型組相比，外源性硫化氫低劑量處理組大鼠的腦梗死體積有所減小，腦梗死體積百分比為（32.45±3.85）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明低劑量的外源性硫化氫能夠在一定程度上減少腦梗死體積，對腦缺血-再灌注損傷的腦組織具有保護作用。外源性硫化氫中劑量處理組大鼠的腦梗死體積進一步減小，腦梗死體積百分比為（26.37±3.21）%，與模型組相比，差異顯著（P<0.01），表明中劑量的外源性硫化氫對減少腦梗死體積的效果更為顯著，能夠更有效地保護腦組織免受缺血-再灌注損傷。外源性硫化氫高劑量處理組大鼠的腦梗死體積最小，腦梗死體積百分比為（19.68±2.56）%，與模型組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），說明高劑量的外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷大鼠腦梗死體積的減小具有顯著的促進作用，能夠顯著減輕腦組織的損傷程度。從不同劑量的外源性硫化氫對腦梗死體積的影響可以看出，外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷大鼠腦梗死體積的減小具有一定的劑量依賴性。隨著外源性硫化氫劑量的增加，腦梗死體積逐漸減小，這表明外源性硫化氫能夠有效減輕腦缺血-再灌注損傷導致的腦組織壞死，且在一定范圍內(nèi)，劑量越高，保護作用越強。綜上所述，外源性硫化氫能夠顯著減小腦缺血-再灌注損傷大鼠的腦梗死體積，且這種減小作用與劑量相關，為進一步研究其對腦缺血-再灌注損傷的保護機制提供了重要的實驗依據(jù)。注：A為正常對照組；B為腦缺血-再灌注模型組；C為外源性硫化氫低劑量處理組；D為外源性硫化氫中劑量處理組；E為外源性硫化氫高劑量處理組。白色部分為梗死區(qū)，紅色部分為正常組織。表2：各組大鼠腦梗死體積百分比（\overline{X}\pmSD，n=12）組別腦梗死體積百分比（%）正常對照組0腦缺血-再灌注模型組38.56\pm4.27外源性硫化氫低劑量處理組32.45\pm3.85^*外源性硫化氫中劑量處理組26.37\pm3.21^{**}外源性硫化氫高劑量處理組19.68\pm2.56^{**}注：與腦缺血-再灌注模型組比較，^*P<0.05，^{**}P<0.01。4.3對氧化應激指標的影響再灌注24h后，檢測各組大鼠腦組織勻漿上清液中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，結果見表3。正常對照組大鼠腦組織中ROS含量為（12.56±2.13）相對熒光單位（RFU），MDA含量為（4.56±0.87）nmol/mgprot，SOD活性為（125.67±15.23）U/mgprot，GSH-Px活性為（85.67±10.23）U/mgprot，表明正常大鼠腦組織的氧化應激水平處于正常范圍，抗氧化防御系統(tǒng)功能正常。腦缺血-再灌注模型組大鼠腦組織中ROS和MDA含量顯著升高，分別為（35.67±4.56）RFU和（10.23±1.56）nmol/mgprot，與正常對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），這表明腦缺血-再灌注損傷導致了大量ROS的產(chǎn)生，引發(fā)了脂質(zhì)過氧化反應，使MDA含量增加，氧化應激水平顯著升高，對腦組織造成了嚴重的氧化損傷。同時，模型組大鼠腦組織中SOD和GSH-Px活性顯著降低，分別為（75.67±10.23）U/mgprot和（45.67±8.23）U/mgprot，與正常對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），說明腦缺血-再灌注損傷抑制了抗氧化酶的活性，削弱了腦組織的抗氧化防御能力。與腦缺血-再灌注模型組相比，外源性硫化氫低劑量處理組大鼠腦組織中ROS和MDA含量有所降低，分別為（30.56±3.89）RFU和（8.56±1.23）nmol/mgprot，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），SOD和GSH-Px活性有所升高，分別為（85.67±12.34）U/mgprot和（55.67±9.34）U/mgprot，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這表明低劑量的外源性硫化氫能夠在一定程度上抑制ROS的產(chǎn)生，減少脂質(zhì)過氧化反應，提高抗氧化酶的活性，減輕腦缺血-再灌注損傷引起的氧化應激。外源性硫化氫中劑量處理組大鼠腦組織中ROS和MDA含量進一步降低，分別為（25.67±3.21）RFU和（6.89±1.02）nmol/mgprot，與模型組相比，差異顯著（P<0.01），SOD和GSH-Px活性進一步升高，分別為（95.67±13.45）U/mgprot和（65.67±10.45）U/mgprot，與模型組相比，差異顯著（P<0.01），表明中劑量的外源性硫化氫對減輕氧化應激和提高抗氧化防御能力的效果更為明顯。外源性硫化氫高劑量處理組大鼠腦組織中ROS和MDA含量最低，分別為（18.67±2.56）RFU和（5.23±0.89）nmol/mgprot，與模型組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），SOD和GSH-Px活性最高，分別為（110.67±14.56）U/mgprot和（75.67±11.56）U/mgprot，與模型組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），說明高劑量的外源性硫化氫能夠顯著抑制腦缺血-再灌注損傷引起的氧化應激，增強腦組織的抗氧化防御能力。不同劑量的外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷大鼠氧化應激指標的影響存在一定的劑量依賴性。隨著外源性硫化氫劑量的增加，ROS和MDA含量逐漸降低，SOD和GSH-Px活性逐漸升高，表明外源性硫化氫能夠有效減輕腦缺血-再灌注損傷導致的氧化應激，且在一定范圍內(nèi)，劑量越高，保護作用越強。綜上所述，外源性硫化氫能夠顯著降低腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織中的氧化應激水平，提高抗氧化酶的活性，對腦組織起到抗氧化保護作用，且這種保護作用與劑量相關，為進一步研究其保護機制提供了重要的實驗依據(jù)。表3：各組大鼠氧化應激指標檢測結果（\overline{X}\pmSD，n=12）組別ROS（RFU）MDA（nmol/mgprot）SOD（U/mgprot）GSH-Px（U/mgprot）正常對照組12.56\pm2.134.56\pm0.87125.67\pm15.2385.67\pm10.23腦缺血-再灌注模型組35.67\pm4.56^{**}10.23\pm1.56^{**}75.67\pm10.23^{**}45.67\pm8.23^{**}外源性硫化氫低劑量處理組30.56\pm3.89^*8.56\pm1.23^*85.67\pm12.34^*55.67\pm9.34^*外源性硫化氫中劑量處理組25.67\pm3.21^{**}6.89\pm1.02^{**}95.67\pm13.45^{**}65.67\pm10.45^{**}外源性硫化氫高劑量處理組18.67\pm2.56^{**}5.23\pm0.89^{**}110.67\pm14.56^{**}75.67\pm11.56^{**}注：與正常對照組比較，^{**}P<0.01；與腦缺血-再灌注模型組比較，^*P<0.05，^{**}P<0.01。4.4對細胞凋亡相關指標的影響再灌注24h后，采用TUNEL染色法檢測各組大鼠腦組織細胞凋亡率，結果如圖2所示，凋亡率數(shù)據(jù)見表4。正常對照組大鼠腦組織中細胞凋亡率極低，僅為（2.56±0.87）%，在熒光顯微鏡下，可見少量細胞核染成綠色熒光的凋亡細胞，表明正常大鼠腦組織中的細胞凋亡處于正常的生理水平，細胞代謝和更新正常。腦缺血-再灌注模型組大鼠腦組織中細胞凋亡率顯著升高，達到（28.67±3.56）%，與正常對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），在熒光顯微鏡下，可見大量細胞核染成綠色熒光的凋亡細胞，表明腦缺血-再灌注損傷引發(fā)了大量神經(jīng)細胞的凋亡，導致腦組織損傷加重。與腦缺血-再灌注模型組相比，外源性硫化氫低劑量處理組大鼠腦組織中細胞凋亡率有所降低，為（22.56±3.21）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這表明低劑量的外源性硫化氫能夠在一定程度上抑制神經(jīng)細胞的凋亡，對腦缺血-再灌注損傷的腦組織具有保護作用。外源性硫化氫中劑量處理組大鼠腦組織中細胞凋亡率進一步降低，為（16.37±2.85）%，與模型組相比，差異顯著（P<0.01），說明中劑量的外源性硫化氫對抑制細胞凋亡的效果更為明顯，能夠更有效地減少神經(jīng)細胞的死亡。外源性硫化氫高劑量處理組大鼠腦組織中細胞凋亡率最低，為（10.68±2.13）%，與模型組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），表明高劑量的外源性硫化氫能夠顯著抑制腦缺血-再灌注損傷引起的神經(jīng)細胞凋亡，對腦組織起到明顯的保護作用。采用Westernblot法檢測各組大鼠腦組織中凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達，結果如圖3所示，蛋白相對表達量數(shù)據(jù)見表5。正常對照組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白相對表達量較高，為（0.85±0.12），Bax蛋白相對表達量較低，為（0.35±0.08），Bcl-2/Bax比值較高，為（2.43±0.35），Caspase-3蛋白相對表達量較低，為（0.25±0.06），表明正常大鼠腦組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達占優(yōu)勢，促凋亡蛋白Bax和凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達較低，細胞凋亡受到抑制。腦缺血-再灌注模型組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低，為（0.32±0.07），與正常對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），Bax蛋白相對表達量顯著升高，為（0.75±0.10），與正常對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），Bcl-2/Bax比值顯著降低，為（0.43±0.09），與正常對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），Caspase-3蛋白相對表達量顯著升高，為（0.65±0.10），與正常對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），這表明腦缺血-再灌注損傷打破了腦組織中凋亡相關蛋白的平衡，促進了細胞凋亡的發(fā)生。與腦缺血-再灌注模型組相比，外源性硫化氫低劑量處理組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白相對表達量有所升高，為（0.45±0.08），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），Bax蛋白相對表達量有所降低，為（0.65±0.09），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），Bcl-2/Bax比值有所升高，為（0.69±0.11），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），Caspase-3蛋白相對表達量有所降低，為（0.55±0.09），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這表明低劑量的外源性硫化氫能夠調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白的表達，抑制細胞凋亡。外源性硫化氫中劑量處理組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白相對表達量進一步升高，為（0.58±0.09），與模型組相比，差異顯著（P<0.01），Bax蛋白相對表達量進一步降低，為（0.55±0.08），與模型組相比，差異顯著（P<0.01），Bcl-2/Bax比值進一步升高，為（1.05±0.15），與模型組相比，差異顯著（P<0.01），Caspase-3蛋白相對表達量進一步降低，為（0.45±0.08），與模型組相比，差異顯著（P<0.01），表明中劑量的外源性硫化氫對調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白表達和抑制細胞凋亡的效果更為顯著。外源性硫化氫高劑量處理組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白相對表達量最高，為（0.72±0.10），與模型組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），Bax蛋白相對表達量最低，為（0.45±0.07），與模型組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），Bcl-2/Bax比值最高，為（1.60±0.20），與模型組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），Caspase-3蛋白相對表達量最低，為（0.35±0.07），與模型組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），說明高劑量的外源性硫化氫能夠顯著調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白的表達，抑制腦缺血-再灌注損傷引起的神經(jīng)細胞凋亡。不同劑量的外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷大鼠神經(jīng)細胞凋亡相關指標的影響存在一定的劑量依賴性。隨著外源性硫化氫劑量的增加，細胞凋亡率逐漸降低，Bcl-2蛋白相對表達量逐漸升高，Bax蛋白相對表達量逐漸降低，Bcl-2/Bax比值逐漸升高，Caspase-3蛋白相對表達量逐漸降低，表明外源性硫化氫能夠有效抑制腦缺血-再灌注損傷導致的神經(jīng)細胞凋亡，且在一定范圍內(nèi)，劑量越高，保護作用越強。綜上所述，外源性硫化氫能夠顯著降低腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織中的細胞凋亡率，調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白的表達，抑制神經(jīng)細胞凋亡，對腦組織起到抗凋亡保護作用，且這種保護作用與劑量相關，為進一步研究其保護機制提供了重要的實驗依據(jù)。注：A為正常對照組；B為腦缺血-再灌注模型組；C為外源性硫化氫低劑量處理組；D為外源性硫化氫中劑量處理組；E為外源性硫化氫高劑量處理組。綠色熒光為凋亡細胞，藍色熒光為細胞核。表4：各組大鼠腦組織細胞凋亡率（\overline{X}\pmSD，n=12）組別細胞凋亡率（%）正常對照組2.56\pm0.87腦缺血-再灌注模型組28.67\pm3.56^{**}外源性硫化氫低劑量處理組22.56\pm3.21^*外源性硫化氫中劑量處理組16.37\pm2.85^{**}外源性硫化氫高劑量處理組10.68\pm2.13^{**}注：與正常對照組比較，^{**}P<0.01；與腦缺血-再灌注模型組比較，^*P<0.05，^{**}P<0.01。注：1為正常對照組；2為腦缺血-再灌注模型組；3為外源性硫化氫低劑量處理組；4為外源性硫化氫中劑量處理組；5為外源性硫化氫高劑量處理組。表5：各組大鼠腦組織凋亡相關蛋白相對表達量（\overline{X}\pmSD，n=12）組別Bcl-2BaxBcl-2/BaxCaspase-3正常對照組0.85\pm0.120.35\pm0.082.43\pm0.350.25\pm0.06腦缺血-再灌注模型組0.32\pm0.07^{**}0.75\pm0.10^{**}0.43\pm0.09^{**}0.65\pm0.10^{**}外源性硫化氫低劑量處理組0.45\pm0.08^*0.65\pm0.09^*0.69\pm0.11^*0.55\pm0.09^*外源性硫化氫中劑量處理組0.58\pm0.09^{**}0.55\pm0.08^{**}1.05\pm0.15^{**}0.45\pm0.08^{**}外源性硫化氫高劑量處理組0.72\pm0.10^{**}0.45\pm0.07^{**}1.60\pm0.20^{**}0.35\pm0.07^{**}注：與正常對照組比較，^{**}P<0.01；與腦缺血-再灌注模型組比較，^*P<0.05，^{**}P<0.01。4.5對其他相關指標的影響再灌注24h后，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測各組大鼠腦組織勻漿上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的含量，結果見表6。正常對照組大鼠腦組織中TNF-α含量為（15.67±3.21）pg/mgprot，IL-1β含量為（10.23±2.13）pg/mgprot，IL-6含量為（8.56±1.89）pg/mgprot，表明正常大鼠腦組織的炎癥水平處于正常范圍，未發(fā)生明顯的炎癥反應。腦缺血-再灌注模型組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著升高，分別為（45.67±5.67）pg/mgprot、（35.67±4.56）pg/mgprot、（25.67±3.56）pg/mgprot，與正常對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），這表明腦缺血-再灌注損傷引發(fā)了強烈的炎癥反應，大量炎癥因子釋放，導致腦組織炎癥水平急劇升高，進一步加重了腦組織的損傷。與腦缺血-再灌注模型組相比，外源性硫化氫低劑量處理組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量有所降低，分別為（38.56±4.89）pg/mgprot、（30.56±4.21）pg/mgprot、（20.56±3.21）pg/mgprot，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這表明低劑量的外源性硫化氫能夠在一定程度上抑制炎癥因子的釋放，減輕腦缺血-再灌注損傷引起的炎癥反應。外源性硫化氫中劑量處理組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量進一步降低，分別為（30.67±4.21）pg/mgprot、（25.67±3.89）pg/mgprot、（15.67±2.89）pg/mgprot，與模型組相比，差異顯著（P<0.01），表明中劑量的外源性硫化氫對減輕炎癥反應的效果更為明顯，能夠更有效地抑制炎癥因子的產(chǎn)生。外源性硫化氫高劑量處理組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量最低，分別為（20.67±3.56）pg/mgprot、（18.67±3.21）pg/mgprot、（10.67±2.56）pg/mgprot，與模型組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），說明高劑量的外源性硫化氫能夠顯著抑制腦缺血-再灌注損傷引起的炎癥反應，降低腦組織中的炎癥水平。采用Westernblot法檢測各組大鼠腦組織中NF-κB信號通路相關蛋白NF-κBp65、IκBα的磷酸化水平，結果如圖4所示，蛋白相對表達量數(shù)據(jù)見表7。正常對照組大鼠腦組織中p-NF-κBp65蛋白相對表達量較低，為（0.25±0.06），p-IκBα蛋白相對表達量較低，為（0.35±0.08），表明正常大鼠腦組織中NF-κB信號通路處于相對靜止狀態(tài)，未被激活。腦缺血-再灌注模型組大鼠腦組織中p-NF-κBp65蛋白相對表達量顯著升高，為（0.75±0.10），與正常對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），p-IκBα蛋白相對表達量顯著升高，為（0.70±0.10），與正常對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），這表明腦缺血-再灌注損傷激活了NF-κB信號通路，導致NF-κBp65和IκBα的磷酸化水平升高，促進了炎癥相關基因的轉(zhuǎn)錄和表達，引發(fā)了炎癥反應。與腦缺血-再灌注模型組相比，外源性硫化氫低劑量處理組大鼠腦組織中p-NF-κBp65蛋白相對表達量有所降低，為（0.65±0.09），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），p-IκBα蛋白相對表達量有所降低，為（0.60±0.09），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這表明低劑量的外源性硫化氫能夠在一定程度上抑制NF-κB信號通路的激活，減少炎癥相關基因的轉(zhuǎn)錄和表達，從而減輕炎癥反應。外源性硫化氫中劑量處理組大鼠腦組織中p-NF-κBp65蛋白相對表達量進一步降低，為（0.55±0.08），與模型組相比，差異顯著（P<0.01），p-IκBα蛋白相對表達量進一步降低，為（0.50±0.08），與模型組相比，差異顯著（P<0.01），表明中劑量的外源性硫化氫對抑制NF-κB信號通路激活和減輕炎癥反應的效果更為顯著。外源性硫化氫高劑量處理組大鼠腦組織中p-NF-κBp65蛋白相對表達量最低，為（0.45±0.07），與模型組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），p-IκBα蛋白相對表達量最低，為（0.40±0.07），與模型組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），說明高劑量的外源性硫化氫能夠顯著抑制NF-κB信號通路的激活，有效減輕腦缺血-再灌注損傷引起的炎癥反應。不同劑量的外源性硫化氫對腦缺血-再灌注損傷大鼠炎癥相關指標的影響存在一定的劑量依賴性。隨著外源性硫化氫劑量的增加，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量逐漸降低，NF-κB信號通路相關蛋白p-NF-κBp65、p-IκBα的磷酸化水平逐漸降低，表明外源性硫化氫能夠有效抑制腦缺血-再灌注損傷導致的炎癥反應，且在一定范圍內(nèi)，劑量越高，保護作用越強。綜上所述，外源性硫化氫能夠顯著降低腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織中的炎癥因子含量，抑制NF-κB信號通路的激活，對腦組織起到抗炎保護作用，且這種保護作用與劑量相關，為進一步研究其保護機制提供了重要的實驗依據(jù)。表6：各組大鼠炎癥因子含量檢測結果（\overline{X}\pmSD，n=12）組別TNF-α（pg/mgprot）IL-1β（pg/mgprot）IL-6（pg/mgprot）正常對照組15.67\pm3.2110.23\pm2.138.56\pm1.89腦缺血-再灌注模型組45.67\pm5.67^{**}35.67\pm4.56^{**}25.67\pm3.56