一、工作簡況根據(jù)《國家標準化管理委員會關(guān)于下達2021年橙皮苷二氫查耳酮的測定高效液相色譜法》，項目承擔單位為山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心和山東奔月生物科技股份有限公司。本標準），在我國，2011年新甲基橙皮苷二氫查耳酮作為一種食品用香料（合新甲基橙皮苷二氫查耳酮屬于黃酮類衍生物（維生素P類通圖1化學(xué)結(jié)構(gòu)式通常以新甲基橙皮苷為原料生產(chǎn)新甲基橙皮苷二氫查爾酮，首先在堿性條件下新甲基橙皮苷經(jīng)開環(huán)得到新甲基橙皮苷查爾酮，再把鈀碳催化氫化合成新甲基橙皮苷二氫查爾酮。由于新橙皮苷在天然植物中含量較低價格較高，因此通常將柚皮苷、橙皮苷轉(zhuǎn)化為新橙皮苷再用于新甲基橙皮苷二氫查爾酮的制備。新甲基橙皮苷二氫查爾酮作為甜味劑，多應(yīng)用于飼料及食品行業(yè)。新橙皮苷二氫查爾酮作為甜味劑加入到飼料中，可使飼料口味超甜，能增大崽豬食欲，明顯促進其生長和降低每千克增新橙皮苷二氫查爾酮與別的甜味劑復(fù)配使用時，尤其是與糖精復(fù)配時，能產(chǎn)生優(yōu)良的協(xié)同作用，大大改善飼料的風(fēng)味和適口性，掩蓋和改善了日糧中某些成分帶有的不良苦澀味，從而增進幼畜的食欲，促進生長。但是另一方面，新甲基橙皮苷二氫查耳酮長期大量使用，也會產(chǎn)生一定危害。歐盟規(guī)定新甲基橙皮苷二氫查耳酮作為一種食品成分，用作各種食品中的代糖產(chǎn)品，每日最大允許攝入量(ADI)為5mg/kg。我國農(nóng)業(yè)部第2625號公告《飼料添加劑安全使用規(guī)范》中明確規(guī)定其適用范圍為豬，且在豬配合飼料中的最高限量不得超過新甲基橙皮苷二氫查爾酮的檢測方法眾多，不同樣品中的檢測方和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，除此之外還有毛細管區(qū)帶電泳法、電表1國內(nèi)外新甲基橙皮苷二氫查耳酮測定標準方法一覽表序號標準編號標準名稱檢測方法1EUROPEANPHARMACOPOEIA9.0NeohesperidinDihydrochalcone高效液相色譜法2GB29938-2020食品安全國家標準食品用香料通則食品用合成香料，檢測方法按GB/T11539或GB/T11538的規(guī)定。上述方法不適用的，按GB/T27579的規(guī)定3GB/T11538-2006精油毛細管柱氣相色譜分析通用法氣相色譜法4GB/T11539-2008精油填充柱氣相色譜分析通用法氣相色譜法5GB/T27579-2011精油高效液相色譜分析通用法高效液相色譜法6T/CAFFCI38—2020新甲基橙皮苷二氫查耳酮高效液相色譜法質(zhì)，新甲基橙皮苷二氫查耳酮是一種固態(tài)粉末香料，但由于沸點在600℃以上，鑒于氣相色譜方法的原理，采用該方法確實無法準確測2022年1月，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心、山東奔月生物科技2022年初，標準編制小組查閱了國內(nèi)外有關(guān)標準文獻資料，同 二、標準編制原則和主要技術(shù)內(nèi)容確定的依據(jù)-2015《標準編制規(guī)則第4部分：試驗方法標準》的規(guī)定和要求編本標準適用于配合飼料、濃縮飼料、添加劑預(yù)混合飼料和精料補用甲醇提取飼料中新甲基橙皮苷二氫查耳酮，提取液經(jīng)EMR小柱與PSA固相萃取小柱凈化后，高效液相色譜儀紫外檢測器測定，試驗參照GB/T27404-2008的要求，對新甲基橙皮苷二氫查爾酮酮備液稀釋成的20μg/mL備液稀釋成的20μg/mL3.2.1紫外檢測波長的確定將兩種標準物質(zhì)配制成濃度為10mg/L的標準溶液，使用二極管陣列檢測器在190-800nm范圍內(nèi)采集三維光譜圖，比較明顯的兩個吸收峰為200nm和282nm左右。因為低波長區(qū)域干擾較大，排除低波長區(qū)域后，新甲基橙皮苷二氫查爾酮最大紫外吸收為282nm,柚皮苷二氫查爾酮最大紫外吸收為281nm,因此將兩種物質(zhì)的紫外檢測波長確定為281nm。圖3新甲基橙皮苷二氫查爾酮的紫外吸收光譜圖圖4柚皮苷二氫查爾酮的紫外吸收光譜圖實驗發(fā)現(xiàn)，使用普通的Cig色譜柱分析此兩種化合物，就可以獲得滿意的保留度與分離度，因此本方法使用Clg色譜柱作為固定相。根據(jù)反相色譜液相常用的流動相和標準物質(zhì)本身的性質(zhì)，考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%乙酸、甲醇-0.2%磷酸四種流動相，發(fā)現(xiàn)四種流動相對物質(zhì)的響應(yīng)與分離度沒有絕對的差異，從經(jīng)濟環(huán)保的角梯度洗脫與等度洗脫相比，可以使目標物獲得更好的分離度并有效減少分析時間，因此本方法采用了梯度洗脫。具體色譜條件如下：a)色譜柱：Cig色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),或相當者；d)柱溫：40℃;f)紫外檢測波長：281nm。表4梯度洗脫程序表時間(min)55在上述確定的液相色譜條件下，兩種標準溶液的色譜參見圖5。圖5新甲基橙皮苷二氫查爾酮與柚皮苷二氫查爾3.3樣品前處理方法的確定按GB/T20195制備試樣。取樣品至少200g，粉碎使其全部通劑各20mL分別超聲提取10min，提取液直接過膜往殘渣中加入20mL甲醇，振蕩提取20min，離心取酮丙酮復(fù)溶過PSA凈化。對于PSA柱，50%甲醇丙酮上柱目標物不會在3.4.1方法檢出限與定量限方法的定量限是指在保證具有一定可靠性(準確度和精密度)的前提下，分析方法能準確測定出的樣品中藥物的最低濃度，通常方法選取配合飼料、精料補充料、濃縮飼料、預(yù)混料四種空白飼料樣品，添加標準溶液0.5mg/kg,按建立的方法處理樣品，經(jīng)液相色譜儀測得信噪比均大于3;添加標準溶液1.0mg/kg,按建立的方法處理樣品，經(jīng)液相色譜儀測得信噪比均大于10。最終確定本方法的檢出限為0.5mg/kg,定量限為1.0mg/kg。配合料空白樣品、配合料定量限濃度添加樣品(1.0mg/kg)的色譜圖分別見圖6和圖7。圖6配合料空白樣品色譜圖圖7配合料定量限濃度添加樣品(1.0mg/kg)色譜圖3.4.2方法的線性范圍配制混合標準工作曲線溶液，使兩種物質(zhì)的濃度均為0.2mg/L,色譜峰面積為縱坐標，標準溶液的濃度為橫坐標繪制標準曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。兩種化合物在0.2mg/L～20.0mg/L的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。標準曲線方程和線性相關(guān)系見表7,標準曲線見圖8和圖9。目標物相關(guān)系數(shù)R2柚皮苷二氫查爾酮新甲基橙皮苷二氫查爾酮圖8柚皮苷二氫查爾酮標準曲線圖9新甲基橙皮苷二氫查爾酮標準曲線和溶劑中標準物質(zhì)的峰面積（B）的比值考察基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)本實驗考察了相同濃度下不同飼料基質(zhì)對新甲基橙皮苷二氫查表8新甲基橙皮苷二氫查爾酮項目回收率及精密度試驗結(jié)果基質(zhì)添加μg/kg批次批內(nèi)數(shù)據(jù)批間數(shù)據(jù)平均率RSD平均率RSD123456789%%n=30，%中豬配合飼料1182.594.983.688.193.896.193.883.694.990.490.25.9089.35.6290.484.888.184.887.089.384.897.289.385.988.14.32383.688.196.183.684.897.298.392.784.885.989.56.652188.192.788.189.398.394.987.091.598.384.891.35.1590.05.0283.690.488.188.185.988.191.596.199.485.989.75.42385.993.894.991.583.684.889.392.785.988.189.04.51182.591.589.394.994.992.784.894.996.189.391.15.0790.85.3294.994.999.491.590.490.488.185.988.199.492.35.10394.996.184.887.089.387.083.694.990.482.589.05.5430190.482.584.891.594.994.987.088.188.198.390.15.4990.64.7293.889.392.792.794.983.699.485.985.988.190.65.41391.593.889.398.388.190.491.592.789.387.091.23.56小豬復(fù)合預(yù)混料1192.791.590.483.683.691.593.894.989.399.491.15.3090.95.6284.898.393.883.690.490.489.393.887.099.491.15.83384.885.993.891.587.085.999.499.491.584.890.46.322189.397.290.489.390.482.599.485.999.499.492.36.6691.45.4289.391.588.189.399.483.691.597.289.394.991.45.09387.085.989.391.591.598.391.585.988.194.990.44.45196.193.884.892.784.890.497.298.394.984.891.85.8091.4290.491.587.094.992.788.199.499.488.185.991.85.31394.989.390.492.787.085.992.797.292.784.890.74.4330188.196.192.797.296.188.196.192.798.384.893.04.9390.85.6282.591.597.294.987.096.192.788.187.096.191.35.40398.392.783.685.983.684.885.991.590.484.888.15.54乳豬濃縮料1199.484.891.583.684.885.992.785.987.099.489.56.7091.36.0297.287.096.198.393.882.599.491.583.685.991.56.94396.199.492.788.194.993.891.589.388.193.892.83.912196.192.797.283.696.196.184.892.791.583.691.45.9690.5283.696.184.887.090.482.582.593.896.182.587.96.46399.493.883.692.791.596.189.398.390.485.992.15.53196.188.191.590.496.190.488.194.985.996.191.891.94.2284.884.893.894.988.191.591.590.489.398.390.74.73396.190.497.296.191.590.494.990.487.097.293.13.8530197.297.293.891.599.492.788.193.883.691.592.94.9991.35.6282.585.992.783.699.488.191.585.989.398.389.76.45390.488.193.890.483.698.391.599.490.488.191.45.19肉牛精料補充料1182.597.285.983.683.690.485.982.591.594.987.86.1088.65.2292.787.089.398.390.497.289.383.684.889.390.25.31382.584.885.993.893.885.990.487.087.087.087.84.252183.689.391.582.599.498.396.197.292.793.892.46.3390.36.0285.989.383.689.396.188.190.494.984.890.489.34.51397.288.185.985.982.583.683.692.794.998.389.36.70194.993.883.684.893.898.399.482.594.990.491.66.6490.66.3299.487.098.399.490.483.693.894.982.591.592.16.78382.588.188.183.688.198.387.087.091.585.988.05.0130198.383.685.983.693.888.187.084.884.883.687.35.6689.66.3283.689.389.392.799.497.289.398.390.482.591.26.35398.388.182.588.193.888.187.099.494.983.690.46.51三、試驗驗證的分析、綜述報告，技術(shù)經(jīng)濟論證，預(yù)期的經(jīng)濟效2024年1月，標準編制小組委托xx三家單位完成本標準的復(fù)核驗證精密度符合標準要求，能滿足配合飼料、濃縮飼料、精料補充料、添加劑四、與國際、國外同類標準技術(shù)內(nèi)容的對比情況，或者與測試的國外樣品、樣機的有關(guān)數(shù)據(jù)對比情況表9與國外同類標準技術(shù)內(nèi)容對比No.標