分子生物學(xué)技術(shù)62430常用實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)62430四大常用基本技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）免疫組織化學(xué)技術(shù)（免疫組化）免疫印跡技術(shù)（Westernblot）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)局限性聯(lián)合應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)62430常用分子生物學(xué)技術(shù)RNA的提取和cDNA合成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和產(chǎn)物克隆重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化及篩選質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定測(cè)序技術(shù)

DNA酶切及凝膠電泳

分子生物學(xué)技術(shù)62430RNA制備

Trizol法適用于人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無(wú)蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點(diǎn)分析，斑點(diǎn)雜交，Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。RNA提取試劑盒：國(guó)產(chǎn)、進(jìn)口

常用總RNA提取試劑盒盡量選用含DNA酶的試劑盒分子生物學(xué)技術(shù)62430步驟以50-100mg組織加入1mlTrizol液研磨，注意樣品總體積不能超過(guò)所用Trizol體積的10%。

研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。

取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。

棄去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時(shí)可55℃-60℃水溶10分鐘。RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。

分子生物學(xué)技術(shù)62430逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（cDNA合成）逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）：是指在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以RNA為模板合成DNA的過(guò)程。分子生物學(xué)技術(shù)62430逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的基本成分模板:組織或培養(yǎng)細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄酶：AMV:禽類成髓細(xì)胞性白血病病毒

M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒引物:oligodT,randomprimer等。RNA酶抑制劑底物：等濃度的四種dNTP反應(yīng)環(huán)境:緩沖液（RTbuffer）可單獨(dú)購(gòu)買或逆轉(zhuǎn)錄試劑盒分子生物學(xué)技術(shù)62430逆轉(zhuǎn)錄酶定義：是RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶。具有三種酶活性：RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶RNaseH的活性分子生物學(xué)技術(shù)62430在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，總RNA中的mRNA在體外被反向轉(zhuǎn)錄合成DNA拷貝，因拷貝DNA的核苷酸序列完全互補(bǔ)于模板mRNA，稱之為互補(bǔ)DNA（cDNA）；利用DNA聚合酶，以cDNA第一鏈為模板，以四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）為材料，在引物的引導(dǎo)下復(fù)制出大量的cDNA或目的片段逆轉(zhuǎn)錄酶分子生物學(xué)技術(shù)62430OligodT：適用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于OligodT要結(jié)合到PolyA尾巴上，所以對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，即使有少量降解也會(huì)使全長(zhǎng)cDNA合成量大大減少。隨機(jī)引物：適用于長(zhǎng)的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA。適用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。主要用于單一模板的RT-PCR反應(yīng)?；蛱禺愋砸铮号c模板序列互補(bǔ)的引物，適用于目的序列已知的情況。引物分子生物學(xué)技術(shù)62430cDNA合成最常用的引物是與真核細(xì)胞mRNA分子3'端poly(A)結(jié)合的12-18核苷酸長(zhǎng)的oligo(dT)。

分子生物學(xué)技術(shù)62430避免RNA酶污染由于RNA分子容易受RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解,加上RNA酶極為穩(wěn)定且廣泛存在,因而在提取過(guò)程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染,并設(shè)法抑制其活性,這是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。在cDNA生成之前，也就是RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中都要避免RNA酶污染。分子生物學(xué)技術(shù)62430DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑,它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。實(shí)驗(yàn)用品用0.1%DEPC水處理，高壓蒸汽滅菌后烤干備用或購(gòu)買經(jīng)過(guò)處理的無(wú)RNA酶實(shí)驗(yàn)用品。操作過(guò)程中帶手套、口罩。避免RNA酶污染分子生物學(xué)技術(shù)62430PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增：指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA。一種選擇性體外擴(kuò)增DNA的方法.一種將微量的目的DNA片段在體外快速、大量擴(kuò)增的技術(shù)。半保留復(fù)制分子生物學(xué)技術(shù)62430三個(gè)基本步驟:(1)變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈;(2)退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過(guò)氫鍵配(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下,以目的DNA為模板進(jìn)行合成.由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)數(shù)百倍。

分子生物學(xué)技術(shù)62430PCR反應(yīng)體系的基本成分模板:cDNA引物:與模板DNA特異互補(bǔ)的單鏈寡聚核苷酸片段，一般18-30bp,上下游引物DNA聚合酶:如Taq酶底物:等濃度的四種核苷酸（dNTP）反應(yīng)環(huán)境:含有Mg2＋的Tris-Cl緩沖液。含DNA聚合酶的2×反應(yīng)混合物分子生物學(xué)技術(shù)62430模板：PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好).就模板DNA而言,影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度.PCR反應(yīng)體系的基本成分分子生物學(xué)技術(shù)62430引物：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上下游引物所決定。與模板DNA特異互補(bǔ)的單鏈寡聚核苷酸片段，一般18-30bp,上下游引物引物長(zhǎng)度約為16-30bp，太短會(huì)降低退火溫度影響引物與模板配對(duì)，從而使非特異性增高。引物中G+C含量通常為40%-60%四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3'端不存在連續(xù)3個(gè)G或C,因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。PCR反應(yīng)體系的基本成分分子生物學(xué)技術(shù)62430引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對(duì)應(yīng),以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)。在引物內(nèi),尤其在3'端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)兩引物之間尤其在3'端不能互補(bǔ),以防出現(xiàn)引物二聚體,減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。引物5'端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大,可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等.通常應(yīng)在5'端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基PCR反應(yīng)體系的基本成分分子生物學(xué)技術(shù)62430引物的選擇與設(shè)計(jì)從文獻(xiàn)中查找利用引物設(shè)計(jì)軟件獲得：如Primer3在線軟件Blast分析

PubMedBLASTnucleotideblast

分子生物學(xué)技術(shù)62430TaqDNA聚合酶：TaqDNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下,30min,摻入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。致命弱點(diǎn)：出錯(cuò)率底物（dNTP）：一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200μmol/L。4種dNTP的濃度應(yīng)該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。含Mg2+的反應(yīng)緩沖液：Mg2+濃度對(duì)TaqDNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性和真實(shí)性,影響引物退火和解鏈溫度,影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等PCR反應(yīng)體系的基本成分分子生物學(xué)技術(shù)62430分子生物學(xué)技術(shù)62430分子生物學(xué)技術(shù)62430PCR反應(yīng)的條件預(yù)變性：94℃，5min變性：94℃,30s,模板DNA變性成為單鏈退火：Tm-5℃,30s，引物與模板DNA結(jié)合延伸：72℃，與擴(kuò)增片段長(zhǎng)度有關(guān)，

<1Kb,1min；>1Kb,延長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)數(shù)：25-35，平臺(tái)期之前。最終延伸：72℃，10min。分子生物學(xué)技術(shù)62430結(jié)果分析保證內(nèi)參照均一的情況下，比較目的條帶常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。分子生物學(xué)技術(shù)62430實(shí)時(shí)定量RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合，實(shí)現(xiàn)目的基因mRNA表達(dá)的定量分析。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程監(jiān)測(cè)方法有兩種：熒光染料監(jiān)測(cè)：SYBRGreen熒光染料熒光探針監(jiān)測(cè)：TaqMan探針?lè)肿由飳W(xué)技術(shù)62430RT-PCR定義：將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（ReverseTranscription）和cDNA的聚合酶鏈擴(kuò)增（PolymeraseChainReaction）聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。目前對(duì)目的基因的mRNA表達(dá)進(jìn)行定性和半定量分析的最常用方法。分子生物學(xué)技術(shù)62430RT-PCR步驟提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RNA提取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNAPCR：以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增合成目的片段。瓊脂糖凝膠電泳分子生物學(xué)技術(shù)62430RT-PCR應(yīng)用用途:1.檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)水平（定性、半定量）

2.獲得目的基因全長(zhǎng)編碼序列，用于基因克隆優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、敏感局限性：不能準(zhǔn)確反應(yīng)基因表達(dá)狀況分子生物學(xué)技術(shù)62430PCR產(chǎn)物的克隆

所用PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)盡量小,以減少平臺(tái)效應(yīng)，非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾。PCR產(chǎn)物插入到載體中有下列一些方法：

平末端連接：TaqDNA聚合酶在PCR產(chǎn)物3'端加上多余的非模板依賴堿基。

粘性末端連接：利用引物中附加在5'端的限制酶位點(diǎn),直接將PCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端,與載體連接,產(chǎn)生重組DNA.如果下游兩個(gè)引物中含有兩個(gè)不同的限制酶位點(diǎn).經(jīng)酶切后定向克隆到載體中。

分子生物學(xué)技術(shù)62430常用分子生物學(xué)技術(shù)RNA的提取和cDNA合成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和產(chǎn)物克隆重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化及篩選質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定測(cè)序技術(shù)

DNA酶切及凝膠電泳

分子生物學(xué)技術(shù)62430重組質(zhì)粒的連接

質(zhì)粒(Plasmid)：是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開(kāi)宿主細(xì)胞則不能存活,而宿主即使沒(méi)有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對(duì)抗生素的抗性等。分子生物學(xué)技術(shù)62430現(xiàn)在習(xí)慣上用來(lái)專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。具有穩(wěn)定可靠和操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。重組質(zhì)粒的連接

分子生物學(xué)技術(shù)62430質(zhì)粒載體（vector）是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的。與天然質(zhì)粒相比,質(zhì)粒載體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因)和一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量盡可能減少,以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列,這些用途包括通過(guò)組織化學(xué)方法肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生用于序列測(cè)定的單鏈DNA、體外轉(zhuǎn)錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達(dá)等。重組質(zhì)粒的連接

分子生物學(xué)技術(shù)62430一個(gè)理想的克隆載體大致應(yīng)有下列一些特性：分子量小、多拷貝、松馳控制型具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)能插入較大的外源DNA片段具有容易操作的檢測(cè)表型。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡(jiǎn)稱pBS）等。

重組質(zhì)粒的連接

分子生物學(xué)技術(shù)62430克隆原理先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段,然后體外使兩者相連接,再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌,即可完成。

重組質(zhì)粒的連接

分子生物學(xué)技術(shù)62430外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種：帶有相同的粘性末端：用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。帶有平末端：是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補(bǔ)平所致。重組質(zhì)粒的連接

分子生物學(xué)技術(shù)62430分子生物學(xué)技術(shù)62430轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

分子生物學(xué)技術(shù)62430感受態(tài)細(xì)胞：最常用E.coliDH5a菌株受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法(如電擊法,CaCl2,RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenentcells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

分子生物學(xué)技術(shù)62430為了提高轉(zhuǎn)化效率,實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí),轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5％

重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

分子生物學(xué)技術(shù)62430試劑的質(zhì)量防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行,所用器皿,如離心管,tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染,重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

分子生物學(xué)技術(shù)62430初步篩選：抗性篩選轉(zhuǎn)化子鑒定：菌落PCR，酶切電泳檢測(cè)，測(cè)序技術(shù)重組質(zhì)粒的篩選

分子生物學(xué)技術(shù)62430初步篩選：進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀?？剐院Y選：Amp+，Kan+,Neo+等α-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選：藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒的篩選

分子生物學(xué)技術(shù)62430α-互補(bǔ)帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和β-半乳糖苷酶N端146個(gè)氨基酸的編碼序列。E.coliDH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨(dú)立的情況下,載體

和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒(méi)有酶活性。但在載體和DH5α融為一體時(shí)可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。重組質(zhì)粒的篩選

分子生物學(xué)技術(shù)62430這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酸陰性突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象叫α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+細(xì)菌較易識(shí)別。生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源片段插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上后會(huì)導(dǎo)致讀碼框架改變,表達(dá)蛋白失活,產(chǎn)生的氨基酸片段失去α-互補(bǔ)能力,因此在同樣條件下含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。重組質(zhì)粒的篩選

分子生物學(xué)技術(shù)62430在麥康凱培養(yǎng)基上，α-互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+細(xì)菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麥康凱培養(yǎng)基中的乳糖，產(chǎn)生乳酸，使pH下降，因而產(chǎn)生紅色菌落，而當(dāng)外源片段插入后，失去α-互補(bǔ)能力，因而不產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，無(wú)法分解培養(yǎng)基中的乳糖，菌落呈白色。由此可將重組質(zhì)粒與自身環(huán)化的載體DNA分開(kāi)。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。重組質(zhì)粒的篩選

分子生物學(xué)技術(shù)62430常用分子生物學(xué)技術(shù)RNA的提取和cDNA合成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和產(chǎn)物克隆重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化及篩選質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定測(cè)序技術(shù)

DNA酶切及凝膠電泳

分子生物學(xué)技術(shù)62430質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA包括3個(gè)基本步驟:培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增收集和裂解細(xì)胞分離和純化質(zhì)粒DNA分子生物學(xué)技術(shù)62430

常用質(zhì)粒提取方法：煮沸法

堿法

一般質(zhì)粒提取試劑盒三種形式(見(jiàn)后)：共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，簡(jiǎn)稱cccDNA)超螺旋DNA開(kāi)環(huán)DNA(OpencircularDNA,簡(jiǎn)稱ocDNA)線狀DNA(LinearDNA)

質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定分子生物學(xué)技術(shù)62430質(zhì)粒鑒定方法：酶切電泳PCR鑒定測(cè)序序列比對(duì)質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定分子生物學(xué)技術(shù)62430常用分子生物學(xué)技術(shù)RNA的提取和cDNA合成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和產(chǎn)物克隆重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化及篩選質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定測(cè)序技術(shù)

DNA酶切及凝膠電泳

分子生物學(xué)技術(shù)62430DNA酶切限制性內(nèi)切酶：限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應(yīng)條件下，1小時(shí)完全降解1uglambdaDNA(λ噬菌體中的DNA)的酶量為一個(gè)單位.分子生物學(xué)技術(shù)62430分類:Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ類Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子,然后從底物上解離。DNA酶切分子生物學(xué)技術(shù)62430Ⅱ類由兩種酶組成:一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列;另一種為獨(dú)立的甲基化酶,它修飾同一識(shí)別序列。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。DNA酶切分子生物學(xué)技術(shù)62430絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列雙鏈DNA中含有的二個(gè)結(jié)構(gòu)相同、方向相反的序列稱為反向重復(fù)序列，也稱為回文結(jié)構(gòu)，每條單鏈以任一方向閱讀時(shí)都與另一條鏈以相同方向閱讀時(shí)的序列是一致的DNA酶切分子生物學(xué)技術(shù)62430Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中,有的在對(duì)稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3')有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè),產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端,如EcoRⅠ切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。

DNA酶切分子生物學(xué)技術(shù)62430酶切活性：DNA純度緩沖液：雙酶切buffer的選擇溫度條件限制性內(nèi)切酶本身DNA酶切分子生物學(xué)技術(shù)62430應(yīng)用：基因克隆時(shí)轉(zhuǎn)化子鑒定構(gòu)建載體酶切片段及載體本身線性化載體DNA酶切分子生物學(xué)技術(shù)62430凝膠電泳

瓊脂糖

聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。

注意：EB為強(qiáng)誘變劑并有中等毒性,配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套,

注意操作，污染區(qū)域隔離

分子生物學(xué)技術(shù)62430瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。目前,一般實(shí)驗(yàn)室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行DNA電泳。

凝膠電泳

分子生物學(xué)技術(shù)62430瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)中,在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽(yáng)極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:1、DNA的分子大小:

線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

凝膠電泳

分子生物學(xué)技術(shù)624302、瓊脂糖濃度

給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。小于0.5kb膠濃度是1.2-1.5%,大于10kb膠濃度為0.3-0.7%,于兩者之間

膠濃度為0.8-1.0%。

凝膠電泳

分子生物學(xué)技術(shù)624303、DNA分子的構(gòu)象

當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。

超螺旋DNA>開(kāi)環(huán)