基因測(cè)序（一代測(cè)序和二代測(cè)序）用于臨床疑難病原體鑒定一、一代測(cè)序序用于臨床疑難病原體鑒定（可培養(yǎng)疑難病原體）人口不斷老齡化，器官移植和骨髓移植患者增多，免疫抑制劑和抗腫瘤等藥物大量使用，侵襲性操作不斷增加，細(xì)菌真菌嚴(yán)重感染患者不斷增加，臨床微生物檢驗(yàn)的標(biāo)本量不斷增加。部分培養(yǎng)出的細(xì)菌或真菌通過(guò)傳統(tǒng)生化反應(yīng)、表型方法、自動(dòng)化鑒定儀器、目前先進(jìn)的質(zhì)譜儀，憑借豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，仍然難以準(zhǔn)確鑒定。一代測(cè)序，一次測(cè)序一個(gè)基因，片段>1000bp，約30元/樣本。我們2010年以來(lái)，將一代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于臨床疑難細(xì)菌真菌鑒定，取得較好效果并發(fā)表SCI論著1篇。第一部分將結(jié)合我們的工作進(jìn)行介紹。二、二代測(cè)序用于臨床疑難病原體鑒定（難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)病原體）有些病原體難于培養(yǎng)或不可培養(yǎng)，少部分細(xì)菌和真菌，大部分病毒、螺旋體、衣原體、寄生蟲(chóng)。二代測(cè)序，一次測(cè)序多個(gè)基因，片段200~500bp，可對(duì)各類(lèi)臨床樣本直接二代測(cè)序，可得到數(shù)百萬(wàn)條基因片段，難在測(cè)序結(jié)果的生物信息學(xué)分析，約3000元/樣本。一、基因測(cè)序用于臨床疑難病原體鑒定（可培養(yǎng)疑難病原體，一代測(cè)序）（一）難鑒定細(xì)菌真菌一代測(cè)序方法（二）難鑒定細(xì)菌一代測(cè)序案例（三）難鑒定真菌一代測(cè)序案例（一）難鑒定細(xì)菌真菌一代測(cè)序方法細(xì)菌核糖體基因結(jié)構(gòu)特征16S

rRNA編碼基因約1500bp，包含約50個(gè)功能域。為細(xì)菌分類(lèi)的金標(biāo)準(zhǔn)，由可變區(qū)和保守區(qū)組成。保守區(qū)為細(xì)菌共有，可變區(qū)有屬或種特異性。真菌核糖體基因結(jié)構(gòu)特征18S

RNA基因、5.8SrDNA、28S

RNA基因較保守，不適合區(qū)分不同屬種。間隔區(qū)ITSl、5.8S

rDNA和間隔區(qū)ITS2在不同真菌屬及種間表現(xiàn)出較高的差異，目前已用于真菌分類(lèi)鑒定和分子檢測(cè)，以ITS2應(yīng)用最廣泛。細(xì)菌真菌DNA快速提取TaKaRa公司試劑盒（Lysis

Buffer

forMicroorganism

toDirect

PCR）。試劑盒中裂解緩沖液可以對(duì)G-菌、G+菌、酵母菌、霉菌等裂解，釋放其基因組DNA，結(jié)核桿菌、放線(xiàn)菌、諾卡菌也取得較好效果。粗制模板可直接用于PCR反應(yīng)，節(jié)省時(shí)間，但粗制模板可能含有抑制PCR的成分。細(xì)菌真菌核糖體基因PCR擴(kuò)增細(xì)菌通用引物序列：ccagcagccgcggtaatacg和atcgg(c/t)taccttgttacgacttc，擴(kuò)增16S

rRNA基因，片段996bp。真菌通用引物序列：gtgaatcatcgaatctttgaac和tcctccgcttattgatatgc，擴(kuò)增ITS2基因，片段194bp-494bp。經(jīng)電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物條帶亮（產(chǎn)量高），無(wú)雜帶（純度高）。提供100μlPCR產(chǎn)物、擴(kuò)增用引物，送公司測(cè)序。公司負(fù)責(zé)PCR產(chǎn)物純化及濃縮，雙向測(cè)序，序列拼接，網(wǎng)上接收測(cè)序結(jié)果電子版。PCR產(chǎn)物序列blastn分析流程PCR產(chǎn)物由華大基因科技公司等進(jìn)行商業(yè)測(cè)序，所得測(cè)序結(jié)果在GenBank進(jìn)行blastn。比對(duì)細(xì)菌的16SrRNA基因，相同性（identity）百分比大于99

可以定義到種的水平，97～99可以定義到屬的水平，小于97有可能是一個(gè)新種。真菌ITS2序列分析，相同性（identity）百分比大于99可以定義到種的水平。一代測(cè)序用于臨床疑難病原菌鑒定我們2010年以來(lái)，將一代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于臨床疑難細(xì)菌真菌鑒定，取得較好效果并發(fā)表SCI論著1篇。國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道臨床感染細(xì)菌2種，國(guó)內(nèi)首次報(bào)道臨床感染細(xì)菌10種、真菌2種。（二）難鑒定細(xì)菌一代測(cè)序案例加強(qiáng)生物安全防護(hù)

24烘片機(jī)抗酸染色陽(yáng)性結(jié)果需注意國(guó)內(nèi)部分統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，抗酸染色陽(yáng)性>80為結(jié)核分枝桿菌，需轉(zhuǎn)院到結(jié)核病專(zhuān)科醫(yī)院治療。約5~20

為非結(jié)核分支桿菌，用藥與抗癆治療不同。建議將抗酸染色陽(yáng)性結(jié)果及時(shí)與臨床醫(yī)生溝通，對(duì)該標(biāo)本加做結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR檢測(cè)，及時(shí)區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌。WHO推薦GeneXpert效果最佳多重?zé)晒舛縋CR及熔解曲線(xiàn)法原理?？焖偃詣?dòng)檢測(cè)各類(lèi)標(biāo)本中結(jié)核桿菌、非典型分枝桿菌、利福平耐藥基因。結(jié)核分枝桿菌測(cè)序圖龜分枝桿菌測(cè)序圖諾卡菌屬測(cè)序圖放線(xiàn)菌測(cè)序圖放線(xiàn)菌用藥治療生氮二氧化碳嗜纖維菌測(cè)序圖難鑒定細(xì)菌分子診斷案例血液中分離出生痰二氧化碳嗜纖維菌（Capnocytophaga

sputigena），G-球菌，是人類(lèi)口腔的正常菌群，屬于條件致病菌，常通過(guò)口腔粘膜進(jìn)入血液，感染者大多患有血液系統(tǒng)惡性腫瘤或粒細(xì)胞減少等疾病。該例敗血癥患者男性，診斷為地中海貧血，來(lái)自小兒科層流病房。根癌農(nóng)桿菌測(cè)序圖難鑒定細(xì)菌分子診斷案例血液中分離出根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）

，G-桿菌，普遍存在于土壤，生活在植物根的表面，依靠根組織滲透的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生存，能誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤。該例敗血癥患者20歲，女性，診斷為急性胰腺炎，來(lái)自消化內(nèi)科。有些不同屬種的細(xì)菌可能有著相同的16S

rRNA基因序列，如布魯氏菌和人蒼白桿菌。增加16S-23S

rRNA

基因間隔區(qū)測(cè)序：因變異性大可用于16S

rRNA基因不能鑒別的非常接近的不同屬種或同一屬不同種的鑒定。但有些不同屬種仍然不能區(qū)分。增加病原菌其他特異基因測(cè)序增加病原體其他特異基因測(cè)序：檢索文獻(xiàn)不同病原體選取不同特異基因，如布魯氏菌表面蛋白o(hù)mp31基因擴(kuò)增、測(cè)序及序列分析。無(wú)菌性標(biāo)本可直接擴(kuò)增16S

rRNA基因并測(cè)序。也可直接擴(kuò)增病原體特異基因并測(cè)序。增加病原菌其他特異基因測(cè)序（三）難鑒定真菌一代測(cè)序案例報(bào)警陽(yáng)性血液涂片報(bào)警陽(yáng)性血液涂片報(bào)警陽(yáng)性血液涂片馬爾尼菲青霉菌測(cè)序圖難鑒定真菌分子診斷案例馬爾尼菲青霉菌（Penicillium

marneffe），常感染艾滋病患者，本病多見(jiàn)于東南亞。該例敗血癥患者39歲，男性，艾滋病抗體陽(yáng)性，以肺炎收治于感染科。黑曲霉菌測(cè)序圖難鑒定真菌分子診斷案例黑曲霉菌（Aspergillus

niger），標(biāo)本來(lái)源是患者耳部膿液。該例患者25歲，女性，就診于耳鼻喉門(mén)診，診斷為慢性化膿性中耳炎，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道耳部感染的主要病原真菌是黑曲霉菌。黃曲霉菌測(cè)序圖鐮孢菌測(cè)序圖難鑒定真菌分子診斷案例鐮孢菌（Fusarium），標(biāo)本來(lái)源是眼部分泌物。該例患者48歲，女性，診斷為角膜炎，來(lái)自眼科。我國(guó)鐮孢菌所引起的真菌性角膜炎占真菌性角膜炎體的近40％。二、基因測(cè)序用于臨床疑難病原體鑒定（難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)病原菌，二代測(cè)序）PMseq?病原微生物快速檢測(cè)是華大基因的產(chǎn)品，是國(guó)內(nèi)第一家產(chǎn)品，基于二代高通量測(cè)序平臺(tái)，通過(guò)微生物專(zhuān)用數(shù)據(jù)庫(kù)（近7000種病原體）進(jìn)行比對(duì)分析，經(jīng)過(guò)智能化算法獲得疑似致病微生物的種屬信息，提供全面深入的報(bào)告參數(shù)輔助臨床診療決策。1個(gè)樣品3000元以上。二代測(cè)序流程RNA病毒也可建庫(kù)7000種病原體分析區(qū)分致病菌污染菌樣本收集保存轉(zhuǎn)運(yùn)二代測(cè)序百萬(wàn)序列可檢測(cè)病原種類(lèi)種類(lèi)數(shù)量/種細(xì)菌2328真菌199病毒4189寄生蟲(chóng)135分枝桿菌（結(jié)核和非結(jié)核）83支原體/衣原體41病毒有DNA病毒和RNA病毒之分，如懷疑流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒等RNA病毒，需要注意送檢RNA檢測(cè)流程。華大基因二代測(cè)序可檢測(cè)病原體近7000種可檢測(cè)病原種類(lèi)種類(lèi)數(shù)量/種細(xì)菌5682真菌812病毒7098寄生蟲(chóng)138分枝桿菌（結(jié)核和非結(jié)核）94衣原體85支原體96立克次氏體90迅敏康IngeniGen公司二代測(cè)序可檢測(cè)病原體14000多種二代測(cè)序適用范圍疑難危重感染、長(zhǎng)期發(fā)熱待查、血流感染、腦炎腦膜炎、重癥肺炎、腹瀉等。常規(guī)臨床細(xì)菌真菌檢驗(yàn)無(wú)法明確病原體的疑難病例可考慮二代測(cè)序。二代測(cè)序適用范圍血漿、痰液、肺泡灌洗液、腦脊液、糞便、組織塊等各類(lèi)標(biāo)本，無(wú)菌采集標(biāo)本。盡量避免采集污染，以免分析后得到大量污染病原菌的基因片段。按要求保存標(biāo)本并盡快送檢，盡量減少病原體基因降解。二代測(cè)序優(yōu)勢(shì)（提高陽(yáng)性率）華大基因二代測(cè)序樣本數(shù)據(jù)初步總結(jié)血流感染：從傳統(tǒng)血培養(yǎng)陽(yáng)性率12~15，到高通量測(cè)序陽(yáng)性率30~35。腦炎/腦膜炎：從傳統(tǒng)培養(yǎng)法陽(yáng)性率8~10，到高通量測(cè)序陽(yáng)性率25~30。上述樣本主要來(lái)自疑難感染病例，故存在選樣偏倚，還可能存在假陽(yáng)性，但仍體現(xiàn)了二代測(cè)序的優(yōu)勢(shì)。二代測(cè)序優(yōu)勢(shì)（快速篩查病毒感染）二代測(cè)序案例分析新英格蘭醫(yī)學(xué)期刊14歲聯(lián)合免疫缺陷綜合征男孩8個(gè)月2013年波多黎各旅行回國(guó)后入院，腦膜炎住院，發(fā)展為腦積水和癲癇狀態(tài)38項(xiàng)

感染病原檢測(cè)(6周之內(nèi))5種

抗生素先后聯(lián)用診斷不清、治療無(wú)效、束手無(wú)策二代測(cè)序案例分析48小時(shí)完成腦脊液標(biāo)本二代測(cè)序提示鉤端螺旋體感染475條序列，占比0.016%改用青霉素治療32天男孩痊愈出院二代測(cè)序案例分析共得到序列數(shù)3,063,784二代測(cè)序過(guò)程PCR擴(kuò)增選擇性，可丟失大量病原體片段二代測(cè)序案例分析區(qū)分致病菌與污染菌一代測(cè)序驗(yàn)證及分型二代測(cè)序案例分析D為高濃度青霉素治療一周J電鏡無(wú)病毒E至I病理無(wú)分支桿菌無(wú)真菌ABC為治療前核磁共振結(jié)果二代測(cè)序優(yōu)勢(shì)對(duì)于疑難感染病例，提供快速精準(zhǔn)診斷依據(jù)。無(wú)偏性病原體廣覆蓋（細(xì)菌，真菌，病毒，寄生蟲(chóng)），可以檢測(cè)更多臨床標(biāo)本類(lèi)型，靈敏度高。深入提供病原鑒定分型、耐藥基因和毒力因子分析。以序列為基礎(chǔ)，可快速發(fā)現(xiàn)新發(fā)病原體，并進(jìn)行溯源分類(lèi)。二代測(cè)序存在污染問(wèn)題測(cè)序結(jié)果中常常含有多種病原體的基因片段，可能是標(biāo)本采集、運(yùn)輸中污染，可能是各種試劑中存在污染。如何準(zhǔn)確判斷引起感染的病原體是難題，一般是濾掉皮膚表面常見(jiàn)正常菌群，增加一代測(cè)序重復(fù)驗(yàn)證、血清學(xué)、病理學(xué)、電鏡等檢查。二代測(cè)序存在污染問(wèn)題也有報(bào)道認(rèn)為即使無(wú)菌的腦脊液等標(biāo)本中也許存在正常菌群，尚需進(jìn)一步研究。急需建立二代測(cè)序在病原體中應(yīng)用的專(zhuān)