第2節(jié)微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用非細(xì)胞型：病毒細(xì)胞型細(xì)菌真菌微生物原生生物（一）培養(yǎng)基的配置2.分類：1.定義：按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。一、微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)3.營養(yǎng)組成：水、碳源、氮源、無機(jī)鹽①碳源：為微生物提供所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)。如：CO2、NaHCO3；石油、牛肉膏、蛋白胨、糖類、脂肪酸等②氮源：為微生物提供所需氮元素的營養(yǎng)物質(zhì)。如：N2、NH4NO3；尿素、氨基酸、牛肉膏、蛋白胨等③無機(jī)鹽：除C、H、O、N元素外微生物所需的其他元素如：NaCl、KH2PO4、CaCl2、MgSO4等4.其他條件：pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)、O2的需求如：培養(yǎng)乳酸桿菌，需要添加維生素；培養(yǎng)霉菌，需要酸性環(huán)境；培養(yǎng)細(xì)菌，需要中性或微堿性環(huán)境；培養(yǎng)厭氧微生物，需要無氧條件。（一）培養(yǎng)基的配置制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基2.稱量3.溶化4.滅菌5.倒平板1.計(jì)算溶藥品→煮溶瓊脂→定容→調(diào)pH培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿滅菌冷卻到50℃左右，在酒精燈火焰附近操作根據(jù)培養(yǎng)基配方→計(jì)算配制所需各種成分用量先調(diào)pH。如果滅菌后再調(diào)pH，可能造成污染。強(qiáng)調(diào)1.制備培養(yǎng)基時(shí)，溶化完所有藥品，應(yīng)該先滅菌還是先調(diào)節(jié)pH？2.培養(yǎng)基滅菌后，為什么要冷卻到50℃左右時(shí)才倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？①溫度過高，燙手且易損壞培養(yǎng)皿；溫度過低，培養(yǎng)基開始凝固了。②用手背估計(jì)，以剛剛不燙手為宜。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，將平板倒置，既可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，又可以避免培養(yǎng)基中水分過快的揮發(fā)。1.目的：①防止雜菌污染。②避免操作者自身被微生物感染。（二）無菌技術(shù)2.方法：

消毒：使用較為溫和的物理、化學(xué)或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部的一部分微生物。

滅菌：使用強(qiáng)烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。3.主要包括：①操作空間，操作者的衣服和手進(jìn)行清潔和消毒②微生物培養(yǎng)器皿，接種用具和培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌③應(yīng)該避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品接觸④微生物實(shí)驗(yàn)操作過程應(yīng)該在超凈工作臺(tái)并在酒精燈火焰附近進(jìn)行1.概念：由單一個(gè)體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養(yǎng)物，獲得純培養(yǎng)物的過程就是純培養(yǎng)。（三）微生物的純培養(yǎng)2.步驟：配置培養(yǎng)基、滅菌、接種、分離和培養(yǎng)等。定義：分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基

表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見、

有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體。特征：大小、形狀、隆起程度、顏色、邊緣形態(tài)等。應(yīng)用：可以作為菌種鑒定的重要依據(jù)。菌落單菌落①②③④⑤酵母菌的純培養(yǎng)1.制備培養(yǎng)基2.接種和分離酵母菌3.培養(yǎng)酵母菌配制培養(yǎng)基、滅菌、倒平板接種后的平板和未接種的平板倒置，28℃左右恒溫培養(yǎng)24-48h⑥平板劃線法接種環(huán)溫度過高時(shí)就劃線，可能殺死平板上的酵母菌。逐步稀釋平板上的酵母菌，以期最后能得到單獨(dú)的菌落。實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖且鸩较♂尳湍妇糇詈髣澋木€與第一區(qū)域相連，第一區(qū)域的酵母菌可能轉(zhuǎn)移到最后一區(qū)域，導(dǎo)致稀釋失敗。1.灼燒接種環(huán)后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？2.從第二次劃線開始，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？3.為什么最后一區(qū)域的劃線不能與第一區(qū)域相連？注意①第一步劃線前要灼燒是為避免接種環(huán)可能帶上雜菌，影響對酵母菌的純化。②之后每次劃線前都灼燒，是為保證接種環(huán)無菌，每次的劃線都是對上一次的稀釋。③操作結(jié)束后仍要灼燒，對接種環(huán)進(jìn)行滅菌，以防微生物對環(huán)境的污染。4.為什么在操作的第一步以及每次劃線前都要灼燒接種環(huán)？劃線操作結(jié)束時(shí)，還需要灼燒接種環(huán)么？5.如果最終在平板上劃出五個(gè)區(qū)域，整個(gè)過程需對接種環(huán)進(jìn)行幾次灼燒？6次。注意二、微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)1.概念：在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。（一）選擇培養(yǎng)基2.微生物篩選原理：人為提供有利于目的菌生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度和pH等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物的生長尿素【CO(NH2)2】含氮量高，是重要氮肥。施入土壤后，會(huì)被土壤中的某些細(xì)菌（產(chǎn)生脲酶催化）分解成NH3，NH3再轉(zhuǎn)化為NO3-、NH4+等被植物吸收。9mL無菌水①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中②將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。稀釋涂布平板法的操作過程1mL90mL無菌水1mL1mL1mL1mL1mL（二）微生物的選擇培養(yǎng)稀釋涂布平板法③取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布。⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻。⑦待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，30-37℃恒溫培養(yǎng)1-2天，可觀察到單菌落。稀釋涂布平板法的操作過程微量移液器①稀釋要準(zhǔn)確；②加到培養(yǎng)基表面的菌液應(yīng)嚴(yán)格定量；③涂布要均勻，盡可能讓菌種分散開；④要有重復(fù)實(shí)驗(yàn)：同一稀釋度應(yīng)有至少3組重復(fù)，計(jì)數(shù)時(shí)取其平均值，減少誤差。⑤要有空白對照：留一無操作的培養(yǎng)基，與接種的培養(yǎng)基一同培養(yǎng)。注意稀釋涂布平板法可以較準(zhǔn)確的計(jì)算菌液濃度，為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)保證操作的嚴(yán)謹(jǐn)性：（三）微生物的數(shù)量測定1.方法：

（1）稀釋涂布平板法：

一般選擇菌落數(shù)為30-300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)；同一稀釋度下，至少對3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求平均值。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)比活菌實(shí)際數(shù)目少：因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，

平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。

（2）顯微鏡直接計(jì)數(shù)：