不同劑量sz聯(lián)合高糖高脂飲食對2型糖尿病大鼠模型建立的影響

型糖尿病模型動物模型制備方法隨著世界人口的增長、食品結(jié)構(gòu)和生活方式的變化，糖尿病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，并呈快速增長趨勢。其中兩類糖尿病約占所有糖尿病患者的90%95%。為了更深入的研究糖尿病的發(fā)病機(jī)制并尋找潛在的治療手段,建立簡單、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定同時符合2型糖尿病(T2DM)特點(diǎn)的動物模型具有重要意義。目前“高糖高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)造模法”為國內(nèi)外探索2型糖尿病動物模型中最常用的制備方法。造模過程中STZ的注射劑量直接影響動物模型成模率及成模穩(wěn)定性,但國內(nèi)外STZ一次性注射造模法中STZ劑量選用報(bào)道眾多,尚存有爭議。為此本課題組選用不同劑量STZ一次性左下腹腔注射,并結(jié)合高糖高脂飲食建立實(shí)驗(yàn)性SD大鼠2型糖尿病模型,觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠成模率及穩(wěn)定性。1材料和方法1.1高糖高脂飼料及試劑健康SD雄性大鼠90只(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供),8周齡,體質(zhì)量180~210g,飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,飼養(yǎng)室溫(18~26)℃,相對濕度40%~55%,每籠飼養(yǎng)5只,共分18籠,自由攝食、飲水,普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后予高糖高脂飼料飼養(yǎng)。高糖高脂飼料成分:基礎(chǔ)飼料55%,脂肪10%,膽固醇10%,糖20%,奶粉5%,另加少量微量元素?；A(chǔ)料的營養(yǎng)成分符合國標(biāo)《GB1492413-2001·實(shí)驗(yàn)動物·小鼠大鼠配合飼料》的營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn),高脂飼料喂養(yǎng)前一周配制,-20℃保存。鏈脲佐菌素(STZ)購于美國Sigma公司,枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液:檸檬酸(FW:210.14)2.1g加入雙蒸水100mL中配成A液,檸檬酸鈉(FW:294.10)2.94g加入雙蒸水100mL中配成B液。A、B液按11:8比例混合即是所需配置STZ的檸檬酸緩沖液。康樂全血糖儀及同批號血糖試紙由羅氏公司提供,血清TG、TC、LDL-C和HDL-C試劑盒購自西安惠諾生物科技有限公司。檸檬酸鈉,河南焦作市化工三廠;檸檬酸,湖南湘中精細(xì)化學(xué)品廠。1.2胰島素敏感性指數(shù)將90只SD大鼠適應(yīng)性生長一周后隨機(jī)平均分為6組,即普通飼料喂養(yǎng)+緩沖液組(15只)、高糖高脂飼料喂養(yǎng)+緩沖液組(15只)、高糖高脂飼料喂養(yǎng)+35mg/kgSTZ組(H.E組)15只、高糖高脂飼料喂養(yǎng)+45mg/kgSTZ組(H.E+45mg/kgSTZ組)15只、高糖高脂飼料喂養(yǎng)+55mg/kgSTZ組(H.E+55mg/kgSTZ組)15只、高糖高脂飼料喂養(yǎng)+65mg/kgSTZ組(H.E+65mg/kgSTZ組)15只。胰島素敏感性指數(shù)(ISI)可直接反映,計(jì)算公式為ISI=l/(空腹血糖×空腹胰島素),血脂及游離脂肪酸等可間接反映IR狀態(tài)。2型糖尿病標(biāo)準(zhǔn):注射STZ后1周內(nèi)血糖升高,空腹血糖≥11.1mmol/L,同時胰島素敏感指數(shù)ISI降低。穩(wěn)定的2型糖尿病模型:STZ注射12周,空腹血糖≥11.1mmol/L?？崭寡獫{葡萄糖測定采鼠尾靜脈取血后血糖儀測定。血漿空腹胰島素測定使用放射免疫法,血脂測定使用氧化酶法,血漿游離脂肪酸(FFA)測定用酶比色分析法,具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析,用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ISI數(shù)據(jù)不利于統(tǒng)計(jì)分析,將其對數(shù)轉(zhuǎn)換后比較。2結(jié)果2.1stz分次注射糖尿病模型6組大鼠均選自健康、精神狀況良好的大鼠。普通飲食組和高脂飲食組注射緩沖液后未出現(xiàn)異常。各STZ注射組均出現(xiàn)大鼠死亡,以STZ注射后一周內(nèi)死亡較為密集,隨STZ注射劑量提高,大鼠死亡率亦隨之升高,于STZ注射一周后測量空腹血糖(FBG)及胰島素敏感指數(shù)(ISI),同時依據(jù)上述2型糖尿病判斷標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算各組大鼠成模率。其中H.E+45mg/kgSTZ組的總成模率最高,為73.33%。H.E+55mg/kgSTZ組及H.E+65mg/kgSTZ組相對成模率高于H.E+45mg/kgSTZ組,但大鼠死亡過多,總成模率較低,見表1。2.2體質(zhì)量增長快6組大鼠初始體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),隨著喂養(yǎng)時間延伸體質(zhì)量呈規(guī)律性生長,其中高糖高脂喂養(yǎng)各組體質(zhì)量較普通飼料喂養(yǎng)組增長快。大鼠經(jīng)腹腔注射后,STZ各組大鼠開始出現(xiàn)多飲、多食、多尿情況,成模大鼠體質(zhì)量與H.E組相比由無差異變?yōu)轱@著降低(P<0.01),僅注射緩沖液組未見明顯異常,體質(zhì)量繼續(xù)規(guī)律增長,累計(jì)高糖高脂喂養(yǎng)8周后,H.E組較普通飼料組體質(zhì)量顯著增加(P<0.01),見表2。2.3血糖含量檢測大鼠造模4周后H.E飲食各組胰島素敏感性指數(shù)(ISI)明顯低于普通飼料組,血漿胰島素(FINS)明顯高于普通飼料喂養(yǎng)組(P<0.01)。STZ各組成模大鼠空腹血糖(FBG)顯著高于僅注射緩沖液2組空腹血糖水平(P<0.01),見表3。繼續(xù)高糖高脂喂養(yǎng)8周達(dá)到注射12周后檢測各成模大鼠FBG,H.E+35mg/kgSTZ組自愈2例,血糖低于11.1mmol/L。其它組成模大鼠FBG仍維持于高水平。2.4膽固醇、游離脂肪酸與普通飼料組相比,HE各組甘油三脂(TG)、膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)均顯著升高(P<0.01),低密度脂蛋白(LDL)升高,高密度脂蛋白(HDL)降低,見表4。2.5兩組輸注stz注射后胰腺外分泌細(xì)胞形態(tài)變化鏡下可見緩沖液或STZ注射4周后普通飼料組大鼠的胰腺與H.E飼料組胰腺外分泌細(xì)胞及胰島內(nèi)形態(tài)正常,分界清楚,兩組之間相互無區(qū)別。STZ注射組胰腺外分泌細(xì)胞充血,分界不清,明顯炎性浸潤,細(xì)胞核破碎、溶解;胰島內(nèi)細(xì)胞大量破裂,細(xì)胞核變形溶解,殘存細(xì)胞核數(shù)量少,明顯分布不均,見圖1。3型糖尿病的發(fā)病特點(diǎn)及模型的復(fù)制建立2型糖尿病可通過高糖高脂飲食誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗(IR)后,再通過注射STZ損傷胰島功能,引起血糖升高,模擬2型糖尿病的發(fā)展過程。IR是指動物全身各組織器官胰島素敏感性下降的一種狀態(tài),表現(xiàn)為外周組織尤其是肌肉、脂肪組織等對葡萄糖利用率降低。此時,正常濃度的胰島素不能發(fā)揮相應(yīng)胰島素效應(yīng)。在2型糖尿病患者中,大部分患者有不同程度的超重或肥胖;同時一定程度的肥胖可能會導(dǎo)致胰島素抵抗,進(jìn)而使胰腺組織的β細(xì)胞胰島素分泌功能代償性增強(qiáng),當(dāng)胰腺β細(xì)胞因胰島素抵抗等因素進(jìn)一步損害而導(dǎo)致胰島素的分泌功能失代償,即會出現(xiàn)葡萄糖耐量受損,隨著病程的發(fā)展而轉(zhuǎn)變?yōu)?型糖尿病。實(shí)驗(yàn)過程中,各H.E組的SD大鼠經(jīng)過4周高糖高脂飲食后,質(zhì)量較正常大鼠增加,胰島素敏感指數(shù)ISI較正常飲食大鼠顯著下降,同時血FBG、TC、TG、FFA水平較普通飲食喂養(yǎng)組大鼠顯著增加,由于這幾項(xiàng)指標(biāo)可以間接反映胰島素敏感性下降,因此我們的實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)過4周高糖高脂飲食可以在SD大鼠上誘導(dǎo)出較為理想的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),模擬人類2型糖尿病的發(fā)病特點(diǎn)。鏈脲佐菌素(STZ)是一種廣譜抗生素,對實(shí)驗(yàn)動物的胰島β細(xì)胞具有高度選擇性的毒性作用,目前國內(nèi)外學(xué)者已廣泛選擇高糖高脂飲食結(jié)合STZ腹腔注射的方法制作2型糖尿病模型,本文對國內(nèi)幾種常用STZ注射劑量加以研究,各組STZ成模大鼠均具有糖尿病大鼠多飲、多食、多尿、體質(zhì)量減輕等表現(xiàn),35mg/kgSTZ注射組較低劑量STZ腹腔注射成模4周后亦可出現(xiàn)血糖降低,但成模率及穩(wěn)定性均較差。45mg/kgSTZ注射組死亡率為13.33%,顯著低于更高劑量STZ注射組,總體成模率為73.33%,明顯高于其它各組,且血糖能維持在較高水平持續(xù)12周以上,穩(wěn)定性良好。本文結(jié)合課題組的實(shí)驗(yàn)觀察及國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道研究發(fā)現(xiàn)高糖高脂飲食聯(lián)合STZ腹腔注射,可成功復(fù)制出符合人類2型糖尿病特點(diǎn)的糖尿病大鼠模型。而45mg/kg是較合適的STZ選擇劑量,選用該劑量聯(lián)合高糖高脂飲食成模率高,死亡率低,穩(wěn)定性好,適合建造2型糖尿病大鼠模型。1.1.1動物和食物的實(shí)驗(yàn)1.1.2試劑和機(jī)器1.2.1動物組1.2.2食物誘導(dǎo)適應(yīng)