2025年全球基因編輯行業(yè)概述及發(fā)展歷程調(diào)研報告基因編輯技術(shù)作為現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域的核心技術(shù)之一，正以前所未有的速度推動著生物醫(yī)學(xué)、\o"農(nóng)業(yè)"農(nóng)業(yè)、生物制藥等多個領(lǐng)域的變革與發(fā)展，其中CRISPR-Cas9技術(shù)的出現(xiàn)更是使基因編輯的精準(zhǔn)性、效率和應(yīng)用范圍得到了極大提升，宛如一把“神奇的手術(shù)刀”，為攻克遺傳性疾病、培育優(yōu)良農(nóng)作物品種、開發(fā)創(chuàng)新藥物等提供了革命性的解決方案。一、基因編輯技術(shù)行業(yè)概述?1、定義?根據(jù)北京研精畢智信息咨詢發(fā)布的\o"調(diào)研報告"調(diào)研報告指出，基因編輯又被稱作基因組編輯，是一項能夠?qū)ι矬w基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行精確修飾的技術(shù)。其核心原理是借助核酸內(nèi)切酶，精準(zhǔn)識別并切斷目標(biāo)DNA序列，造成DNA雙鏈斷裂（DSBs）。當(dāng)DNA雙鏈斷裂發(fā)生后，生物體自身會啟動兩種主要的修復(fù)機(jī)制：非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HR）。?非同源末端連接修復(fù)途徑在沒有修復(fù)模板基因的情況下被觸發(fā)，此過程中，斷裂的DNA末端會直接連接，然而這種連接方式往往不夠精確，大概率會產(chǎn)生插入或缺失突變，導(dǎo)致整個基因發(fā)生移碼突變，進(jìn)而使基因失去原有的功能，基于此原理的基因編輯技術(shù)通常被用于基因敲除，即通過破壞特定基因的功能，研究其在生物體內(nèi)的作用，或者用于治療某些由基因功能異常導(dǎo)致的疾病。?同源重組修復(fù)途徑則需要有與目的DNA兩側(cè)同源的供體DNA模板（雙鏈質(zhì)?；蚴菃捂淒NA）存在時才會啟用。在這一過程中，生物體按照供體DNA模板來修復(fù)目的基因序列，能夠?qū)⒀芯空哳A(yù)先設(shè)計的供體基因精確插入到目標(biāo)位點，實現(xiàn)對基因的定向改造，這種基因編輯技術(shù)被稱為基因敲入。基因敲入技術(shù)在基因治療中具有重要應(yīng)用，例如可以將正常的基因片段敲入到患者體內(nèi)的特定基因位點，以替代有缺陷的基因，從而治療某些遺傳性疾?。辉谏镏扑庮I(lǐng)域，也可通過基因敲入技術(shù)改造微生物，使其能夠高效生產(chǎn)特定的蛋白質(zhì)藥物。通過對這兩種修復(fù)機(jī)制的巧妙利用，基因編輯技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對DNA序列的刪除、插入、替換等多種遺傳改造操作，為生命科學(xué)研究和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用開辟了廣闊的前景。無論是在探索基因功能、研發(fā)新型藥物，還是在治療疑難病癥等方面，基因編輯技術(shù)都展現(xiàn)出了巨大的潛力和應(yīng)用價值，成為現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域中不可或缺的關(guān)鍵技術(shù)之一。?2、主要技術(shù)介紹?根據(jù)\o"市場調(diào)研"市場調(diào)研發(fā)現(xiàn)，自基因編輯技術(shù)誕生以來，經(jīng)過不斷的發(fā)展和創(chuàng)新，已經(jīng)涌現(xiàn)出多種各具特色的技術(shù)方法，其中鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）技術(shù)、CRISPR/Cas技術(shù)以及RNA編輯技術(shù)等在基因編輯領(lǐng)域占據(jù)了重要地位，它們各自具有獨特的作用機(jī)制、優(yōu)勢和應(yīng)用場景，推動著基因編輯技術(shù)在不同領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用和深入發(fā)展。?1.2.1ZFN技術(shù)?鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)是第一代人工核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，其核心在于利用鋅指蛋白來實現(xiàn)對特定DNA序列的精準(zhǔn)識別。鋅指蛋白是一種具有特殊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)中包含多個鋅指結(jié)構(gòu)域，每個鋅指結(jié)構(gòu)域通常由約30個氨基酸組成，能夠特異性地識別并結(jié)合DNA上的3個連續(xù)堿基對。通過合理設(shè)計和組合不同的鋅指結(jié)構(gòu)域，可以構(gòu)建出能夠識別任意特定DNA序列的鋅指蛋白。?將鋅指蛋白與核酸酶FokI進(jìn)行融合，形成具有切割活性的鋅指核酸酶。當(dāng)鋅指蛋白識別并結(jié)合到目標(biāo)DNA序列后，與之融合的FokI核酸酶會被招募到該位點。FokI核酸酶需要形成二聚體才能發(fā)揮切割活性，只有當(dāng)兩個ZFN分子分別結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上相鄰的位點時，F(xiàn)okI核酸酶才能形成二聚體，進(jìn)而對DNA雙鏈進(jìn)行切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂。?ZFN技術(shù)的顯著優(yōu)點是具有較高的特異性，能夠相對精準(zhǔn)地定位到目標(biāo)DNA序列并進(jìn)行編輯，這使得它在基因治療和基因功能研究等領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用價值。例如，在基因治療中，ZFN技術(shù)可以用于糾正某些致病基因的突變，為一些遺傳性疾病的治療提供了新的途徑；在基因功能研究中，科研人員可以利用ZFN技術(shù)敲除特定基因，觀察生物體的表型變化，從而深入了解基因的功能。?然而，ZFN技術(shù)也存在一些明顯的局限性。首先，其設(shè)計和構(gòu)建過程極為復(fù)雜，需要對鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有深入的了解，并且需要耗費大量的時間和精力來篩選和優(yōu)化能夠特異性識別目標(biāo)序列的鋅指蛋白組合。其次，ZFN技術(shù)的成本較高，這在一定程度上限制了其大規(guī)模的應(yīng)用和推廣。此外，由于ZFN技術(shù)可能會引發(fā)細(xì)胞的免疫反應(yīng)，對細(xì)胞造成損傷，這也增加了其在實際應(yīng)用中的風(fēng)險和不確定性。?1.2.2TALEN技術(shù)?轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）技術(shù)是第二代基因編輯技術(shù)，其原理基于植物病原體黃單胞菌分泌的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子（TALE）。TALE蛋白具有獨特的結(jié)構(gòu)，其中心重復(fù)區(qū)域由一系列高度保守的重復(fù)單元組成，每個重復(fù)單元通常包含33-35個氨基酸。這些重復(fù)單元的氨基酸序列存在微小差異，正是這些差異決定了TALE蛋白對不同DNA堿基的特異性識別能力。?每個TALE重復(fù)單元能夠特異性地識別并結(jié)合DNA上的一個堿基，通過將不同的TALE重復(fù)單元進(jìn)行有序排列，可以構(gòu)建出能夠識別任意特定DNA序列的TALE蛋白。將TALE蛋白與核酸酶FokI進(jìn)行融合，形成TALEN分子。當(dāng)TALE蛋白識別并結(jié)合到目標(biāo)DNA序列后，F(xiàn)okI核酸酶會被招募到該位點。同樣，F(xiàn)okI核酸酶需要形成二聚體才能發(fā)揮切割活性，只有當(dāng)兩個TALEN分子分別結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上相鄰的位點時，F(xiàn)okI核酸酶才能形成二聚體，進(jìn)而對DNA雙鏈進(jìn)行切割，實現(xiàn)對目標(biāo)基因的編輯。?TALEN技術(shù)相較于ZFN技術(shù)具有一些明顯的優(yōu)勢。首先，TALEN的設(shè)計相對簡單，其識別DNA序列的機(jī)制更加直接和易于理解，科研人員可以根據(jù)目標(biāo)DNA序列較為方便地設(shè)計和構(gòu)建相應(yīng)的TALEN分子，大大縮短了研發(fā)周期。其次，TALEN技術(shù)具有更高的特異性，能夠更準(zhǔn)確地定位到目標(biāo)基因序列，減少脫靶效應(yīng)的發(fā)生，這在基因治療和基因功能研究等對準(zhǔn)確性要求極高的領(lǐng)域具有重要意義。例如，在基因治療中，TALEN技術(shù)可以更精準(zhǔn)地修復(fù)致病基因的突變，降低對正?；虻挠绊?，提高治療的安全性和有效性；在基因功能研究中，高特異性的TALEN技術(shù)可以更可靠地敲除或修飾特定基因，為深入探究基因功能提供更有力的工具。?然而，TALEN技術(shù)也并非完美無缺。構(gòu)建TALEN分子的過程仍然較為耗時，需要進(jìn)行多步的克隆和組裝操作，這在一定程度上限制了其應(yīng)用的效率。此外，TALEN技術(shù)的成本相對較高，這也使得其在一些對成本較為敏感的研究和應(yīng)用場景中受到一定的制約。?1.2.3CRISPR/Cas技術(shù)?CRISPR/Cas技術(shù)，全稱為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白技術(shù)，是第三代基因編輯技術(shù)，也是目前應(yīng)用最為廣泛和深入的基因編輯技術(shù)之一。該技術(shù)源于細(xì)菌和古細(xì)菌的免疫系統(tǒng)，是它們抵御外來病毒和噬菌體入侵的重要防御機(jī)制。?CRISPR序列由一系列短的重復(fù)序列（repeat）和間隔序列（spacer）交替排列組成。當(dāng)細(xì)菌受到病毒或噬菌體的入侵時，病毒的DNA片段會被整合到CRISPR序列中，成為新的間隔序列。這些間隔序列記錄了病毒的遺傳信息，相當(dāng)于細(xì)菌的“免疫記憶”。當(dāng)相同的病毒再次入侵時，CRISPR序列會轉(zhuǎn)錄生成pre-crRNA，pre-crRNA經(jīng)過加工后形成成熟的crRNA。crRNA會與Cas蛋白結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合體。在這個復(fù)合體中，crRNA起到引導(dǎo)作用，它能夠憑借其與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)的部分，引導(dǎo)Cas蛋白特異性地靶向識別入侵病毒的核酸。?Cas蛋白家族具有多種類型，其中最為人們所熟知的是Cas9蛋白。Cas9蛋白含有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域：HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC-like結(jié)構(gòu)域。當(dāng)crRNA引導(dǎo)Cas9蛋白識別并結(jié)合到目標(biāo)DNA序列后，HNH結(jié)構(gòu)域會切割與crRNA互補(bǔ)的DNA鏈，RuvC-like結(jié)構(gòu)域則會切割另一條DNA鏈，從而在目標(biāo)位點產(chǎn)生雙鏈斷裂。細(xì)胞自身的DNA修復(fù)機(jī)制會對雙鏈斷裂進(jìn)行修復(fù)，在修復(fù)過程中，通過引入特定的供體DNA模板，可以實現(xiàn)對目標(biāo)基因的精確編輯，如基因敲除、基因插入或基因替換等操作。?CRISPR/Cas技術(shù)具有諸多顯著的優(yōu)勢，使其在基因編輯領(lǐng)域迅速崛起并得到廣泛應(yīng)用。首先，該技術(shù)操作簡便，科研人員只需設(shè)計與目標(biāo)基因互補(bǔ)的crRNA序列，即可引導(dǎo)Cas蛋白對目標(biāo)基因進(jìn)行編輯，相較于ZFN和TALEN技術(shù)，大大降低了技術(shù)門檻和操作難度。其次，CRISPR/Cas技術(shù)成本低廉，不需要復(fù)雜的蛋白質(zhì)設(shè)計和構(gòu)建過程，只需合成相應(yīng)的RNA序列，這使得更多的科研團(tuán)隊和實驗室能夠開展相關(guān)研究。再者，CRISPR/Cas技術(shù)具有高效性，能夠在較短的時間內(nèi)實現(xiàn)對目標(biāo)基因的編輯，并且編輯效率較高，大大提高了研究和應(yīng)用的效率。此外，CRISPR/Cas技術(shù)還具有廣泛的適用性，不僅可以應(yīng)用于細(xì)菌、植物、動物等多種生物體系，還可以用于基因功能研究、基因治療、作物育種、生物制藥等多個領(lǐng)域。?在基因功能研究方面，CRISPR/Cas技術(shù)可以快速構(gòu)建基因敲除或敲入的細(xì)胞模型和動物模型，幫助科研人員深入了解基因的功能和作用機(jī)制；在基因治療領(lǐng)域，CRISPR/Cas技術(shù)為治療多種遺傳性疾病和疑難病癥帶來了新的希望，例如鐮狀細(xì)胞貧血、囊性纖維化等單基因遺傳病，通過對患者體內(nèi)致病基因的編輯，有望實現(xiàn)從根本上治愈疾?。辉谧魑镉N中，CRISPR/Cas技術(shù)可以精準(zhǔn)地改良農(nóng)作物的性狀，培育出具有抗病蟲害、耐旱、高產(chǎn)等優(yōu)良特性的新品種，為保障全球糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了有力支持；在生物制藥領(lǐng)域，CRISPR/Cas技術(shù)可以用于優(yōu)化藥物研發(fā)過程，提高藥物的質(zhì)量和產(chǎn)量，開發(fā)出更高效、更安全的藥物。?然而，CRISPR/Cas技術(shù)也存在一些潛在的風(fēng)險和挑戰(zhàn)。其中最為突出的問題是脫靶效應(yīng)，即Cas蛋白可能會在非目標(biāo)位點進(jìn)行切割，導(dǎo)致非預(yù)期的基因突變，這可能會對生物體的正常生理功能產(chǎn)生負(fù)面影響，甚至引發(fā)新的疾病。此外，CRISPR/Cas技術(shù)在應(yīng)用過程中還可能引發(fā)倫理道德爭議，例如在人類生殖細(xì)胞編輯方面，可能會改變?nèi)祟惖倪z傳基因庫，對人類的遺傳多樣性和未來發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，因此需要謹(jǐn)慎對待和嚴(yán)格監(jiān)管。?1.2.4RNA編輯技術(shù)?RNA編輯技術(shù)是一種新興的基因編輯技術(shù)，與傳統(tǒng)的DNA編輯技術(shù)不同，它主要是在RNA水平上對遺傳信息進(jìn)行修飾和調(diào)控，具有可逆性和動態(tài)調(diào)控的特點。RNA編輯的過程主要涉及一類特殊的酶，其中腺苷酸脫氨酶（ADARs）是最為常見的一類。ADARs能夠識別RNA分子中的特定堿基，通常是腺嘌呤（A），并將其脫氨基轉(zhuǎn)化為肌苷（I）。由于肌苷在RNA翻譯過程中會被識別為鳥嘌呤（G），因此這種堿基的改變會導(dǎo)致RNA序列與其對應(yīng)的DNA序列產(chǎn)生差異，從而實現(xiàn)對基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能的調(diào)控。?RNA編輯技術(shù)在多個領(lǐng)域展現(xiàn)出了重要的應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景。在神經(jīng)系統(tǒng)研究中，RNA編輯發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，尤其是在腦發(fā)育和功能調(diào)控方面。通過對神經(jīng)元細(xì)胞中關(guān)鍵RNA分子的編輯，可以模擬或修復(fù)與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，深入研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制，并為開發(fā)針對性的治療方法提供理論依據(jù)。例如，某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能是由于特定RNA分子的異常表達(dá)或功能缺陷導(dǎo)致的，通過RNA編輯技術(shù)對這些RNA分子進(jìn)行精準(zhǔn)修飾，有望恢復(fù)其正常功能，從而達(dá)到治療疾病的目的。?在疾病模型研究領(lǐng)域，RNA編輯技術(shù)為構(gòu)建特定的疾病模型提供了有力工具。科研人員可以通過編輯關(guān)鍵基因的RNA序列，模擬疾病相關(guān)突變的效應(yīng)，在細(xì)胞或生物體水平上構(gòu)建出與人類疾病相似的模型，用于深入研究疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、尋找新的治療靶點以及評估藥物的療效和安全性。例如，對于一些復(fù)雜的多基因遺傳病，傳統(tǒng)的研究方法往往難以準(zhǔn)確模擬疾病的病理過程，而RNA編輯技術(shù)可以在不改變基因組DNA的前提下，精準(zhǔn)地調(diào)控相關(guān)基因的RNA表達(dá)和功能，從而更真實地模擬疾病狀態(tài)，為疾病研究提供更有效的模型。?在藥物研發(fā)方面，RNA編輯技術(shù)也具有巨大的潛力。通過對RNA序列的編輯，可以調(diào)控特定基因的表達(dá)水平或功能，為開發(fā)針對特定疾病的治療方法開辟新的途徑。例如，針對某些癌癥，科研人員可以利用RNA編輯技術(shù)靶向調(diào)控與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，或者增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，提高對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力；對于一些遺傳性疾病，也可以通過RNA編輯技術(shù)修復(fù)突變的RNA序列，恢復(fù)正常的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能，從而達(dá)到治療疾病的目的。此外，RNA編輯技術(shù)還可以用于優(yōu)化藥物的作用靶點，提高藥物的特異性和療效，降低藥物的副作用。?在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，RNA編輯技術(shù)同樣具有重要的應(yīng)用前景。通過對作物RNA序列的編輯，可以改善作物的多種性狀，如提高作物的產(chǎn)量、增強(qiáng)作物對病蟲害的抗性、提升作物的逆境適應(yīng)能力等。例如，通過編輯作物中與光合作用相關(guān)的RNA分子，可以提高作物的光合效率，從而增加作物的產(chǎn)量；編輯與作物抗病相關(guān)的RNA序列，可以使作物獲得對特定病蟲害的抗性，減少農(nóng)藥的使用，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，同時也有利于環(huán)境保護(hù)和生態(tài)平衡。二、基因編輯技術(shù)行業(yè)發(fā)展歷程?1、早期探索?基因編輯技術(shù)的發(fā)展可以追溯到20世紀(jì)70年代，當(dāng)時正值基因工程的萌芽階段。1970年，科學(xué)家SmithH?O等從流感病毒中成功提取了第一個限制性內(nèi)切酶HindII，這一發(fā)現(xiàn)成為基因編輯技術(shù)發(fā)展歷程中的重要里程碑。限制性內(nèi)切酶能夠識別雙鏈DNA分子上的特異序列，這些識別區(qū)通常具有回紋結(jié)構(gòu)，并且可以使兩個特定核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，從而實現(xiàn)對DNA的切割。這一特性為基因操作提供了關(guān)鍵工具，使得科學(xué)家們能夠在分子層面上對DNA進(jìn)行精確的切割和重組，為后續(xù)基因編輯技術(shù)的發(fā)展奠定了堅實基礎(chǔ)。?隨著對限制性內(nèi)切酶研究的深入，越來越多的限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)和鑒定。截至目前，已從微生物中發(fā)現(xiàn)了超過200種限制性內(nèi)切酶，其中大部分能夠切割DNA形成粘性末端，如EcoRI，它能夠識別6個堿基的特定序列“5’-GAATTC-3’，3’-CTTAAG-5’”，并在識別位點進(jìn)行切割，形成具有互補(bǔ)堿基的粘性末端，這種粘性末端使得不同來源的DNA片段能夠通過堿基互補(bǔ)配對的方式進(jìn)行連接，為基因重組提供了便利條件。?在這一時期，科學(xué)家們利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行了大量的基因操作實驗，包括將外源DNA片段與載體連接，構(gòu)建重組DNA分子。通過將重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞，實現(xiàn)了外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，開啟了基因工程的新紀(jì)元。例如，1973年，Cohen和Boyer等人成功地將來自不同生物的DNA片段連接起來，并將其導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中，實現(xiàn)了外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)，這一實驗標(biāo)志著基因工程技術(shù)的正式誕生，也為基因編輯技術(shù)的發(fā)展提供了重要的實踐經(jīng)驗和技術(shù)支持。?2、技術(shù)革新階段?1993年，CRISPR-Cas天然免疫系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)為基因編輯技術(shù)的發(fā)展帶來了新的契機(jī)。當(dāng)時，科學(xué)家們在對細(xì)菌和古菌的研究中，發(fā)現(xiàn)了一種獨特的DNA序列，即成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR），以及與之相關(guān)的蛋白（Cas），它們共同構(gòu)成了CRISPR-Cas系統(tǒng)，這一系統(tǒng)被證明是細(xì)菌和古菌抵御外來病毒和噬菌體入侵的重要防御機(jī)制。然而，在發(fā)現(xiàn)初期，CRISPR-Cas系統(tǒng)的功能和作用機(jī)制并未被完全理解，其在基因編輯領(lǐng)域的潛在應(yīng)用也尚未被充分發(fā)掘。?進(jìn)入21世紀(jì)，隨著對CRISPR-Cas系統(tǒng)研究的不斷深入，科學(xué)家們逐漸揭示了其工作原理。2005年，兩項獨立的研究表明，CRISPR間隔序列與噬菌體、病毒和質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的序列相似，并且病毒不會感染具有同源間隔序列的細(xì)菌，這一發(fā)現(xiàn)揭示了CRISPR序列在原核生物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的重要作用。2007年，Danisco的研究人員通過實驗進(jìn)一步證實，將源自噬菌體基因組序列的新間隔序列整合到易受噬菌體攻擊的細(xì)菌中，能夠改變細(xì)菌細(xì)胞對噬菌體的抵抗力，從而首次演示了CRISPR系統(tǒng)可以作為細(xì)菌的一種獲得性免疫機(jī)制，防御外來遺傳物質(zhì)的侵入。這些研究成果為CRISPR-Cas系統(tǒng)在基因編輯領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。與此同時，2000年左右，RNA干擾（RNAi）技術(shù)的出現(xiàn)也為基因編輯領(lǐng)域帶來了新的突破。RNAi是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)的同源mRNA特異性降解的過程，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。1995年，Guo等在利用反義技術(shù)研究線蟲的基因功能時，首次觀察到了RNAi現(xiàn)象。1998年，F(xiàn)ire等將靶向Par-1基因的正反義鏈RNA混合物注入線蟲卵中，發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA（dsRNA）抑制靶基因表達(dá)的能力比任一單鏈RNA強(qiáng)10倍以上，并且靶mRNA受到明顯的干擾，呈現(xiàn)出可傳遞給后代的特異表型，從而正式提出了“dsRNA介導(dǎo)的RNA干擾”現(xiàn)象。此后，RNAi技術(shù)在植物、動物、真菌等多種生物中得到了廣泛證實和深入研究。?RNAi技術(shù)的作用機(jī)制主要包括起始階段和效應(yīng)階段。在起始階段，外源導(dǎo)入或由轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)座子、病毒感染等方式引入的dsRNA被細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶切割成21-23nt長的小分子干擾RNA片段（siRNA），這些siRNA具有3’末端有兩個堿基凸出，5’末端為磷酸的雙鏈結(jié)構(gòu)。在效應(yīng)階段，雙鏈siRNA被包裹進(jìn)入一個多蛋白復(fù)合體中，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）。在ATP存在的情況下，RISC被激活，雙鏈siRNA打開，其中的單鏈siRNA作為向?qū)?，引?dǎo)RISC尋找與之互補(bǔ)的靶mRNA，然后內(nèi)切核酸酶在siRNA附近切割mRNA，使其降解，從而實現(xiàn)對靶基因表達(dá)的抑制。?RNAi技術(shù)的出現(xiàn)為基因功能研究和基因治療等領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)大的工具。通過設(shè)計和合成針對特定基因的siRNA，可以特異性地沉默目標(biāo)基因的表達(dá)，從而研究該基因的功能和作用機(jī)制。在基因治療方面，RNAi技術(shù)可以用于抑制致病基因的表達(dá)，為治療某些遺傳性疾病和病毒性疾病提供了新的策略和方法。例如，在癌癥治療中，通過RNAi技術(shù)沉默與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，有望抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖；在抗病毒治療中，針對病毒基因設(shè)計的siRNA可以有效抑制病毒的復(fù)制和傳播。?3、CRISPR-Cas9技術(shù)的突破?2012年，JenniferDoudna和EmmanuelleCharpentier在《Science》雜志上發(fā)表了一篇具有里程碑意義的論文，揭示了CRISPR-Cas9基因編輯的詳細(xì)作用機(jī)制，并指出了其作為基因組編輯工具的巨大潛力。她們的研究發(fā)現(xiàn)，Cas9蛋白可以利用RNA分子作為引導(dǎo)，識別并切割特定的DNA序列。在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，CRISPR序列轉(zhuǎn)錄生成的pre-crRNA經(jīng)過加工后形成成熟的crRNA，crRNA與反式激活CRISPRRNA（tracrRNA）結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物與Cas9蛋白結(jié)合后，能夠引導(dǎo)Cas9蛋白特異性地靶向目標(biāo)DNA序列。Cas9蛋白含有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域：HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC-like結(jié)構(gòu)域，當(dāng)識別到目標(biāo)DNA序列后，HNH結(jié)構(gòu)域切割與crRNA互補(bǔ)的DNA鏈，RuvC-like結(jié)構(gòu)域切割另一條DNA鏈，從而在目標(biāo)位點產(chǎn)生雙鏈斷裂。這