蛋白激酶m抑制劑對(duì)可卡因誘導(dǎo)的復(fù)燃行為的影響

藥物中毒是一種慢性的高復(fù)發(fā)性腦疾病，其特點(diǎn)是強(qiáng)迫服用藥物并將其吸收。反復(fù)使用成癮藥物之后,可以在成癮藥物產(chǎn)生的獎(jiǎng)賞效應(yīng)和中性用藥環(huán)境之間產(chǎn)生一種強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)性記憶,并最終導(dǎo)致強(qiáng)迫性用藥和覓藥的持續(xù)存在。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)都表明,成癮形成過(guò)程中的關(guān)聯(lián)性記憶對(duì)于成癮性行為的發(fā)展和保持都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,可能是戒斷后心理渴求長(zhǎng)期存在的基礎(chǔ)。研究成癮性記憶的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制有助于理解戒斷后復(fù)吸的發(fā)生以及促進(jìn)藥物成癮的治療。鞏固下來(lái)的記憶如果再次暴露于中性刺激而沒(méi)有相應(yīng)藥物強(qiáng)化,記憶又會(huì)處于一個(gè)不穩(wěn)定的階段,易于被外界因素干預(yù),這個(gè)階段稱(chēng)為再鞏固。大量研究表明,在記憶的再鞏固階段進(jìn)行干預(yù),可以有效破壞成癮性記憶,降低心理渴求和復(fù)吸行為。但由于使用的干預(yù)方式及工具藥物的毒性限制,這些研究要應(yīng)用到臨床上還存在諸多困難。消退訓(xùn)練是將成癮者反復(fù)暴露于中性刺激而沒(méi)有藥物強(qiáng)化,從而在中性刺激與缺少藥物強(qiáng)化之間建立起一種新的關(guān)聯(lián)性記憶。這種干預(yù)方式只能暫時(shí)性的降低由中性刺激誘導(dǎo)的心理渴求所導(dǎo)致的復(fù)吸,對(duì)原有的成癮性記憶并不能夠抹除。近來(lái),Monfils和Schiller分別在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在喚起之后的再鞏固時(shí)間窗內(nèi)進(jìn)行消退訓(xùn)練,通過(guò)干擾記憶的再鞏固過(guò)程改寫(xiě)原有的記憶印記可以永久性抹除對(duì)條件性線(xiàn)索的恐懼反應(yīng)。這種非藥理學(xué)干預(yù)手段稱(chēng)為“喚起-消退”訓(xùn)練模式。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn),在成癮大鼠和海洛因吸食者中,喚起-消退訓(xùn)練也可以有效降低渴求,預(yù)防復(fù)吸。但其潛在的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制目前還不清楚。蛋白激酶PKMζ是蛋白激酶C的一種亞型,它缺少N-末端的調(diào)節(jié)功能區(qū),具有持續(xù)性激活的特性。PKMζ分布于多個(gè)腦區(qū),包括島葉皮質(zhì)、海馬和杏仁核等,通過(guò)增加突觸后AMPA受體的數(shù)量來(lái)增強(qiáng)興奮性突觸傳遞。大量研究證實(shí)PKMζ是一種維持長(zhǎng)期記憶的分子,在空間記憶、條件性味覺(jué)厭惡記憶和恐懼記憶的維持中發(fā)揮重要作用。此外,PKMζ還參與消退記憶的維持。研究發(fā)現(xiàn),下邊緣皮質(zhì)IL內(nèi)PKMζ在維持嗎啡成癮記憶和嗎啡戒斷厭惡記憶的消退過(guò)程中均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。我們前期研究也發(fā)現(xiàn),喚起-消退訓(xùn)練可增高IL-mPFC腦區(qū)的PKMζ蛋白表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中我們采用大鼠SA模型,以下邊緣皮質(zhì)IL-mPFC為目標(biāo)腦區(qū),PKMζ抑制劑ZIP作為工具藥,研究喚起-消退訓(xùn)練在藥物成癮治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值,并進(jìn)一步探討其相關(guān)的分子機(jī)制。1材料和方法1.1動(dòng)物分組、給藥及數(shù)學(xué)模型Sprague-Dawley(SD)大鼠,♂,購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證編號(hào):SCXK(京)2006-2008,體重240-260g。動(dòng)物房恒溫、恒濕(溫度23℃±s2℃,濕度50%±s5%),采用12h晝夜節(jié)律控制(8:00-20:00)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,動(dòng)物在動(dòng)物房適應(yīng)5-7d,自由飲水,進(jìn)食。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí),大鼠重300-320g。大鼠接受的所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué),遵循國(guó)家和北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物使用和保護(hù)委員會(huì)頒布的條例。大鼠自我給藥訓(xùn)練箱系寧波Anilab,箱底部上方9cm有兩個(gè)鼻觸裝置(nose-poke)。動(dòng)物觸碰有效鼻觸(activenose-poke)裝置會(huì)引起靜脈給藥并伴隨5s的燈光-聲音條件線(xiàn)索,同時(shí)動(dòng)物觸碰有效鼻觸的次數(shù)會(huì)被電腦同步記錄下來(lái),觸碰無(wú)效鼻觸(inactivenose-poke)的次數(shù)也會(huì)被記錄。動(dòng)物顱骨上固定的自我給藥套管通過(guò)橡膠管與給藥泵相連。軟管外有金屬?gòu)椈杀Ｗo(hù),頂端與旋轉(zhuǎn)軸承相連,以確保動(dòng)物在自我給藥訓(xùn)練箱中的正?；顒?dòng)不受影響。1.2靜脈和對(duì)照藥給藥鹽酸可卡因,購(gòu)自青海制藥廠?？煽ㄒ蛉苡谏睇}水,濃度為5mg·ml-1,每只動(dòng)物每次觸碰有效鼻觸按照0.75mg·kg-1靜脈給予可卡因。PKMζ抑制劑ZIP(貨號(hào):63361,ANASPEC公司,美國(guó))以及對(duì)照藥sZIP(貨號(hào):63695,ANASPEC公司,美國(guó))溶于0.1MPBS,濃度分別為30nmol·ul-1。核團(tuán)微注射給藥時(shí),將與微量注射器相連的針頭插入頭上埋好的管內(nèi),固定。以0.5ul·min-1的速度,推藥1min,并停留1min。將其從大鼠頭上取下,并蓋好套管的帽。1.3目標(biāo)腦區(qū)和單籠飼養(yǎng)大鼠大鼠經(jīng)50%戊巴比妥鈉(腹腔給藥)麻醉后,仰臥位將靜脈插管置于右側(cè)頸靜脈,插管尖端位于右心房開(kāi)口處。靜脈插管固定后經(jīng)皮下穿過(guò)耳后置于顱骨上方,與靜脈自我給藥套管相連。靜脈插管完成后將大鼠置于腦立體定位儀上(俯臥位),用耳棒在水平方向固定好大鼠。將大鼠頭頂顱骨結(jié)締組織刮干凈,并用止血彎夾暴露顱骨。用電鉆鉆3個(gè)孔,擰緊螺絲。記錄前囟點(diǎn)的數(shù)值后,計(jì)算目標(biāo)腦區(qū)坐標(biāo),移動(dòng)套管臂將套管埋入目標(biāo)腦區(qū)上方1mm處。IL-mPFC的坐標(biāo)參考本實(shí)驗(yàn)室之前的研究:AP,+2.9mm;ML,±1.0mm;DV,-4.8mm(見(jiàn)圖1)。套管偏離中心線(xiàn)角度調(diào)整為6°以避開(kāi)側(cè)腦室。自我給藥套管和核團(tuán)給藥套管經(jīng)不銹鋼螺絲和牙科水泥均固定于顱骨上,待水泥干燥后即可將大鼠取下。將大鼠單籠飼養(yǎng),術(shù)后大鼠體重恢復(fù)至手術(shù)前即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。并每天注射青霉素以防止靜脈給藥套管堵塞或發(fā)生感染。1.4sa行為實(shí)驗(yàn)1.4.1動(dòng)物單次給藥后fr1大鼠進(jìn)行10d的可卡因(每次觸碰有效鼻觸給藥量為0.75mg·kg-1)自身給藥訓(xùn)練,訓(xùn)練在大鼠的夜間周期進(jìn)行,每天3h,每小時(shí)之間休息5min。訓(xùn)練采用FR1強(qiáng)化程序,每次給藥之間有40s的不應(yīng)期。每個(gè)訓(xùn)練期以籠燈開(kāi)啟為信號(hào),動(dòng)物觸碰有效鼻觸后籠燈關(guān)閉,不應(yīng)期結(jié)束后籠燈再次開(kāi)啟。為防止動(dòng)物給藥過(guò)量發(fā)生死亡,每小時(shí)可卡因給藥次數(shù)限制在20次,即20次之后電腦只同步記錄有效鼻觸次數(shù)并不靜脈給藥。訓(xùn)練結(jié)束后,根據(jù)訓(xùn)練期間的給藥次數(shù)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行分組,每組動(dòng)物給藥次數(shù)均值之間沒(méi)有差異。1.4.2喚醒實(shí)驗(yàn)方法同訓(xùn)練過(guò)程,但是觸碰有效鼻觸不給予可卡因,暴露時(shí)間為15min。1.4.3身給藥之外的同訓(xùn)練過(guò)程消退訓(xùn)練過(guò)程中,除了動(dòng)物觸碰有效鼻觸時(shí)不引起可卡因自身給藥之外,其他同訓(xùn)練過(guò)程?？煽ㄒ騽?dòng)物進(jìn)行消退訓(xùn)練直至觸碰有效鼻觸的次數(shù)降低到基線(xiàn)值的20%以下(基線(xiàn)值為自身給藥訓(xùn)練最后3d的均值),且維持至少2d。1.4.4觸拉有效鼻觸的測(cè)試測(cè)試前給予點(diǎn)燃劑量的可卡因腹腔注射(5mg·kg-1,i.p.),5min后將大鼠放入自我給藥箱中測(cè)試。除了觸碰有效鼻觸不引起可卡因給藥外,測(cè)試時(shí)的條件與訓(xùn)練期間相同,觸碰有效鼻觸會(huì)引起與訓(xùn)練期間相同的燈光-聲音條件線(xiàn)索。測(cè)試過(guò)程中籠燈開(kāi)啟。測(cè)試時(shí)間為1h。由電腦同步記錄測(cè)試期間動(dòng)物觸碰有效鼻觸或無(wú)效鼻觸的次數(shù)。1.5動(dòng)物的基本情況首先,對(duì)大鼠進(jìn)行10d的可卡因自身給藥訓(xùn)練。形成穩(wěn)定的可卡因自身給藥行為的大鼠隨機(jī)分為沒(méi)有組間差異的兩組:(1)消退組:每天進(jìn)行195min消退訓(xùn)練;(2)喚起+消退組:先將大鼠放入訓(xùn)練箱中15min中(即短暫的記憶喚起),然后取出放回飼養(yǎng)籠中10min,然后再將其放到訓(xùn)練箱中進(jìn)行180min消退訓(xùn)練。所有大鼠進(jìn)行消退訓(xùn)練,直至兩組動(dòng)物的覓藥行為達(dá)到消退標(biāo)準(zhǔn)。24h后將兩組動(dòng)物給予不同的處理,即分為以下4組:(1)消退+ZIP組;(2)消退+sZIP組;(3)喚起-消退+ZIP組;(4)喚起-消退+sZIP組。再分別IL-mPFC內(nèi)微注射ZIP或sZIP。48h后腹腔注射可卡因進(jìn)行復(fù)燃測(cè)試(見(jiàn)圖1)。1.6統(tǒng)計(jì)方法結(jié)果以平均值±SEM表示,數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的雙因素方差檢驗(yàn)分析。P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1il-mpf腦區(qū)域定位嵌入方案2.2復(fù)燃測(cè)試行為對(duì)消退訓(xùn)練過(guò)程以及復(fù)燃測(cè)試數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的雙因素方差檢驗(yàn)分析。對(duì)自身給藥消退訓(xùn)練過(guò)程進(jìn)行分析,以是否喚起(喚起-消退組以及消退組)作為組間因素;以消退天數(shù)(1-12d)作為組內(nèi)因素。分析結(jié)果顯示,喚起與否(F(1,25)=10.98,P=0.003)以及消退天數(shù)(F(11,275)=72.36,P<0.01)對(duì)有效鼻觸次數(shù)有顯著影響,而二者存在顯著交互作用(F(11,275)=4.01,P<0.01)。對(duì)復(fù)燃測(cè)試行為學(xué)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以是否經(jīng)歷過(guò)喚起(喚起-消退組以及直接消退組)和ZIP注射(ZIP和sZIP)作為組間因素;以測(cè)試時(shí)間點(diǎn)(最后一次消退訓(xùn)練,復(fù)燃測(cè)試)作為組內(nèi)因素。結(jié)果顯示喚起與否(F(1,25)=21.24,P<0.01),是否ZIP注射(F(1,25)=9.38,P<0.01)以及測(cè)試時(shí)間點(diǎn)(F(1,25)=67.12,P<0.01)對(duì)有效鼻觸次數(shù)有顯著影響,且存在喚起×測(cè)試時(shí)間點(diǎn)(F(1,25)=21.47,P<0.01)以及ZIP注射×測(cè)試時(shí)間點(diǎn)(F(1,25)=8.21,P<0.01)的顯著交互作用。這些結(jié)果表明,在再鞏固的時(shí)間窗內(nèi)進(jìn)行自身給藥消退訓(xùn)練可以使覓藥行為的消退速率明顯加快,降低低劑量可卡因引起的覓藥行為的復(fù)燃。IL-mPFC給予PKMζ抑制劑ZIP可以增強(qiáng)。3抗惡性藥物實(shí)驗(yàn)本課題研究了下邊緣皮質(zhì)PKMζ在喚起-消退訓(xùn)練降低可卡因誘導(dǎo)的覓藥行為復(fù)燃中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)與直接消退訓(xùn)練組相比,喚起-消退訓(xùn)練的消退速率明顯加快,并且能夠顯著降低消退訓(xùn)練后低劑量藥物引起的覓藥行為的復(fù)燃;(2)藥物點(diǎn)燃之前在下邊緣皮質(zhì)IL微注射PKMζ抑制劑ZIP,可以增強(qiáng)直接消退訓(xùn)練組以及喚起-消退訓(xùn)練組可卡因誘導(dǎo)的復(fù)燃行為。自身給藥模型是成癮研究中最常用的模型之一,動(dòng)物通過(guò)主動(dòng)的操作性行為獲得藥物強(qiáng)化,能夠很好地模擬人類(lèi)藥物成癮的過(guò)程。大量研究表明,破壞藥物的再鞏固過(guò)程和增強(qiáng)消退記憶都能夠降低動(dòng)物的藥物渴求和覓藥行為,但由于各自的局限性均不太適用于臨床。喚起-消退訓(xùn)練是在再鞏固的時(shí)間窗內(nèi)進(jìn)行消退訓(xùn)練,之前關(guān)于恐懼記憶的研究表明這種非藥理學(xué)干預(yù)手段可以有效的降低動(dòng)物和人的恐懼反應(yīng)。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn),喚起-消退訓(xùn)練能夠顯著降低藥物誘導(dǎo)的可卡因以及海洛因覓藥行為。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn),與直接消退訓(xùn)練組相比,喚起-消退訓(xùn)練組大鼠的消退速率明顯加快;與消退+sZIP組相比,低劑量可卡因在喚起-消退+sZIP組大鼠引起的藥物渴求行為明顯降低,表現(xiàn)為有效鼻觸次數(shù)下降,但并沒(méi)有完全阻止,這與本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果一致。這種喚起-消退模式對(duì)覓藥行為的影響并不是由于人為操作因素(如將大鼠取出或者放入訓(xùn)練箱)影響記憶的再鞏固,因?yàn)槲覀冎暗难芯勘砻?喚起和消退之間的時(shí)間間隔為6h時(shí),雖然動(dòng)物也會(huì)經(jīng)歷同樣的操作,但對(duì)可卡因覓藥行為的復(fù)燃卻沒(méi)有影響。同時(shí)前期研究發(fā)現(xiàn),喚起-消退之間的時(shí)間間隔為10min或者1h,而非6h,才會(huì)產(chǎn)生抑制覓藥行為復(fù)燃的作用。這表明喚起-消退模式也不是簡(jiǎn)單的間隔消退訓(xùn)練。操作性訓(xùn)練是一個(gè)包含操作性行為應(yīng)答和條件性反應(yīng)的復(fù)雜過(guò)程,可能通過(guò)主動(dòng)的操作性行為獲得的藥物強(qiáng)化要高一些,喚起-消退訓(xùn)練只能夠降低大鼠的覓藥行為并不能完全阻止?？赡苁怯捎诓僮餍杂洃洷劝透β宸蛐纬傻臈l件性記憶要牢固一些,其再鞏固過(guò)程不易被破壞。喚起-消退訓(xùn)練是在再鞏固的時(shí)間窗內(nèi)進(jìn)行消退訓(xùn)練,這個(gè)過(guò)程中發(fā)生了再鞏固過(guò)程的破壞還是消退記憶鞏固過(guò)程的增強(qiáng),又或是二者兼有?？煽ㄒ駽PP的研究表明,喚起-消退訓(xùn)練能夠完全阻止大鼠消退訓(xùn)練后低劑量藥物引起的CPP復(fù)燃以及自發(fā)恢復(fù),表明原有的記憶印記可能在再鞏固過(guò)程中被破壞了或者被重新改寫(xiě)了。關(guān)于恐懼記憶的一些研究則表明,增強(qiáng)消退記憶的鞏固過(guò)程同樣可以抑制恐懼記憶的再現(xiàn)和自發(fā)恢復(fù)。近來(lái),有研究表明,PKMζ參與了長(zhǎng)期濫用藥物導(dǎo)致的中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)神經(jīng)可塑性改變,基底外側(cè)杏仁核BLA內(nèi)的PKMζ在獎(jiǎng)賞記憶維持中有作用而下邊緣皮質(zhì)IL內(nèi)的PKMζ參與了消退記憶的維持。同時(shí)喚起-消退訓(xùn)練可以使BLA內(nèi)PKMζ表達(dá)量下降而IL內(nèi)PKMζ表達(dá)量上升,喚起-消退訓(xùn)練可能同時(shí)涉及兩個(gè)記憶過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中,我們以IL為目標(biāo)腦區(qū)來(lái)進(jìn)一步探討潛在的分子機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)與直接消退+sZIP組相比,在藥物點(diǎn)燃之前IL內(nèi)微注射PKMζ抑制劑ZIP,可以增強(qiáng)可卡因誘導(dǎo)的覓藥藥行的復(fù)燃,這進(jìn)一步驗(yàn)證了我們前期的研究發(fā)現(xiàn),即下邊緣皮質(zhì)IL內(nèi)的PKMζ參與了消退記憶的維持,應(yīng)用PKMζ抑制劑可以消除消退記憶對(duì)原來(lái)記憶的抑制作用,使原來(lái)的獎(jiǎng)賞記憶重現(xiàn)。更重要的是,我們還發(fā)現(xiàn),與喚起-消退+sZIP組相比,在藥物點(diǎn)燃之前其IL內(nèi)微注射PKMζ抑制劑ZIP,部分逆轉(zhuǎn)了喚起-消退訓(xùn)練對(duì)于大鼠覓藥行為的降低作用。這表明消退-訓(xùn)練所產(chǎn)生的效應(yīng)部分是通過(guò)IL腦區(qū)的PKMζ所維持的,進(jìn)而支持了喚起-消退訓(xùn)練可能是通過(guò)增強(qiáng)消退記憶的鞏固過(guò)程發(fā)揮作用的假設(shè)。不過(guò),微注射ZIP后,兩組動(dòng)物在點(diǎn)燃測(cè)試中表現(xiàn)出差別,這種差別也可能是由于給予ZIP后的其藥物記憶就已經(jīng)部分恢復(fù),需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。同時(shí),以前的研究表明,ZIP只抑制PKMζ的活性而對(duì)再學(xué)習(xí)沒(méi)有影響,說(shuō)明這種作用并不是由于異體蛋白注射誘發(fā)的局部炎癥反應(yīng)造成的。目前認(rèn)為,PKMζ可能是一種記憶分子,介導(dǎo)了記憶的長(zhǎng)期維持。PKMζ通過(guò)調(diào)節(jié)NSF/AMPA受體的轉(zhuǎn)運(yùn)在晚期LTP當(dāng)中發(fā)揮重要作用,ERK和PKA等激酶