中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增(LAMP)檢測方法第4部分：單核細(xì)胞增生李斯特菌Loop-mediatedisothermalamplificationdetectionmethodforpathogens2011-02-25發(fā)布國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局ISN/T2754《出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增(LAMP)檢測方法》分為15個部分：—第1部分：金黃色葡萄球菌；——第2部分：大腸桿菌O157;——第3部分：志賀氏菌；——第4部分：單核細(xì)胞增生李斯特菌；——第5部分：副溶血性弧菌；——第6部分：小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌；——第7部分：空腸彎曲菌；——第8部分：肺炎克雷伯氏菌；——第10部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌；—第11部分：產(chǎn)霍亂毒素的霍亂弧菌；第15部分：阪崎腸桿菌。本部分為SN/T2754的第4部分。本部分按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本部分由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本部分起草單位：中華人民共和國福建出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國廣東出入境檢驗檢疫1出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增(LAMP)檢測方法第4部分：單核細(xì)胞增生李斯特菌SN/T2754的本部分規(guī)定了檢測出口食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴增本部分適用于出口食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的篩選檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB4789.30—2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測5縮略語Betaine:甜菜堿Bst酶[BstDNApolymerase(largefragment)]:BstDNA聚合酶(大片段)DNA(deoxyribonucleicacid):脫氧核糖核酸dNTP(deoxyribonucleosidetriphosphate):脫氧核苷三磷酸EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid):乙二胺四乙酸LAMP(loop-mediatedisothermalamplification):環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚virR:單核細(xì)胞增生李斯特氏菌致病因子編碼基因2根據(jù)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌特有的靶序列virR基因(參見附錄A)設(shè)計的兩對特殊的內(nèi)、外引補鏈合成，在同一鏈上互補序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物；從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物(焦磷酸鎂)形成乳白色沉淀，加入顯色外引物2和內(nèi)引物1,內(nèi)引物2。外引物2(B3,5’-3’):ACAAGACTTCACCAATCCA內(nèi)引物1(FIP,5'-3’):CCTGTGCCAAAGCATTTTTACATTTTTTAGGCAAGTCATCTTGTTCG內(nèi)引物2(BIP,5'-3’):TAAGTCTCTTTGCAATTGACCGACTTTTACGTGTACACAGAAAAGCG7.3dNTPs:每種核苷酸濃度10mmol/L。7.4甜菜堿：濃度5mol/L。7.5硫酸鎂(MgSO?):濃度150mmol/L。7.6BstDNA聚合酶：酶濃度8U/μL。7.101.5mL塑料離心管。7.11單核細(xì)胞增生李斯特氏菌LAMP檢測試劑盒”,可選，參照試劑盒說明書操作。試劑盒組成及使用注意事項參見附錄B。8.2高速臺式離心機：≥7000g。8.3水浴鍋或加熱模塊：65℃±1℃和100℃±1℃。39檢測程序食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌LAMP檢測程序見圖1。待測樣品陰性陽性傳統(tǒng)方法確認(rèn)報告圖1食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌LAMP檢測程序按照GB4789.30—2010中5.1進行樣品制備和增菌。10.2.1增菌液模板DNA的制備對于10.1獲得的增菌液，采用如下方法制備模板DNA:a)直接取該增菌液1mL加到1.5mL無菌離心管中，7000g離心2min,盡量吸棄上清液；b)加入80μLDNA提取液，混勻后沸水浴10min,置冰上10min;c)7000g離心2min,上清液即為模板DNA;取上清液置-20℃可保存6個月備用。4對于10.1分離到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，再按照10.2.1b)步驟制備模板DNA以待單核細(xì)胞增生李斯特氏菌LAMP反應(yīng)體系見表1。表1單核細(xì)胞增生李斯特氏菌LAMP反應(yīng)體系工作液濃度加樣量反應(yīng)體系終濃度ThermoPol緩沖液外引物1(F3)外引物2(B3)內(nèi)引物1(FIP)內(nèi)引物2(BIP)10mmol/I.4甜菜堿40.8mol/L硫酸鎂8mmol/LBstDNA聚合酶0.16U/μL去離子水10.3.2.1按表1所述配制反應(yīng)體系?？瞻讓φ找运娲鶧NA模板。陰性對照以DNA提取液代替模板DNA。也可使用單核細(xì)胞增生李斯特氏菌LAMP檢測試劑盒陽性對照制備：將單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于營養(yǎng)肉湯中30℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,用無菌生理鹽水稀釋至約10?CFU/mL～10°CFU/mL(約麥?zhǔn)蠞岫?.4),按10.2.1提取模板DNA作為LAMP反應(yīng)的模板。也可使用單核細(xì)胞增生李斯特氏菌LAMP檢測試劑盒中的陽性對照。在上述反應(yīng)管中加入2μL顯色液，輕輕混勻并在黑色背景下觀察。5增菌液或可疑純菌落進一步按GB4789.30—2010中第一法操作步驟進行確認(rèn)后報告結(jié)果；b)待檢樣品反應(yīng)管液體呈橙色則可報告單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗結(jié)果為陰性。1tttttcttgaaccaagaagctacaagacttcaccaatccatacgtgtacacagaaaagcg61ctgattgcttttttactttatcatgcaagtgcgaacgtcggtcaattgcaaagagactta121aaactagcctgtgccaaagcatttttacattataaaaccaaaacggctaattatatatta241ccagaaaaattaaatA.2組成引物中堿基構(gòu)成virR-F3(5'-3’):GTCTTTTAAGTGGAGTAAACCTTvirR-B3(5’-3’):ACAAGACTTCACCAATCCAF1CF2virR-FIP(5'-3’):CCTGTGCCAAAGCATTTTTACATTTTTTAGGCAAGTCATCTTGTTCGB1CB2vir