基于rna干擾技術(shù)的ak2基因表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

近年來，這種人為干預(yù)是一種發(fā)展起來的反向遺傳穩(wěn)定技術(shù)。其作用機(jī)制是由外源性雙鏈rni通過21.23nm的雙鏈酪氨酸酶加工而成的。后者與蛋白質(zhì)結(jié)合形成一個(gè)鈉誘導(dǎo)沉默配合物（risc）。在pt提供能量和解旋酶的幫助下，risc激活并打開了mrna。正義鏈被釋放，反義鏈起到了類似的檢測(cè)作用。risc以堿基互補(bǔ)配合原則為特定，并與目標(biāo)mrna相結(jié)合。在不需要干預(yù)干預(yù)的情況下，mrna是切割的，叛亂片段被完全分解，以抑制基因的表達(dá)，并導(dǎo)致細(xì)胞失去特定基因的表型。2007年,我們針對(duì)傳導(dǎo)途徑中一種重要的編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的基因亞型Akt2構(gòu)建具有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA干擾重組表達(dá)載體,為進(jìn)一步探討該基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及腫瘤治療新方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1材料和方法1.1prnat-u6.2表達(dá)質(zhì)粒大腸桿菌JM109為鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室保存的pGEM-TEasy載體,pRNAT-U6.2表達(dá)質(zhì)粒購于南京GenScript公司,TaqDNA聚合酶、4×dNTP、T4DNA連接酶購自Promega公司,DEPC水、RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自QIAGEN公司。1.2方法1.2.1分子身份證的合成根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的Akt2的mRNA基因序列(M95936),利用專門設(shè)計(jì)分析軟件進(jìn)行設(shè)計(jì),對(duì)上述候選序列通過美國生物技術(shù)信息中心的在線同源序列進(jìn)行檢索,分別在96～114位點(diǎn)及525～543位點(diǎn)選擇19個(gè)堿基的核苷酸片段作為靶序列,即5′-GGTGTCTGTCATCAAAGAA-′及5′-AGTGACCATGAATGACTTC-3′,分析其GC%分別為42%及47%,并設(shè)計(jì)一條無關(guān)對(duì)照序列5′-TCTACGAGTCGCGGCATTC-3′,根據(jù)此序列分別合成正義鏈和反義鏈,此正義鏈和反義鏈包含19nts的基因序列且序列互補(bǔ),中間加入9nts的發(fā)卡環(huán),3′端加入終止信號(hào)TTTTTT,5′末端加入BamHI酶切位點(diǎn),3′端加入XhoI酶切位點(diǎn),6條鏈均由上海生工合成。1.2.2火關(guān)于火分子的反應(yīng)分別取兩條寡核苷酸片段各2μl,1×退火buffer46μl,反應(yīng)條件:95℃5min,70℃10min,30℃維持30min,緩慢降至4℃。1.2.3pgem-trapu-t-u反應(yīng)體系:2×Buffer5μl,T4DNA聚合酶1μl,膠回收PCR產(chǎn)物3μl,pGEM-TEasy載體1μl,4℃過夜。按常規(guī)操作方法將重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109,經(jīng)藍(lán)白篩選后用T7和SP6為引物進(jìn)行PCR鑒定,得到pGEM-T-96、pGEM-T-525及pGEM-T-contral。1.2.4pcr擴(kuò)增條件及條件pGEM-T-contral反應(yīng)體系:10×buffer6μl,BamHI,XhoI酶3μl,質(zhì)粒47μl,Milli-H2O1μl;反應(yīng)條件:37℃酶切1h,70℃滅活5min。膠回收線性化的pRNAT-U6.2載體及發(fā)夾樣DNA片段96、525、contral并進(jìn)行連接。反應(yīng)體系:2×Buffer5μl,T4DNA聚合酶1μl,膠回收PCR產(chǎn)物3μl,pGEM-TEasy載體1μl。反應(yīng)體系:2×Buffer5μl,目的基因Akt23μl,雙酶切的pRNAT-U6.2載體1μl,T4DNA連接酶1μl;4℃過夜。將連接產(chǎn)物再次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109,用pRNAT-U6.2的插入鑒定引物進(jìn)行PCR鑒定,反應(yīng)體系:10×Buffer3μl,4×dNTP2μl,pRNAT1引物0.5μl,pRNAT2引物0.5μl,TaqDNA聚合酶0.5μl,模板DNA5μl,Milli-H2O18.5μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min,94℃變性50s,55℃退火50s,72℃延伸60s,35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5min。陽性重組質(zhì)粒送到上海生工測(cè)序。分別得到pRNAT-U6.2-96、pRNAT-U6.2-525及pRNAT-U6.2-contral。2結(jié)果2.1陽性重組質(zhì)粒的構(gòu)建單鏈DNA退火產(chǎn)物與pGEM-TEasy連接后,轉(zhuǎn)化JM109,藍(lán)白篩選后以T7/SP6作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于T7/SP6是pGEM-T載體的通用引物,其自身擴(kuò)增片斷長度是176bp,加上插入的目的片斷70bp左右,陽性重組質(zhì)粒擴(kuò)增片斷長度應(yīng)接近250bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,在接近250bp處有特異性條帶,與預(yù)先估計(jì)的片斷大小一致,且無其他非特異性擴(kuò)增條帶。2.2prnat-u6.2-akt2-pcr擴(kuò)增片段的鑒定目的基因與線性化的表達(dá)載體連接后轉(zhuǎn)化JM109細(xì)菌均得到10個(gè)以上克隆,以pRNAT-U6.2插入鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到約560bp的擴(kuò)增片段,分別命名為pRNAT-U6.2-Akt2-96、pRNAT-U6.2-Akt2-525及pRNAT-U6.2-contral。2.3prnat-u6.2-akt2-126插入序pRNAT-U6.2-Akt2-96插入序列:GGATCCGGTGTCTGTCATCAAAGAATTCAAGAGATTCTTTGATGACAGACACCTTTTTTCTCGAG;pRNAT-U6.2-Akt2-525插入序列:GGATCCAGTGACCATGAATGACTTCTTCAAGAGAGAAGTCATTCATGGTCACTTTTTTTCTCGAG;對(duì)照序列:GGATCCTCTACGAGTCGCGGCATTCTTCAAGAGAGAATGCCGCGACTCGTAGATTTTTTCTCGAG;陽性重組載體插入序列測(cè)序的結(jié)果,與設(shè)計(jì)的發(fā)卡樣寡核苷酸序列比較結(jié)果完全一致。3新靶點(diǎn)分子和真核表達(dá)載體Akt是從人cDNA文庫中分離出來的與鼠類胸腺淋巴瘤病毒原癌基因同源的編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的基因片段,又名蛋白激酶B。Akt處于細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)途徑的交叉口,是體內(nèi)重要的生存信號(hào)通路PI3K/AKT的關(guān)鍵分子,它受上游生長因子、激素、細(xì)胞因子等多種因子調(diào)節(jié),被激活后與下游多種底物結(jié)合,從多個(gè)方面參與細(xì)胞的增生、凋亡、分化、代謝等過程,并在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前,Akt已成為重要的腫瘤分子生物學(xué)治療的新靶點(diǎn)。Akt有三種亞型,分別為Akt1、Akt2、Akt3,其各自的生物學(xué)功能及在腫瘤治療中所處的地位尚不十分明確。王靜等研究顯示,Akt2及活化的Akt在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá),且Akt2、CyclinD1和MMP-9在肺癌的發(fā)展中呈正相關(guān);還有研究表明,以Akt2為靶點(diǎn)的siRNA可減少卵巢癌細(xì)胞增殖。本研究構(gòu)建了具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的Akt2的siRNA真核表達(dá)載體,旨在為進(jìn)一步探討該基因在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及肺癌治療新方法提供參考。pRNAT-U6.2是新型高效真核表達(dá)載體,具有細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄小核RNAU6.2的作用原件,可準(zhǔn)確啟動(dòng)和終止轉(zhuǎn)錄信號(hào),有效限制被轉(zhuǎn)錄RNA片段的大小,抵抗引起干擾素的非特異作用,且該表達(dá)載體具有SV40啟動(dòng)子,可使所構(gòu)建的載體在真核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,增加細(xì)胞內(nèi)siRNA轉(zhuǎn)錄的模板數(shù),增強(qiáng)、加快和延長RNA干擾的效應(yīng);同時(shí)此載體上還引入了綠色熒光蛋白(GFP)及新霉素(neo)抗性標(biāo)記,GFP便于追蹤轉(zhuǎn)