ABI7500熒光定量PCR儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程第第頁共10頁1.目的為規(guī)范使用人正確和正常的使用ABI7500型核酸擴(kuò)增熒光定量檢測儀，保證擴(kuò)增及結(jié)果分析的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，特制定本規(guī)程。2.適用范圍適用于本公司ABI7500熒光定量PCR儀的操作。3.職責(zé)3.1使用人員負(fù)責(zé)本規(guī)程的實(shí)施。3.2設(shè)備使用人負(fù)責(zé)設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)工作；設(shè)備責(zé)任人負(fù)責(zé)設(shè)備的定期維護(hù)保養(yǎng)工作。3.3質(zhì)量監(jiān)督員負(fù)責(zé)監(jiān)督本規(guī)程的實(shí)施。內(nèi)容4.1程序設(shè)置4.1.1打開電腦及儀器電源，待儀器電源項(xiàng)顯示power綠色狀態(tài)。4.1.2雙擊電腦桌面上的7500softwareV2.3圖標(biāo)打開程序，打開程序單擊OK，待軟件連接儀器并測試校準(zhǔn)狀態(tài)后（若有出現(xiàn)連接失敗可嘗試重啟電腦，檢查USB線接口），出現(xiàn)如下界面，單擊DesignWizard選項(xiàng)，紅色箭頭指示位置有個(gè)下拉菜單，如下圖所示。下拉菜單中有一個(gè)AdvancedSetup（高級設(shè)置）選項(xiàng)，如箭頭所示：點(diǎn)擊這個(gè)選項(xiàng)，可以進(jìn)入下面這個(gè)界面，③②①③②①如上圖所示，紅色箭頭從上到下指示的分別是①實(shí)驗(yàn)名稱、②儀器型號和③反應(yīng)程序類型。（帶*號的必需填）③②①③②①此圖是上面圖的延續(xù)（自己電腦顯示不完全），紅色箭頭從上到下指示的分別是①PlateSetup選項(xiàng)、②探針類型和③程序應(yīng)用速度類型，一般使用的探針就是TaqMan探針，速度類型選擇默認(rèn)就可以了（如果是7500fast的話則有快速模式可以選擇）。下一步我們可以看到左上角的紅色箭頭指示的一個(gè)PlateSetup選項(xiàng)，點(diǎn)擊這個(gè)選項(xiàng)，就可以進(jìn)入下一個(gè)設(shè)置界面。⑩①⑨⑧①⑧⑥①⑥⑤①⑦⑨①⑤④①④⑦①③①②①①⑩①⑨⑧①⑧⑥①⑥⑤①⑦⑨①⑤④①④⑦①③①②①①紅色箭頭①和②指的是設(shè)定反應(yīng)探針和反應(yīng)樣品名稱，箭頭③處可以填寫反應(yīng)探針名稱（如P1,HBV,HCV）。箭頭⑤是選擇報(bào)告熒光，一般使用的發(fā)光基團(tuán)是FAM，箭頭⑥是選擇粹滅熒光，達(dá)安現(xiàn)在使用的是TAMRA熒光，科華現(xiàn)在使用的是BHQ，在這個(gè)儀器中無此選擇項(xiàng)，那么就選擇none。箭頭⑧處可以填寫樣品名稱。點(diǎn)擊箭頭④和箭頭⑨處可以添加反應(yīng)探針體系名稱和樣品名稱。箭頭⑦和箭頭⑩是選擇對應(yīng)探針體系和對應(yīng)樣品的曲線顏色，可選擇也可以不選。（另：探針跟樣品設(shè)定后可保存，方便以后實(shí)驗(yàn)調(diào)用，具體是點(diǎn)擊箭頭①②下面的SavedTaeget，下次調(diào)用則點(diǎn)擊AddSaved就可調(diào)出。）為了方便講解，我假定有1個(gè)反應(yīng)探針DAAN和1個(gè)樣本HBV1，如上圖所示。設(shè)定完成之后，我們點(diǎn)擊紅色箭頭所指的選項(xiàng)，進(jìn)入下個(gè)界面。在上圖，我們可以看到一個(gè)類似反應(yīng)板的界面，黑色箭頭①指示的有玫瑰紅色下劃線那一排在選定反應(yīng)孔后會(huì)顯示出樣本孔總數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)品總數(shù)和陰性對照總數(shù)。從黑色箭頭②可以看出暫時(shí)還有48個(gè)反應(yīng)孔空余。藍(lán)色箭頭①和②分別是放大這個(gè)孔板界面的按鈕，藍(lán)色箭頭③是顯示大小還原默認(rèn)設(shè)置按鈕。開始設(shè)置時(shí)，首先我們?nèi)缂t色箭頭①所示選定A1孔，紅色箭頭②指示的是反應(yīng)探針名稱，紅色箭頭③指示的樣品類型，選定反應(yīng)體系后可以在U——未知樣本，S——標(biāo)準(zhǔn)樣本，N——陰性樣本中選擇一個(gè)。紅色箭頭⑤是個(gè)下拉菜單可以選擇反應(yīng)探針，在紅色箭頭④指示的框里單擊鼠標(biāo)，顯示打鉤就說明選定了反應(yīng)體系。紅色箭頭⑥指示的是樣品名稱，紅色箭頭⑧是個(gè)下拉菜單可以選擇樣品名稱。在紅色箭頭⑦指示的框里單擊鼠標(biāo)，顯示打鉤就說明選定了樣品名稱。紅色箭頭⑨指示的參比熒光，儀器默認(rèn)是ROX，但是產(chǎn)品一般沒有添加ROX熒光，所以必須選擇None。紅色箭頭⑩指示的定量標(biāo)準(zhǔn)品的設(shè)置，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的值從4567升序或是從7654降序的排列，單擊可彈出以下界面，具體如下。⑤④①④①③①②①①⑤④①④①③①②①①上圖中，紅色箭頭①表示標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量，②表示標(biāo)準(zhǔn)品是否走重復(fù)孔，③表示起始的濃度，④表示10×的話則為升序，按照4567的濃度；1:10的話則為降序，按照7654的濃度。例如：做了4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品做1個(gè)（即沒有做復(fù)孔），起始濃度為10000，選擇10×，選擇箭頭⑤的自己選擇孔位，點(diǎn)擊左下角的Apply，則在第10排按照4567次方的順序排列。此外也可以選擇鼠標(biāo)雙擊類似反應(yīng)孔板的那個(gè)界面，會(huì)出現(xiàn)下面這個(gè)界面：⑤①④①③①①②①⑤①④①③①①②①如上圖所示，選定反應(yīng)孔雙擊后會(huì)出現(xiàn)這樣一個(gè)界面，紅色箭頭①指示的Task—樣品反應(yīng)類型，紅色箭頭②是指示的是Target—反應(yīng)探針，紅色箭頭③指示的是Sample—樣品名稱。這三個(gè)都是下拉菜單，可以選擇前面設(shè)置好的反應(yīng)體系和樣品名稱。紅色箭頭④是個(gè)文本框，可以備注樣本的詳細(xì)信息。按照樣本放置的實(shí)際情況設(shè)置好之后，可以點(diǎn)擊紅色箭頭⑤指示的RunMethod選項(xiàng)進(jìn)入下個(gè)界面。⑦①③①⑥③①⑤③①②③①④③①⑦①③①⑥③①⑤③①②③①④③①①③①③①上圖的箭頭①是設(shè)定反應(yīng)體系體積的，箭頭②是添加反應(yīng)程序階段的，箭頭③是添加反應(yīng)程序步驟的，箭頭⑤和⑥是制訂收集熒光信號的標(biāo)志，例如箭頭⑥所示高亮顯示時(shí)表示在此步驟收集熒光信號。（切記，收集熒光只能1個(gè)地方，若是出現(xiàn)2個(gè)收集熒光信號的，則軟件上會(huì)有出現(xiàn)藍(lán)色的錯(cuò)誤提示）設(shè)定好循環(huán)條件，就可以進(jìn)行模板保存，以便下次實(shí)驗(yàn)時(shí)調(diào)用程序，點(diǎn)擊位于軟件中間最右方的鍵（注：這個(gè)鍵是由于本人電腦不是寬屏的（14寸acer。。。），如果是AB配的E6500電腦則可以在軟件上全部顯示，不會(huì)出現(xiàn)鍵或是那些滑動(dòng)條，但是。。字體會(huì)小點(diǎn)，，），選擇保存運(yùn)行的模板，命名。下次實(shí)驗(yàn)使用的時(shí)候就不用再在設(shè)條件，直接點(diǎn)擊openrunmethod，調(diào)出你所需要做的實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增條件。還有上圖左方的reactionsetup（反應(yīng)體系設(shè)置）和materialslist（耗材清單）不需要我們?nèi)ピO(shè)置。點(diǎn)擊箭頭⑦所指的run進(jìn)入運(yùn)行界面。⑤④⑦①③①④⑦①③①③⑦①③①②㈡⑤④⑦①③①④⑦①③①③⑦①③①②㈡②⑦①③①①⑦①③①直接點(diǎn)擊上圖中的綠色START按鈕，根據(jù)提示保存實(shí)驗(yàn)文件后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)開始后在綠色START按鈕右方可出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)的預(yù)計(jì)剩余時(shí)間。箭頭②表示的是實(shí)時(shí)的曲線圖譜，③表示的是實(shí)時(shí)的溫度曲線圖譜，④表示的是實(shí)驗(yàn)的條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按箭頭⑤所指的分析，出現(xiàn)以下界面。⑧①⑤④⑦①③①⑦⑤④⑦①③①⑥⑦⑤④⑦①③①②⑤④⑦①③①③⑤④⑦①③①⑤④⑦①③①⑧①⑤④⑦①③①⑦⑤④⑦①③①⑥⑦⑤④⑦①③①②⑤④⑦①③①③⑤④⑦①③①⑤④⑦①③①④⑤④⑦①③①①⑤④⑦①③①做完實(shí)驗(yàn)后，曲線會(huì)出現(xiàn)在上圖，以對數(shù)圖譜的形式出現(xiàn)，若想換為線性圖譜，可點(diǎn)擊箭頭①所指示的去選擇log或linear，其次，再點(diǎn)擊箭頭⑧的分析按鈕（有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的話會(huì)出現(xiàn)的是analysis），樣本的結(jié)果跟CT會(huì)在右邊的96孔面板中出現(xiàn)，上面的顯示不完全，曲線的基線baseline跟閾值threshold設(shè)置是在上圖數(shù)字⑦下面的那個(gè)地方（不是箭頭⑦所指的地方），進(jìn)行設(shè)置。箭頭③表示的是實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)。箭頭④⑤表示的是每個(gè)孔的原始光譜圖。箭頭⑥表示的是一些附加的報(bào)警信息，例如重復(fù)孔偏差了，熒光偏差了，質(zhì)控失控了。箭頭⑦表示的是上面4中圖譜的集合，可自己選擇組合查看。4.1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)束后填寫《設(shè)備使用記錄》4.2結(jié)果分析4.2.1在analysissetup里面修改各個(gè)探針的baseline與threshold數(shù)值，點(diǎn)擊綠色analyze圖標(biāo)，軟件及完成自動(dòng)分析。4.2.2在amplificationplot界面查看所有樣品的擴(kuò)增曲線。4.2.3整體曲線的觀察,將所有曲線選中進(jìn)行整體觀察。4.2.3.1觀察是否存在污染情況（包括標(biāo)本污染和試劑污染），特別應(yīng)注意大量曲線在同一Ct值出現(xiàn)上漲的情況。4.2.3.2觀察是否有光路傳導(dǎo)阻滯或電壓波動(dòng)等機(jī)器原因形成的異常曲線。4.2.4對照、質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品的分析4.2.4.1陰性對照：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知陰性標(biāo)本。作用：用以監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室和前處理過程中是否存在污染。4.2.4.2陽性對照：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知陽性標(biāo)本。作用：用以監(jiān)測實(shí)驗(yàn)?zāi)芊裾z出陽性標(biāo)本，避免假陰性的出現(xiàn)。4.2.4.3陽性室內(nèi)質(zhì)控品的分析：陽性室內(nèi)質(zhì)控品：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知或未知濃度的陽性室內(nèi)質(zhì)控血清。作用：用以監(jiān)控日常實(shí)驗(yàn)的精密度。4.2.4.4陽性標(biāo)準(zhǔn)品的分析：各梯度曲線的分布是否均勻，若各梯度曲線均未分開，則表明陽性標(biāo)準(zhǔn)品稀釋可能存在問題，提示實(shí)驗(yàn)中存在較大人為誤差。4.2.4.5觀察各曲線的Ct值是否在平日的正常位置：若出現(xiàn)低拷貝標(biāo)準(zhǔn)品做不出，而各曲線Ct值均后移，則判斷是否為試劑擴(kuò)增效率下降（如試劑過期或保存條件不合格）。出現(xiàn)低拷貝標(biāo)準(zhǔn)品做不出，而高拷貝曲線Ct值均正常，則提示可能存在低拷貝陽性標(biāo)準(zhǔn)品的降解情況。若高拷貝標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)Ct值后移，且能排除上述情況，則判斷是否為試劑靈敏度下降。得出定量結(jié)果：調(diào)節(jié)基線和閾值以得到一較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。電腦據(jù)此曲線給出實(shí)驗(yàn)結(jié)果值。4.3儀器維護(hù)4.3.1注意開機(jī)關(guān)機(jī)順序，機(jī)器開機(jī)后即可使用，無需預(yù)熱。4.3.2電腦上使用專用U盤等移動(dòng)存儲(chǔ)設(shè)備，建議使用光盤刻錄來轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)。4.3.3針對電腦硬盤，進(jìn)行周期性碎片整理，并將試驗(yàn)數(shù)據(jù)備份到其他存儲(chǔ)設(shè)備上（比如光盤）4.3.4儀器表面與電腦表面應(yīng)每月用軟布擦拭（無需用水，禁用有機(jī)溶劑，會(huì)溶解機(jī)器表面的漆層）。4.3.5燈泡更換：在燈泡使用達(dá)到壽命后（2000小時(shí)），或者意外損壞后需要更換。機(jī)器關(guān)閉電腦30分鐘后，打開前面上半冊面板，取出舊燈泡，在操作過程中需要戴無塵手套操作，注意燈泡高溫。然后將新燈泡，用氣吹吹掉表面的灰塵，安裝燈泡。4.3.6樣品孔清潔：樣品孔污染后會(huì)影響PCR擴(kuò)增的信號，是的該孔信號高于其他孔，造成假陽性的結(jié)果，需要每月執(zhí)行background校正，針對信號值超過72000的孔，使用棉簽與去離子水進(jìn)行清潔。清潔時(shí)關(guān)閉機(jī)器電源，打開前面上半面板，將熱蓋板（黑色面板）推到后面，清潔相應(yīng)的孔，然后恢復(fù)原狀，重新執(zhí)行background校正，直到所有