乳酸菌的分類及耐藥機制

蘑菇是一種陽性菌，主要是脂肪酸。根據(jù)乳酸菌種系進化過程中形成的不同生化指標(biāo)可以分為:低GC含量的一群,例如,腸球菌屬(Enterococcus),乳酸桿菌屬(Lactobacillus),乳酸球菌屬(Lactococcus),明串珠菌屬(Leuconostoc),足球菌屬(Pediococci)和鏈球菌屬(Streptococcus),以及高GC含量的雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)。乳酸菌是存在于人類和其他動物體內(nèi)(腸道、鼻腔和陰道黏膜)以及環(huán)境中(以植物為主)的非常重要的一類微生物。乳酸菌已經(jīng)作為益生菌廣泛應(yīng)用于食品以及藥品領(lǐng)域中,例如發(fā)酵酸奶,乳飲料,腸道微生態(tài)制劑等。傳統(tǒng)的乳酸菌種具有很長的使用歷史,但隨著人類生活水平的不斷提高和食物種類的增多,乳酸菌應(yīng)用所帶來的安全問題也引起人們的注意,尤其是某些菌株對抗生素的耐藥現(xiàn)象更是潛在的危險因素。一般情況下,耐藥性的傳播主要發(fā)生在臨床相關(guān)的菌株中。但也已經(jīng)有體內(nèi)實驗證明,在腸道正常菌之間和腸道正常菌與致病菌之間也存在著耐藥基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。食物鏈就是耐藥基因在腸內(nèi)傳播的主要途徑,尤其是發(fā)酵乳品和發(fā)酵肉食品。如果它們在使用前未經(jīng)過加熱處理,就可能使得其中的菌株進入人類的胃腸道,與腸道的正常菌群或者腸道的過路菌接觸,并傳播耐藥性基因,使得原本敏感的菌表現(xiàn)出耐藥的表型。許多研究者都指出,商用乳酸菌菌株如果不經(jīng)過嚴格的安全性檢測,很有可能會扮演耐藥性基因貯存宿主的角色。雖然大部分與食品有關(guān)的乳酸菌都已經(jīng)獲得了GRAS(相對安全認證),但是它們?nèi)源嬖谥鴿撛诘陌踩[患,作為耐藥性基因的貯存宿主,它們的耐藥性基因可能會轉(zhuǎn)移到人類腸道中的其他正常菌群或者致病菌中,但目前這些都只是猜測并未經(jīng)過證實。1抗菌藥物的作用機制自從50年前人們開始利用抗生素來治療細菌性疾病以來,隨著大量的新品種抗生素相繼問世以及在治療過程中的濫用現(xiàn)象,耐藥性問題也逐漸的顯現(xiàn)出來,使人們在治療與防治感染性疾病時面臨新的考驗。細菌產(chǎn)生耐藥性的機制主要包括四個方面:⑴通過改變細胞膜的滲透性來改變藥物的滲透能力。⑵通過產(chǎn)生抗生素的鈍化酶(例如β-內(nèi)酰胺酶,葡萄糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶,核苷酸轉(zhuǎn)移酶和磷酸基轉(zhuǎn)移酶),抑制抗生素的作用。⑶通過激活抗生素的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(如在細胞膜上ATP依賴的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)),將抗生素轉(zhuǎn)移到胞外。⑷通過目標(biāo)修飾(例如23SrRNA的甲基化修飾,拓撲異構(gòu)酶的氨基酸順序突變),改變抗生素作用的靶點。細菌耐藥性一般可以大致分為兩種:一是固有性耐藥,二是獲得性耐藥。固有性耐藥一般不會發(fā)生轉(zhuǎn)移。獲得性耐藥大多是由于抗生素的選擇性壓力所產(chǎn)生的,既可以是由自身基因突變產(chǎn)生耐藥基因,也可以是從外界獲得耐藥基因。這種耐藥性具有在細菌間水平轉(zhuǎn)移的可能性。某些耐藥基因是可以轉(zhuǎn)移的,轉(zhuǎn)移方式可以分為垂直轉(zhuǎn)移和水平轉(zhuǎn)移。垂直的基因轉(zhuǎn)移方式是指通過具有耐藥性的菌株克隆繁殖進行傳播。這種方式較為普遍,但是危害性并不高。水平的基因轉(zhuǎn)移是耐藥性基因擴散的主要方式,包括三種機制:⑴天然轉(zhuǎn)移,它包括從細胞外介質(zhì)中吸收游離的DNA并整合到基因組中。⑵接合,是一種通過性菌毛的DNA(主要是質(zhì)粒)轉(zhuǎn)移的方式,在大多數(shù)菌屬中都可以發(fā)現(xiàn)。⑶轉(zhuǎn)導(dǎo),是以噬菌體為載體的轉(zhuǎn)移DNA的方式,其中接合是主要的轉(zhuǎn)移方式。原因之一就是很多耐藥性基因都位于像質(zhì)?；蛘咿D(zhuǎn)座子之類的移動元件上。第二個原因就是接合作用能使DNA跨種屬轉(zhuǎn)移,而轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)導(dǎo)只能在同種之間進行?？股氐氖褂脤Τ霈F(xiàn)耐藥性細菌起到了關(guān)鍵的作用。只要將混合菌群暴露于抗生素,就會有能夠耐受一定濃度的給定抗生素的細菌。而且一種抗生素不僅能選擇出來針對該藥物的耐藥性菌株,還可以選擇出其他與這種抗生素結(jié)構(gòu)相近的化合物的耐藥性菌株。例如具有四環(huán)素耐藥性的基因tet的微生物就可以耐受氧化四環(huán)素,氯四環(huán)素,脫氧土霉素和米諾環(huán)素。這是由于不同的抗生素具有共同的作用位點,而這些位點都被耐藥基因的產(chǎn)物所修飾,所以產(chǎn)生了對結(jié)構(gòu)相近的抗生素的耐藥性。然而在結(jié)構(gòu)不同的抗生素中也存在著聯(lián)合抗藥性,例如erm基因能夠產(chǎn)生對大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類抗生素和鏈陽性菌素B的耐藥性。2乳酸菌的耐藥性近年來,已經(jīng)有許多人對乳酸菌的抗生素敏感性進行了研究。有少部分研究者認為乳酸菌具有耐藥性是有利的,當(dāng)人們利用抗生素治療疾病的時候不會將對人體有益的乳酸菌也一同殺滅。但是,有些乳酸菌有可能是潛在的致病菌,一旦成為致病原,由于它們具有耐藥性將無法利用抗生素對其進行治療。而且更重要的是,有些乳酸菌的耐藥性具有可轉(zhuǎn)移性,可能會轉(zhuǎn)移到其它乳酸菌或致病菌中,對人類產(chǎn)生威脅。明確乳酸菌的耐藥性特點是十分重要的。一些研究者對幾種主要的乳酸菌的耐藥表型進行了檢測,得到了如表1的結(jié)果。由此表數(shù)據(jù)可以分析得出,大部分乳酸菌對抗革蘭陰性菌的抗生素具有耐藥性,例如鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素。此外,足球菌屬,明串珠菌屬,以及乳桿菌屬中的嗜酸乳桿菌(Lb.acidophilus),植物乳桿菌(Lb.plantarum),干酪乳桿菌(Lb.casei),唾液乳桿菌(Lb.salivarius)和李氏乳桿菌(Lb.leishmannii)都對萬古霉素具有耐藥性。萬古霉素屬于糖肽類抗生素,能夠抑制肽聚糖的合成。在臨床上通常被推薦用來治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染,包括敗血癥、心內(nèi)膜炎、組織和骨感染,是經(jīng)β-內(nèi)酰胺類抗生素或其他抗菌藥物治療失敗后的最后手段,故也通常被認為是抗菌藥物的最后一道防線。但是目前許多乳酸菌屬都對萬古霉素具有耐藥性。尤其值得重視的是,某些腸球菌所具有的萬古霉素耐藥性還可以轉(zhuǎn)移給其他菌屬。3乳酸菌的基因型基因乳酸菌具有主動或被動的通過接合質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子與其他細菌交換遺傳物質(zhì)的潛在能力,這種潛在的能力是其能夠從其他細菌獲得抗生素耐藥性基因的前提。乳酸菌中普遍存在著質(zhì)粒,區(qū)別就在于質(zhì)粒的大小、功能和分布。至少有25種乳酸桿菌具有固有的質(zhì)粒,而且有的一種菌株里有多個質(zhì)粒,例如,具有廣譜宿主接合性的耐藥性質(zhì)粒pAMβ1和pIP501能夠進行種間接合。而且在某些腸球菌、乳酸球菌和鏈球菌中還發(fā)現(xiàn)了接合性轉(zhuǎn)座子的存在。這些可移動元件,為乳酸菌耐藥基因的傳播提供了遺傳學(xué)基礎(chǔ)。3.1環(huán)素耐藥基因t.mpK214是從奶酪中分離的乳酸乳球菌K214株里分離出來的一個含有多種抗生素耐藥性基因的質(zhì)粒,包括鏈霉素、四環(huán)素和氯霉素耐藥基因和編碼藥物泵出系統(tǒng)的基因mef214。研究者還對從風(fēng)干的香腸中分離出來的一些乳酸桿菌進行了檢測,發(fā)現(xiàn)它們具有一些大小約為10KB左右的質(zhì)粒(少數(shù)大于25KB),在這些質(zhì)粒上攜帶了四環(huán)素耐藥基因tet(M)。此外,從植物乳桿菌5057株中還分離出來了攜帶四環(huán)素耐藥基因的質(zhì)粒pMD5057,該質(zhì)粒已經(jīng)完成了測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中的四環(huán)素耐藥基因tet(M)與產(chǎn)氣莢膜梭菌和金黃色葡萄球菌中tet(M)的序列高度同源。近來在紅霉素耐藥的發(fā)酵乳桿菌(Lb.fermentum)中還發(fā)現(xiàn)一個19.3KB的質(zhì)粒,攜帶一種新的紅霉素耐藥性決定基因erm(LF)。羅伊乳桿菌(Lb.reuteri)發(fā)酵乳桿菌,嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的中存在R質(zhì)粒,它攜帶紅霉素、氯霉素和大環(huán)內(nèi)酯類林克霉素鏈陽性菌素的耐藥基因。而近年來倍受關(guān)注的腸球菌攜帶的耐藥基因,例如紅霉素,萬古霉素,四環(huán)素,氯霉素和慶大霉素耐藥相關(guān)的基因都位于質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子這些可轉(zhuǎn)移性遺傳物質(zhì)上。3.2轉(zhuǎn)座子的形成接合轉(zhuǎn)座子是革蘭陽性菌傳播耐藥基因的重要遺傳物質(zhì)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的含有接合性轉(zhuǎn)座子的乳酸菌有:糞腸球菌(E.faecalis)(含有Tn916,Tn918,Tn920,Tn925,Tn2702);屎腸球菌(E.faecium)(含有Tn5233);釀膿鏈球菌(S.pyogenes)(含有Tn3701);無乳鏈球菌(S.agalactiae)(含有Tn93951);以及乳酸乳球菌(Lc.lactis)(含有Tn5276,Tn5301)。值得注意的是,在腸球菌屬和鏈球菌屬中,這些轉(zhuǎn)座子攜帶了四環(huán)素(tet(M)),紅霉素(ermAM),氯霉素(cat)和卡那霉素(aphA-3)的耐藥基因。而在乳球菌中,這些接合轉(zhuǎn)座子只是與乳酸鏈球菌肽的合成和蔗糖的發(fā)酵過程相關(guān)。上述的轉(zhuǎn)座子大小在16到70KB,可能以單拷貝或者多拷貝的形式插入到質(zhì)粒中或者染色體上。3.3腸球形菌屬天然的接合性轉(zhuǎn)移在乳酸桿菌中很少,但是在乳球菌中則很常見,這主要是由于乳球菌的基因組中一般含有較多數(shù)量的質(zhì)粒,因此它發(fā)生接合性轉(zhuǎn)移的概率也就較高。腸球菌屬是另一種較易發(fā)生接合性轉(zhuǎn)移的菌屬,它是一種常用的接合受體菌,但同時它也可以作為供體菌向非親緣關(guān)系的腸球菌,乳酸桿菌和其他革蘭陽性菌例如芽胞桿菌,葡萄球菌和李斯特菌,甚至是革蘭陰性菌轉(zhuǎn)移耐藥基因。研究發(fā)現(xiàn)參與接合性轉(zhuǎn)移的DNA元件包括攜帶卡那霉素耐藥基因的質(zhì)粒和攜帶四環(huán)素與紅霉素耐藥基因的轉(zhuǎn)座子,這些DNA元件經(jīng)過實驗證明可以在小鼠腸道中從糞腸球菌中分別轉(zhuǎn)移到大腸埃希菌和李斯特單胞菌屬。其他的乳酸菌屬則很少發(fā)生遺傳物質(zhì)的接合性轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。4乳酸菌需有足夠的細菌或與食物相互作用造成的耐藥基因未被使用的,易產(chǎn)生獲得性耐藥目前還沒有對乳酸菌耐藥性展開完全而系統(tǒng)的研究。大多數(shù)研究都是針對條件致病性腸球菌的,而乳酸桿菌和乳酸球菌則較少。一些乳酸菌可能對某些抗生素具有固有的耐藥性,例如嗜酸性乳桿菌對萘啶酸和氟哌酸具有固有的耐藥性。固有性和獲得性耐藥性是很難區(qū)分的,因為我們無法研究菌株處于獲得性耐藥性之前的狀態(tài)。如果包括腸球菌、乳酸球菌和乳酸桿菌在內(nèi)的乳酸菌在穩(wěn)定接觸抗生素的環(huán)境中(如人類的腸道,動物的腸道,牛的乳房)就容易發(fā)生獲得性耐藥。在致病性乳酸菌(如鏈球菌)、潛在致病性乳酸菌(如腸球菌)和作為正常菌群成員的乳酸菌(如腸內(nèi)的乳酸桿菌和乳球菌)之間的接觸沒有任何屏障,使得這些乳酸菌容易產(chǎn)生獲得性耐藥。如果在3類菌中發(fā)現(xiàn)同樣的耐藥基因則認為耐藥性發(fā)生了轉(zhuǎn)移,例如,在這3類菌中都發(fā)現(xiàn)了四環(huán)素耐藥基因(如tetM),紅霉素耐藥基因(ermAM),氯霉素耐藥基因(cat),鏈霉素耐藥基因(str)以及鏈陽性菌素耐藥基因(sat)。這些結(jié)果說明,在接觸抗生素的過程中,使得乳酸菌像其他細菌一樣具有跨越種屬間傳播耐藥性的能力。乳酸菌與其他細菌一樣為了在抗生素條件下生存就會發(fā)生基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。因此食品微生物學(xué)家認為我們應(yīng)該避免使用具有可轉(zhuǎn)移性耐藥性的細菌。我們可以通過一些方法來避免具有可轉(zhuǎn)移耐藥性的細菌從動物來源進入食物,