血袋保養(yǎng)液細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)方法的建立鐘熾輝細(xì)菌內(nèi)毒素的根本知識(shí)1.細(xì)菌內(nèi)毒素細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖和微量蛋白的復(fù)合物，它的特殊性不是細(xì)菌或細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，而是細(xì)菌死亡或解體后才釋放出來(lái)的一種具有內(nèi)毒素生物活性的物質(zhì)。其化學(xué)成分廣泛分布于革蘭氏陰性菌及其它微生物的細(xì)胞壁層的脂多糖，主要是由O-特異性鏈、核心多糖、類脂A三局部組成。內(nèi)毒素能引起熱原反響。2.細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品〔RSE〕：批號(hào)：981效價(jià)：9000EU細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品〔CSE〕：以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定效價(jià)3.細(xì)菌內(nèi)毒素在水溶液中的狀態(tài)

細(xì)菌內(nèi)毒素很容易吸附在容器壁上或聚集在一起，2005版中國(guó)藥典明確注明：細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液要混旋15min并且每稀釋一步要混旋30s，以充分混勻。4.鱟試劑從海洋生物鱟的血液提取的生物試劑，只有鱟血與內(nèi)毒素有特異性的凝膠反響，該試劑到達(dá)了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化，全世界均采用該試劑檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素，尚不能采用生物合成的方法制造。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，臨界時(shí)間t0.02與內(nèi)毒素濃度C之間也是負(fù)相關(guān)。通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可得C-t0.02關(guān)系曲線，對(duì)該曲線采用最小二乘法擬合，可以求解出a0、b0的值。在對(duì)實(shí)驗(yàn)品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)品的臨界反響時(shí)間t0.02和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程即可求出實(shí)驗(yàn)品的內(nèi)毒素濃度。

6.2反響速率測(cè)定法大量實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，內(nèi)毒素濃度越高成膠時(shí)間就越快，即反響速度越快，將動(dòng)力學(xué)反響曲線變換成微積分曲線，即反響速率曲線，其反響速率最大的點(diǎn)即是反響曲線的拐點(diǎn)，該點(diǎn)的時(shí)間作為反響時(shí)間就是濁度反響時(shí)間法中的t50，最大的反響速率也與內(nèi)毒素含量相關(guān)，通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可得C-Vmax關(guān)系曲線，對(duì)該曲線采用最小二乘法擬合，可以解出a0、b0的值。在對(duì)試驗(yàn)品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，把試驗(yàn)品的最大反響速率Vmax代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可求出其內(nèi)毒素濃度值。7.血袋保養(yǎng)液細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)7.1材料：鱟試劑，內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，檢查用水，血液保存液調(diào)節(jié)液。7.2設(shè)備：BET-32M細(xì)菌內(nèi)毒素分析儀，ZH-2BLENDER混合器。7.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)置7.3.1在軟件里點(diǎn)擊“使用以前標(biāo)準(zhǔn)曲線〞，可在軟件右方框選擇曾保存過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；7.3.2在軟件里點(diǎn)擊“做新標(biāo)準(zhǔn)曲線〞，可重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體步驟如下：〔1〕填好鱟試劑、內(nèi)毒素、檢查用水的批號(hào)；〔2〕分別設(shè)定好“初始濃度〞〔為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度點(diǎn)〕、“稀釋梯度〞〔為各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)之間的稀釋倍數(shù)〕、“濃度點(diǎn)數(shù)〞〔為所做標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)的個(gè)數(shù)〕、“平行管數(shù)〞〔為各點(diǎn)重復(fù)的管數(shù)〕如以下圖所示：〔3〕點(diǎn)擊“自動(dòng)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線〞，在表格中出現(xiàn)所設(shè)置的數(shù)據(jù)，再點(diǎn)擊“陰陽(yáng)性對(duì)照〞，選中“陰性對(duì)照〞，填寫平行管數(shù)，點(diǎn)擊“試管位置選擇〞，點(diǎn)擊“自動(dòng)選擇〞，如以下圖所示：

〔4〕點(diǎn)擊“開(kāi)始檢測(cè)〞，程序設(shè)置完畢。新建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線保存在“檢品管理中心〞的標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)，新標(biāo)準(zhǔn)曲線以默認(rèn)【鱟試劑批號(hào)】+【內(nèi)毒素批號(hào)】+【當(dāng)前時(shí)間】作為文件名存盤，也可在畫面底列“保存文件名〞處自行輸入，如以下圖所示：

〔5〕溶解分裝鱟試劑根據(jù)用量溶解鱟試劑，將溶解的鱟試劑混合在一起，分裝到無(wú)熱原的儀器專用檢測(cè)管內(nèi)，每支檢測(cè)管內(nèi)0.1ml?！?〕加樣取稀釋好的內(nèi)毒素系列濃度溶液，根據(jù)所設(shè)定管數(shù)分別參加有鱟試劑的小試管中，每管0.1ml，另取細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水做陰性對(duì)照?！?〕檢測(cè)每個(gè)濃度點(diǎn)在加完樣后應(yīng)立即用封口膜封口，放入細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀設(shè)定位置，儀器自動(dòng)開(kāi)始檢測(cè)。待標(biāo)準(zhǔn)曲線最后一個(gè)濃度的OD值超過(guò)預(yù)設(shè)值后，用鼠標(biāo)點(diǎn)擊“手動(dòng)停止檢測(cè)〞，停止數(shù)據(jù)采集?！?〕點(diǎn)擊標(biāo)準(zhǔn)曲線坐標(biāo)畫面，生成并儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出相關(guān)系數(shù)?！?〕報(bào)告打印點(diǎn)擊“報(bào)告打印預(yù)覽〞，在報(bào)告打印預(yù)覽畫面點(diǎn)擊“打印〞即可，如以下圖所示：7.4供試品的檢測(cè)過(guò)程7.4.1供試品溶液制備根據(jù)干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用血液保存液調(diào)節(jié)液將供試品稀釋到無(wú)干擾濃度，同時(shí)制備該濃度的供試品陽(yáng)性溶液和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品溶液，樣品陽(yáng)性溶液外加內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品濃度相同，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為所選用標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間濃度。7.4.2檢測(cè)軟件設(shè)置〔1〕點(diǎn)擊“新試驗(yàn)〞，出現(xiàn)試驗(yàn)向?qū)М嬅?，首先填寫鱟試劑批號(hào)、內(nèi)毒素批號(hào)、檢查用水批號(hào)，點(diǎn)擊“供試品設(shè)置〞，選擇供試品名稱，所做供試品管的稀釋倍數(shù)；填寫供試品批號(hào)、稀釋倍數(shù)平行管數(shù)。選中“回收率管〞，填寫外加內(nèi)毒素濃度、供試品稀釋組數(shù)、“供試品稀釋組數(shù)〞填寫“1〞。點(diǎn)擊自動(dòng)設(shè)置，在表格中出現(xiàn)所設(shè)置數(shù)據(jù)?！?〕點(diǎn)擊“陰陽(yáng)性對(duì)照〞畫面，選中“陰性對(duì)照〞，填寫平行管數(shù)，選中“陽(yáng)性對(duì)照〞，填寫平行管數(shù)。鼠標(biāo)點(diǎn)擊“試管位置選擇〞，點(diǎn)擊“自動(dòng)選擇〞后點(diǎn)擊“開(kāi)始檢測(cè)〞，程序設(shè)置完畢。文件存在最后設(shè)置的“供試品名稱〞目錄下，以【供試品批號(hào)+當(dāng)前時(shí)間】為該試驗(yàn)的文件名。7.4.3試驗(yàn)檢測(cè)〔1〕溶解分裝鱟試劑根據(jù)用量溶解鱟試劑，將溶解的鱟試劑混合在一起，分裝到無(wú)熱原的儀器專用檢測(cè)管內(nèi)，每只檢測(cè)管內(nèi)0.1ml?！?〕加樣取稀釋好的供試品溶液、供試品陽(yáng)性溶液、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品溶液，根據(jù)所設(shè)定平行管數(shù)分別參加有鱟試劑的小試管中0.1ml或0.2ml〔沒(méi)有氣泡〕，注意加樣前應(yīng)混合溶液30秒，且每個(gè)濃度加樣前應(yīng)更換加樣頭。另取細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水做陰性對(duì)照?！?〕檢測(cè)每個(gè)供試品在加完樣后應(yīng)立即用封口膜封口，放入細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀設(shè)定位置，儀器自動(dòng)開(kāi)始檢測(cè)。試驗(yàn)完成后，點(diǎn)擊“手動(dòng)停止檢測(cè)〞，停止數(shù)據(jù)采集。在“標(biāo)準(zhǔn)曲線〞處選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線后，計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算出結(jié)果?！?〕觀察分析反響曲線在試驗(yàn)的過(guò)程中和試驗(yàn)結(jié)束后數(shù)據(jù)分析時(shí)可以觀察每一個(gè)試管的反響曲線，以下圖中的反響曲線為內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的正常反響曲線，如果供試品中存在的干擾成分未被排除，它的反響曲線必定有所變化。另外，根據(jù)使用的不同鱟試劑，要適當(dāng)調(diào)整顯示幅度、零化期時(shí)間、預(yù)設(shè)OD值，以適應(yīng)該種鱟試劑的反響特性?！?〕試驗(yàn)報(bào)告打印用鼠標(biāo)點(diǎn)擊“報(bào)告打印預(yù)覽〞，在報(bào)告打印預(yù)覽畫面點(diǎn)擊“打印〞即可。8.結(jié)果分析8.1標(biāo)準(zhǔn)曲線：lrl=0.9992＞0.98，符合要求；8.2陰性對(duì)照：反響時(shí)間遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度所用反響時(shí)間，陰性合格；8.3回收率和樣品：三種樣品回收率分別為107%，102%，93%，內(nèi)毒素含量小于限值，樣品合格。注：樣品回收率=〔樣品陽(yáng)性管檢測(cè)值/20〕*100%8.4細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)檢品編號(hào)檢品名稱批號(hào)稀釋倍數(shù)外加內(nèi)毒素EU/ml反應(yīng)時(shí)間（s）內(nèi)毒素值EU/ml限值EU/ml結(jié)論1陰性對(duì)照＞83902陽(yáng)性對(duì)照402092420.6243紅細(xì)胞保存液301