水溶相體系中海洋泥抗氧化及美白功效評價(jià)

海泥屬于礦渣。根據(jù)現(xiàn)代研究，海污泥具有豐富的礦物、膠體成分、獨(dú)特的海洋微生物、維生素、氨基酸和抗生素等。在美容方面,海泥豐富的物質(zhì)組成比較復(fù)雜,是一般面膜基料所不具備的,這些物質(zhì)具有促進(jìn)皮膚新陳代謝,增強(qiáng)皮膚營養(yǎng),延緩皮膚衰老的作用。浙江秀山灘涂海泥集東海生態(tài)環(huán)境和錢塘江沖積之精華,天然、潔凈且細(xì)膩,富含多種對人體皮膚有益的鍺、鋅、鈣、鎂、鐵和各類維生素、氨基酸等天然物質(zhì),灘涂海泥中含有的水藻類、水草和甲殼類等動植物殘骸,經(jīng)過多年淤積,已形成對人體皮膚有益的活性蛋白質(zhì)和多糖等有機(jī)物質(zhì)。本研究比較篩選出海泥美白功效的評價(jià)方法,對秀山海泥水溶相體系的抗氧化性能和美白功效進(jìn)行了測定,并對海泥水溶提取液功效的影響因子進(jìn)行了初步研究,旨在為秀山海泥的進(jìn)一步精深加工利用提供理論依據(jù),具有較高的應(yīng)用價(jià)值。1材料和方法1.1海泥干粉的制備海泥,采自浙江省岱山縣秀山鄉(xiāng)滑泥主題公園的灘涂。在灘涂的起始位置,按高、中和低潮位各取一點(diǎn),合并三點(diǎn)的泥樣作為此位置的樣品。然后每隔200m取一次樣,共取5次,均勻混合后的泥樣經(jīng)過干燥、過篩和粉碎制得海泥干粉。酪氨酸酶購自Sigma公司的蘑菇酪氨酸酶,比活力為5370U/mg;L-酪氨酸、熊果苷、Trolox(6-hydro-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid)均購自Sigma公司,BathocuprionedisulfonateAcid(BCS,2,9-dimethy1-4,7-dipheny1-1,10-phenanthro-linedisulfonic)購自Fluka公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純,實(shí)驗(yàn)用水采用雙蒸水。1.2抗逆效應(yīng)評價(jià)1.2.1抗氧化性能測定利用Cu2+被樣品中的抗氧化物質(zhì)還原為Cu+形式,新生成的Cu+能夠與BathocuprionedisulfonateAcid(BCS)結(jié)合生成橘黃色絡(luò)合物,該物質(zhì)能夠穩(wěn)定存在且在480nm處有最大吸收峰,根據(jù)吸光度值大小可以計(jì)算樣品抗氧化性能強(qiáng)弱。1.2.2硫酸銅溶液的加入采用Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)還原性物質(zhì)。準(zhǔn)確吸取1mmol/LBCS溶液2mL、0.5mol/L硫酸銅溶液2mL、pH5.6的10mmol/L磷酸鹽緩沖液5mL于25mL容量瓶中,然后分別準(zhǔn)確加入3mmol/LTrolox溶液50μL、100μL、200μL、250μL,搖勻,加水定容,反應(yīng)10min,于480nm處測吸光度值A(chǔ),試驗(yàn)設(shè)三個平行樣。1.2.3海泥提取液樣品制備取10g樣品溶于50mL雙蒸水中,經(jīng)攪拌、混勻和離心處理后取澄清液,沉淀加適量水重復(fù)處理三次,合并三次澄清液定容至100mL,制得海泥提取液,待檢。測定時(shí)以樣品5mL取代各組標(biāo)準(zhǔn)物Trolox,配制和檢測方法同上。每份樣品設(shè)置雙管同時(shí)檢測,取平均值,要求雙管值差小于0.5%。1.3酪氨酸酶法提取肌肉中多巴和二巴美白功效采用體外評價(jià)的酪氨酸酶法。酪氨酸酶是黑色素生成的關(guān)鍵酶,它控制著黑色素的形成過程,酶活性的大小對黑色素的沉積起主要作用。此法是目前評價(jià)美白和祛斑產(chǎn)品功效的常用方法。其原理是L-酪氨酸或多巴酸在酪氨酸酶的作用下轉(zhuǎn)化為多巴醌,該反應(yīng)是呈色反應(yīng),在490nm處有最大吸光度,加入的抑制劑對此反應(yīng)具有可逆的競爭性抑制,降低了酶與底物的作用程度。所以根據(jù)吸光度值可以計(jì)算樣品對酶的抑制效果。1.3.1對酶的抑制率測定結(jié)果描述目前尚無法定或公認(rèn)的酪氨酸酶法的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),熊果苷是常用的美白添加劑,其效應(yīng)位點(diǎn)和作用機(jī)理清楚,酶動力曲線相關(guān)關(guān)系密切,對酪氨酸酶活性的抑制強(qiáng)度適中,故將其作為標(biāo)準(zhǔn)對照品用于檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和結(jié)果的可靠性。試驗(yàn)選用熊果苷作為標(biāo)準(zhǔn)對照品,測定了熊果苷對酶的抑制率,同時(shí)測定了已知具有美白功效的氫醌、維生素C硫酸鎂、桑椹提取液Biowhite對酪氨酸酶的抑制率,并與文獻(xiàn)采用曲酸作為標(biāo)準(zhǔn)對照品的測定結(jié)果進(jìn)行比較(表1)。為了更直觀地描述試驗(yàn)結(jié)果,定義比抑制率的概念,即以同一標(biāo)準(zhǔn)對照測得的各樣品對酪氨酸酶抑制率的總和(總抑制率)為100%,樣品抑制率在總抑制率中所占比例即為其比抑制率,該指標(biāo)可以表征美白成分活性的相對強(qiáng)弱。以此作百分比堆積柱形圖(圖1)。圖1顯示,分別采用熊果苷和曲酸作為參比物,同種美白成分的比抑制率是基本一致的,更能說明酪氨酸酶法采用熊果苷作為標(biāo)準(zhǔn)對照品是可行的。1.3.2nm法測定ca按試驗(yàn)設(shè)計(jì)表2要求,各管分別加入pH6.8、0.05mol/L的緩沖液PBS、150U/mL酶溶液、250μg/mL熊果苷溶液和海泥提取液(制備方法同1.2.2)。于30℃水浴中反應(yīng)10min后,加入0.3%的L-酪氨酸溶液,再于30℃水浴中反應(yīng)10min,測490nm處的吸光度值A(chǔ)。每份樣品設(shè)置雙管同時(shí)檢測,取平均值,要求雙管值差小于0.5%。1.3.3酶抑制率測定樣品對酪氨酸酶活性的抑制強(qiáng)度以相對于熊果苷的抑制率表示,按以下公式計(jì)算:抑制率=A1?ASA1?AC×100%=A1-ASA1-AC×100%式中:A1、AC和AS分別為陽性對照、標(biāo)準(zhǔn)對照和樣品的吸光度值,抑制率高表明其對酶活性抑制強(qiáng)度高。1.4美白功效因子的篩選分別選取溫度、pH和反應(yīng)時(shí)間作為海泥提取液抗氧化性能和美白功效的影響因子進(jìn)行考察,通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了各因子的3個水平,設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)(表3和表4)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel及SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果2.1在海泥提取物中的抗逆性評價(jià)2.1.1吸光度的測定取不同量的Trolox進(jìn)行顯色試驗(yàn),于480nm處測定反應(yīng)體系的吸光度值(圖2)?；貧w方程為y=0.0122x+0.0837,相關(guān)系數(shù)R2=0.9991,其中y為吸光度值A(chǔ),x為Trolox的濃度。由圖2可知,隨濃度增大,還原物質(zhì)Trolox的抗氧化性能增強(qiáng),且吸光度值與Trolox濃度間具有良好的線性關(guān)系。2.1.2抗氧化性能的比較四次平行樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,常溫下,在同樣的反應(yīng)體系中,20%(體積分?jǐn)?shù))的海泥提取液的抗氧化性能與3.68±0.25μmol/L的Trolox溶液相當(dāng)。2.2酪氨酸酶的抑制率常溫下,以熊果苷作標(biāo)準(zhǔn)對照測得海泥提取液對酪氨酸酶的抑制率為27.97%±0.69%(表6),說明海泥提取液具有一定的美白功效。2.3樣品含量和提取溫度對抗氧化功效的影響為了提高海泥水溶相的功效活性,必須對海泥所含的有效活性成分進(jìn)行富集濃縮,因此,研究了溫度、濃度和時(shí)間對海泥功效的影響,作為設(shè)計(jì)高效、安全且合理的有效成分的提取濃縮工藝的參考依據(jù)。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7和表8。續(xù)表對表7數(shù)據(jù)進(jìn)行SPSS分析:溫度的Sig值小于0.05,而pH、反應(yīng)時(shí)間的Sig值皆大于0.05,說明溫度是抗氧化性能的顯著影響因子,pH、溶解時(shí)間對抗氧化性能影響不顯著;同時(shí)由Duncan多重比較可以得出提取溫度為60℃時(shí),海泥水溶體系的抗氧化性能最強(qiáng)。因此從反應(yīng)的可控性、條件溫和、操作簡便以及生產(chǎn)成本考慮,確定海泥水溶體系抗氧化功效最佳的制備條件為A3B2C1,即溫度60℃、pH5.6、時(shí)間10min,此時(shí)海泥水溶體系的Trolox當(dāng)量為(6.50±0.24)μmol/L。對表8數(shù)據(jù)進(jìn)行SPSS分析:對于美白功效、溫度、pH和時(shí)間的Sig值皆大于0.05,說明3個因素對美白功效的影響都不顯著,所以,在研制海泥美白護(hù)膚功效時(shí),可以根據(jù)試驗(yàn)或生產(chǎn)的既定條件來確定濃縮富集工藝,本實(shí)驗(yàn)選取60℃,pH6.8及20min為美容功效的最佳條件,此時(shí)對酪氨酸酶的抑制率為17.72%±0.67%(相對于熊果苷)。3海泥中抗氧化及美白功效研究浙江秀山島位于舟山本島與岱山島之間,屬于典型的亞熱帶季風(fēng)海洋性氣候,秀山島擁有豐富的灘涂資源,灘涂面積達(dá)133.3hm2,它的形成緣于洋流與河流的交匯以及與秀山獨(dú)特的地理位置。課題組已經(jīng)對秀山海泥的成分進(jìn)行了分析,并與五華山泥浴場海泥(廣東)、鞍山湯崗子理療醫(yī)院地下礦泥(遼寧)、韓國國際泥漿節(jié)舉辦地保寧市泥樣的成分進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)秀山海泥富含豐富的維生素A、維生素E、維生素C和無機(jī)礦物元素鈣、鐵、鋅、硒、鎂、鍶、鍺,蛋白酶和氨基酸含量適中,其中維生素C、鎂、鍶和鍺含量最高,該成分特點(diǎn)正是海泥提取液具有抗氧化性能和美白功效的基礎(chǔ)。目前,廣東泥、遼寧泥和韓國泥已開發(fā)成美容泥活保健泥,而秀山海泥成分的綜合指標(biāo)優(yōu)于其他泥,提示它具有更高的開發(fā)與應(yīng)用價(jià)值。本研究表明,秀山海泥的水溶體系具有較強(qiáng)的抗氧化性能和一定的美白功效,但比標(biāo)準(zhǔn)對照品的功效低,這是因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)對照品為純物質(zhì),且配制濃度較高,而海泥提取液未進(jìn)一步濃縮富集。如果考慮美容護(hù)膚或泥療過程實(shí)際作用的比表面積,其功效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過試驗(yàn)數(shù)據(jù)的意義。傳統(tǒng)的皮膚美白劑,往往采用合成化學(xué)物質(zhì),如過氧化氫、氯化氨基汞以及各種酚類衍生物,它們能使黑色素組織迅速瓦