項目類別項目批準號附件3華南農業(yè)大學大學生科技創(chuàng)新活動項目結題書項目名稱：H7亞型禽流感特異性RT－PCR檢測方法的建立、條件優(yōu)化及應用申請人：徐珊、張停婷、陳梓棟所在院部：獸醫(yī)學院專業(yè)年級：動物醫(yī)學2002級聯(lián)系電話：3152627513824497804指導教師:辛朝安、任濤職稱教授、副教授立項日期：二○○五年四月五日結題日期：二○○六年四月五日華南農業(yè)大學大學生科技創(chuàng)新活動項目指導中心填表說明一、填寫結題報告書前，請先咨詢指導教師或有關專業(yè)教師。申請書的各項內容要求實事求是，逐條認真填寫。表達明確、嚴謹，一律要求用打印稿件。二、申請書為A4復印紙，于左側裝訂成冊。一式三份（至少一份原件），由指導教師和所在院（部）審查并簽署意見后報大學生科技創(chuàng)新活動項目指導中心。三、一級標題三號宋體加粗，用“一、二、三”標示；二級標題四號楷體加粗，用“（一）（二）（三）”標示；三級標題四號仿宋加粗，用“1、2、3”標示；四級標題四號仿宋，用“①②③”標示。示例：一、《XXXX》課題立項與研究的目的意義（一）《XXXX》課題立項與研究的目的的意義1、《XXXX》課題立項與研究的目的意義①《XXXX》課題立項與研究的目的意義四、如表格不夠，可以加附頁。簡表項目簡況項目名稱H7亞型禽流感特異性RTPCR檢測方法的建立、條件優(yōu)化及應用項目類別A、文科類；B、理科類；申請經費1500元起止年月2005年4月－2006年4月項目組成員姓名性別出生年月年級專業(yè)班級所在學院上學年綜合測評分項目中的分工本人簽字徐珊女1983年4月動物醫(yī)學2002級1班獸醫(yī)學院78.47引物設計和條件優(yōu)化徐珊張停婷女1982年2月動物醫(yī)學2002級1班獸醫(yī)學院76.66特異性試驗和動物試驗張停婷陳梓棟男1983年9月動物醫(yī)學2002級1班獸醫(yī)學院83.07敏感性試驗和動物試驗陳梓棟指導教師情況姓名辛朝安性別男學位碩士職稱教授研究方向預防獸醫(yī)學，病毒學授課名稱禽病學姓名任濤性別男學位博士職稱副教授研究方向預防獸醫(yī)學，病毒學授課名稱動物病毒分子生物學項目簡介本研究建立了禽流感病毒（AIV）A型H7亞型特異性RTPCR的檢測技術，用于檢測H7亞型AIV。所建立的RTPCR方法從核酸提取、基因擴增到產物分析在34h內即可完成。通過對AIV的HA基因其他亞型如H1、H3、H5、H9及常見RNA病毒IBV、NDV等的檢測表明無交叉反應；對AIVH7亞型尿囊液能檢出的最低稀釋度達104，相當于0.8×102.76EID50。用該方法分別檢測通過人工發(fā)病采集的78份棉拭子樣品和100份組織病料樣品，并與雞胚病毒分離結果做比較，二者H7亞型的鑒定結果陽性符合率高達90.5％。結果表明，該方法具有快速、敏感、特異等優(yōu)點，為臨診樣品中AIVH7亞型鑒定和快速診斷的有效方法，同時還具有較好的生物安全性。二、項目研究的內容與方法1、引物設計參照禽流感病毒H7亞型血凝素（HA）設計合成了一對的特異性、敏感性好的引物SN1和SN2。上游引物SN1：5’>TCTTCD(T)TTCTATGCR(G)GAGATGAA<3’下游引物SN2：5’>TR(G)AAR(G)GTV(C)ACY(T)GTGTCATTR(G)G<3’（D=A/G/T,R=A/G,V=A/G/C,Y=C/T）2、條件優(yōu)化對退火溫度、Mg2+濃度、dNTP濃度、PCR的引物濃度、擴增溫度、酶的用量、引物用量及循環(huán)參數(shù)等進行優(yōu)化，提高PCR反應的產量和特異性。反應條件確定如下：25uL反應體系：ddH2O16.7ul；10×Buffer2.5ul；dNTPs2.5ul；上、下游引物各0.5ul(20pmol/ml)；EXTaq(Taq)0.5ul(2.5U)；反轉錄產物2uL。反應程序：95°C3min；95°C45sec；52.2°C45sec；72°C45sec30個循環(huán)；72°C8min。3、特異性試驗用所建立的RTPCR方法對家禽其他常見病毒IBV、ILTV、NDV、AIV（H1、H3、H5、H9亞型）進行檢測，結果表明無交叉反應。4、敏感性試驗利用所設計合成的引物對感染性尿囊液的檢測低限為1045、臨床樣品檢測①非免疫雞組織臟器、咽和肛拭子的RTPCR與雞胚病毒分離檢測方法的比較用實驗室保存的AIVH7進行人工感染試驗，采集人工感染的雞進行臟器組織病料、咽和肛拭子進行RTPCR檢測和雞胚病毒分離檢測，比較兩者的陽性符合率。②大量樣品的檢測對實驗室保存的NDV、IBV、ILTV、IBDV、MDV等，以及多個亞型禽流感病毒生物學特性研究、疫苗研究等采集的樣品，進行AIVH7亞型RTPCR模擬臨床檢驗，分析結果并比較與雞胚病毒分離法的符合率。三、項目研究過程與資料查閱情況（一）研究過程1、2005.082005.09：設計合成引物。2、2005.092005.12：對PCR反應條件進行優(yōu)化。3、2005.122005.01：特異性試驗和敏感性試驗。4、2005.012006.03：臨床樣品的檢測試驗。（二）資料查閱1、辛朝安，2003，禽病學（第三版）.北京：中國農業(yè)大學出版社。2、[美]J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾，2002，分子克隆實驗指南（第三版），科學出版社。3、殷震，劉景華，1985，動物病毒學，科學出版社。4、[美]F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆爾，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾，1998，精編分子生物學實驗指南，科學出版社。5、盧圣棟，1993，現(xiàn)代分子生物學實驗技術，高等教育出版社。6、RichardA.Collins,LungSangKo,KingYipFung,etal.RapidandsensitivedetectionofavaininfluenzavirussubtypeH7usingNASBA.BiochemicalandBiophysicalResearchmunications300.2003,5075157、龐耀珊，謝芝勛，鄧顯文等，多重RTPCR診斷方法的建立，2005，21（7）：593597，中國人畜共患病雜志。8、劉燕，錢愛東，禽流感病毒H5和H9亞型RTPCR檢測方法的建立，2004,26(1):9396，吉林農業(yè)大學學報。9、朱文斯，賴平安，黃茵華等，熒光RTPCR快速檢測禽流感病毒H5亞型的研究，中國醫(yī)藥導刊，2003，1（5）：2810、陳化蘭，于康震，禽流感病毒A/Afri.Star/EngQ/983/79/(H7N1)血凝素基因的全序列分析,1998，20（5）：258，中國畜禽傳染病，11、鄭曉飛，RNA實驗技術手冊，2004四、項目成果完成形式和價值設計合成多對針對高致病性禽流感病毒H7亞型的引物，篩選一對特異性、敏感性好的引物。利用這對引物，通過對RTPCR反應體系和反應條件的優(yōu)化，建立了高致病性禽流感病毒H7亞型特異性RTPCR檢測方法。該方法敏感性可達104稀釋度，相當于0.8×102.76EID50，特異性好，與NDV、IBV、ILTV以及AIV的其它亞型間無交叉反應。利用所建立的RTPCR方法檢測雞組織病料及咽、肛拭子，檢測結果與雞胚病毒分離培養(yǎng)陽性符合率高達90.5％，該RTPCR檢測所需時間短，將傳統(tǒng)雞胚分離病毒診斷方法一周左右的時間縮短為34h小時，為AIVH7亞型鑒定和快速診斷提供了有效的方法。1、通過該項研究建立了高致病性禽流感病毒H7亞型特異性RTPCR檢測方法，為我國對H7亞型HPAIV的預防與控制打下堅實的基礎。2、本研究的課題為任濤副教授擔任主要研究人員的“十五”國家重點科技攻關項目，該項目培養(yǎng)了2名碩士研究生，1名博士生，2人晉升副高職稱。制定了H7亞型HPAIV的RTPCR診斷規(guī)程，正擬申報國家規(guī)程。3、本研究培養(yǎng)了2名本科生完成兩篇本科畢業(yè)論文。五、經費使用情況（一）實驗材料費：6000元包括反轉錄酶及RTPCR試劑和其它分子生物學試劑，試驗動物，SPF雞胚，試驗消耗性器材等（二）科研業(yè)業(yè)務費：1000元包括有關資料的收集和復印，以及論文的印制等（三）合計：7000元注：本課題向學校申請創(chuàng)新活動項目經費1500元，其余均由獸醫(yī)學院禽病學教研室資助。六、申請人對該項目研究工作完成后的認識總結通過本研究我們對于如何進行科研選題、課題的設計以及基本科學素質和態(tài)度都有了很深刻的認識。進行科學實驗以及解決問題時，在尊重客觀事實的基礎上，應該力求創(chuàng)新，尤其是技術創(chuàng)新，實現(xiàn)科學價值。本課題研究工作歷時一年，課題成員3人對聚合酶鏈式反應（PCR）一無所知到有了較深的認識，并且能夠較熟練地運用。利用PCR高度敏感性、高度特異性、操作簡便、快速、使用樣品廣泛以及還可以同時進行大批量樣品檢測的特點建立各種病原的RTPCR檢測方法，可以廣泛地用于生產。七、指導教師對項目完成情況的意見該項目針對我國高致病性禽流感的巨大危害與潛在威脅，研發(fā)針對H7亞型HPAI的快速RTPCR診斷方法，具有重大的戰(zhàn)略儲備意義。幾位研究成員刻苦鉆研，已較好地建立了H7亞型HPAI的RTPCR診斷方法，并完成了條件優(yōu)化，初步應用表明該方法具有特異、敏感、快速等的優(yōu)點。簽字：年月日八、項目所在單位專家評審意見簽字：