重組疫苗E.coliLLO/WT1誘導(dǎo)人樹突狀細(xì)胞成熟及T細(xì)胞溶瘤作用研究的開題報(bào)告一、研究背景及意義E.coliLLO/WT1重組疫苗是一種結(jié)合了大腸桿菌外毒素（LLO）和WT1抗原的疫苗，可以誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對WT1抗原的免疫反應(yīng)，從而起到抗腫瘤作用。然而，該疫苗的免疫原性和安全性方面還有待進(jìn)一步研究和提高。近年來研究表明，樹突狀細(xì)胞（DCs）作為免疫系統(tǒng)的重要成分，可以促進(jìn)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，進(jìn)一步提高免疫效果。因此，本研究旨在探究E.coliLLO/WT1重組疫苗對DCs的成熟作用及其在適當(dāng)條件下對T細(xì)胞的溶瘤作用，為該疫苗的免疫治療提供理論指導(dǎo)和實(shí)踐基礎(chǔ)。二、研究目的及內(nèi)容研究目的：探究E.coliLLO/WT1重組疫苗對DCs的成熟作用及其在適當(dāng)條件下對T細(xì)胞的溶瘤作用，為該疫苗的免疫治療提供理論指導(dǎo)和實(shí)踐基礎(chǔ)。研究內(nèi)容：（1）構(gòu)建E.coliLLO/WT1重組疫苗；（2）以人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）作為DCs來源，體外培養(yǎng)DCs，并檢測E.coliLLO/WT1重組疫苗對其成熟的影響；（3）采用浮游細(xì)胞分離技術(shù)，分離出PBMCs中的T細(xì)胞，并培養(yǎng)至菌落形成期后，添加E.coliLLO/WT1重組疫苗，檢測疫苗對T細(xì)胞的溶瘤作用；（4）分析E.coliLLO/WT1重組疫苗對DCs成熟及T細(xì)胞溶瘤作用的影響機(jī)制。三、研究方法和技術(shù)路線（1）構(gòu)建E.coliLLO/WT1重組疫苗：通過PCR擴(kuò)增LLO和WT1基因，將兩者連接并插入大腸桿菌載體中，經(jīng)過菌落PCR、酶切、測序、蛋白表達(dá)等步驟獲得E.coliLLO/WT1重組疫苗。（2）DCs培養(yǎng)及成熟：以人PBMCs為材料，通過負(fù)附著法分離PBMCs中的單個(gè)核細(xì)胞，即DCs，將其體外培養(yǎng)并添加E.coliLLO/WT1重組疫苗，分別于12h、24h、48h后檢測DCs成熟的標(biāo)志分子（CD80、CD86、CD40、MHCII）的表達(dá)情況。（3）T細(xì)胞培養(yǎng)及溶瘤實(shí)驗(yàn)：采用浮游細(xì)胞分離技術(shù)從PBMCs中分離T細(xì)胞，將其在96孔板內(nèi)培養(yǎng)，待其菌落形成后，添加E.coliLLO/WT1重組疫苗，測定溶瘤率。（4）分析E.coliLLO/WT1重組疫苗對DCs成熟及T細(xì)胞溶瘤作用的影響機(jī)制：利用相關(guān)熒光染料及ELISA法等手段，分析DCs成熟及T細(xì)胞溶瘤作用的影響機(jī)制。四、研究預(yù)期結(jié)果及意義預(yù)期結(jié)果：（1）成功構(gòu)建E.coliLLO/WT1重組疫苗；（2）發(fā)現(xiàn)E.coliLLO/WT1重組疫苗能夠促進(jìn)DCs成熟，從而增強(qiáng)其對WT1所派生抗原表達(dá)的細(xì)胞的識別和清除能力；（3）發(fā)現(xiàn)E.coliLLO/WT1重組疫苗能夠在適當(dāng)條件下誘導(dǎo)T細(xì)胞溶瘤作用；（4）揭示了E.coliLLO/WT1重組疫苗對DCs成熟及T細(xì)胞溶瘤作用的影響機(jī)制。意義：本研究能夠?yàn)樯钊肜斫釫.coliLLO/WT1重組疫苗在免疫治療中的作