氧化苦參堿對大鼠心肌纖維化的保護作用及對gf--smad信號通路的影響

急性心力衰竭（ami）后的病史發(fā)展導(dǎo)致的心肌重建可能會導(dǎo)致室心擴大、功能障礙和猝死。目前,預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌重塑已成為防治心血管系統(tǒng)疾病的焦點之一。因此,尋找合理有效的防治與逆轉(zhuǎn)心肌重塑的藥物成為世界各國醫(yī)藥研究工作的重大課題。我國獨特的中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下的防病治病體系是前人對疾病防治的系統(tǒng)總結(jié)和精心歸納的結(jié)果,從傳統(tǒng)中藥中尋找防治心肌重塑的藥物對促進中醫(yī)藥現(xiàn)代化和產(chǎn)業(yè)化以及中醫(yī)藥在世界范圍內(nèi)被廣泛認可具有重要的社會意義和經(jīng)濟價值。中藥苦參為豆科植物苦參SophoraflavescensAit.的干燥根,具有清熱燥濕,殺蟲,利尿等作用。氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)是豆科植物苦參的主要有效成分,具有廣泛的藥理作用,本實驗室前期研究結(jié)果證實,OMT對大鼠冠脈結(jié)扎誘發(fā)實驗性心肌纖維化具有顯著的保護作用。本研究采用結(jié)扎冠狀動脈法復(fù)制AMI誘發(fā)大鼠實驗性心肌纖維化模型,進一步探索OMT防治心肌纖維化的可能作用機制。1材料表面1.1實驗動物及儀器雄性SD大鼠,清潔級,9周齡,60只,體重(275±25)g,由貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供,合格證號SCXK(黔)2000-0001。1.2藥物及試劑氧化苦參堿(南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司,批號20080210);卡托普利片(山東華信制藥有限公司,批號H37021491);TrizolReagent(invitrogen,Cat15596-026);RTkit(TaKaRaPrimeScriptTMRTReagentKit,codeDRR037S,LotBK1301);PCRkit[TaKaRaTaqTM,寶生物工程(大連)有限公司]。1.3-20,2.5和tc-126基因檢測HX-300動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司);BS223S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);移液器(1mL,200,20,2.5μL:EppendorfAG,NorthAmericaInc.,USA);Genequantpro80-2114-98紫外分光光度計(AmershamBiosciences);TC-512基因擴增儀(Techne);MiniRunGE-100電泳儀(杭州博日科技有限公司);Imagequant400凝膠成像儀(GEHealthcare)。2方法2.1動物心肌組織病理學(xué)觀察大鼠稱重后用3%水合氯醛腹腔注射麻醉(10mL·kg-1),固定于鼠板,用針形電極插入四肢皮下,觀察記錄標準肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。胸部去毛,消毒,在第4,5肋間距胸骨左緣2mm處剪開皮膚,上下縱向延伸切口約2cm,逐層鈍性分離皮下組織、肌肉至胸壁,將皮膚作荷包縫合備用。將動物呼吸機調(diào)至頻率每分鐘80次、呼吸時程比2∶1、潮氣量16~20mL·kg-1,面罩式供呼吸。于第4,5肋間距胸骨左緣約2mm處打開胸壁,剪斷第4,5肋(或第3,4肋),挑開胸膜,小拉鉤拉開胸壁,暴露心臟。挑開心包膜,輕壓右側(cè)胸壁擠出心臟,用無菌7-0號醫(yī)用縫合線在肺動脈圓錐與左心耳之間距主動脈根部約5mm處結(jié)扎左冠狀動脈前降支,結(jié)扎深度約1~2mm。將心臟迅速放回胸腔,輕柔擠壓胸腔排盡氣體,關(guān)閉胸腔。待大鼠恢復(fù)自主呼吸后,停止人工呼吸。觀察并記錄結(jié)扎后10min大鼠標準肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖,比較結(jié)扎前后肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖,以J點的變化標志結(jié)扎手術(shù)復(fù)制AMI成功。假手術(shù)組大鼠冠脈穿線但未行結(jié)扎手術(shù)。各組大鼠均術(shù)后予青霉素預(yù)防感染,每只14萬U,腹腔注射,每天1次,連續(xù)3d。2.2大鼠領(lǐng)之間穿線時不表達固結(jié)實驗將造模復(fù)制成功的大鼠隨機分為模型組(M)、OMT高劑量組(OMT-H,50mg·kg-1)、OMT中劑量組(OMT-M,25mg·kg-1)、OMT低劑量組(OMT-L,12.5mg·kg-1)、卡托普利組(Cap,50mg·kg-1);另設(shè)假手術(shù)組(Sham),假手術(shù)組大鼠只做冠狀動脈穿線而不結(jié)扎。各組于模型復(fù)制后12h開始灌胃給藥,給藥容積為10mL·kg-1,每日1次,其中假手術(shù)組、模型組的大鼠每日給予相同容積的蒸餾水灌胃,連續(xù)給藥8周。每組保證實驗結(jié)束時有8只動物存活。各組于模型復(fù)制后8周檢測指標并取標本,其中4只用于病理學(xué)分析,另外4只用于PCR擴增。2.3細胞漿及他組織的he染色切片觀察HE染色分析:方法參照文獻,每個標本取心臟橫切面石蠟切片用于HE染色。石蠟切片乙醇梯度脫水后,經(jīng)歷蘇木素染色,0.5%鹽酸乙醇分化,伊紅復(fù)染,中性樹膠固定后觀察,細胞核呈藍色,細胞漿及其他組織呈粉紅色,然后利用圖像分析系統(tǒng)低倍鏡下觀察每張切片,并對HE染色切片進行拍照分析。Masson染色分析:方法參照文獻,每個標本取心臟橫切面石蠟切片用于Masson染色。Weiger氏鐵蘇木素染色,1%鹽酸乙醇分化,麗春紅酸性品紅液復(fù)染,苯胺藍液復(fù)染,中性樹膠封片固定后觀察,膠原纖維呈藍色,胞質(zhì)、肌纖維和紅細胞呈紅色,胞核呈藍色,然后利用圖像分析系統(tǒng)低倍鏡下觀察每張切片,并對Masson染色切片進行拍照分析。2.4左心室組織總rna提取迅速剪碎新鮮組織標本(或液氮保存的組織標本),每100mg組織加入1mLTR-Izol試劑(組織塊體積不要超過TRIzol體積的10%),嚴格按照說明書規(guī)定操作步驟,提取左心室組織總RNA。于紫外分光光度計上,測定樣品260,280nm的A,計算A260/A280及總RNA濃度并記錄。選取A260/A280在1.8~2.0的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄試驗。2.5pcr產(chǎn)物的合成取1μg總RNA行RT-PCR擴增,操作步驟按試劑盒要求進行。所用引物見表1,引物由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計并合成。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,94℃30s;72℃1min,退火溫度按表1設(shè)定,退火時間30s;循環(huán)30次;72℃8min。取6μLPCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖中電泳。EB染色后在紫外燈下,用Quantity-one凝膠成像分析系統(tǒng)分析各條帶的總灰度值,并與其相對應(yīng)的內(nèi)參(Gapdh)的總灰度值相比較,得出灰度比值。2.6統(tǒng)計分析實驗結(jié)果用表示,采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理(One-WayANOVA),2組間比較采用t檢驗。3結(jié)果3.1mash染色顯示心肌纖維病變冠脈結(jié)扎8周后,左心室心梗部位病理組織學(xué)檢查見圖1(HE染色)和圖2(Masson染色)。Sham組:HE染色可見心肌細胞染色均勻,排列規(guī)則,心肌細胞間隙均勻清楚,未見任何明顯病理學(xué)改變。Masson染色可見心肌纖維增生輕微(-~+)。M組:HE染色可見心肌細胞染色不均勻,多數(shù)心肌細胞排列不規(guī)則,細胞間隙變窄,并有斷裂現(xiàn)象,在斷裂心肌附近偶見點狀出血,心肌廣泛壞死,在壞死區(qū)炎性浸潤明顯、纖維結(jié)締組織增生嚴重。Masson染色可見心肌纖維增生程度嚴重。OMT組:HE染色各組均有輕微的病理改變,心肌細胞染色基本均勻,外觀基本正常,排列基本整齊,心肌細胞間隙均勻,偶爾可見心肌細胞間隙變窄和較輕微的肥大,心肌壞死較少見,梗死區(qū)炎性浸潤輕微,纖維結(jié)締組織增生不明顯。Masson染色可見各組心肌纖維增生程度較輕。3.2各組大鼠非梗死區(qū)心肌組織nd4表達的比較冠脈結(jié)扎8周后,與Sham組比較,M組大鼠非梗死區(qū)心肌中TGF-β1,TβR1,Smad2,Smad3,Smad4(P<0.01)的表達明顯增加,Smad7表達明顯減少。連續(xù)給予OMT8周,與M組比較,OMT中、高劑量組顯著抑制大鼠非梗死區(qū)心肌中TGF-β1,TβR1,Smad2,Smad3,Smad4的表達,提高Smad7的表達增加;OMT低劑量組顯著抑制大鼠非梗死區(qū)心肌中TβR1的表達,提高Smad7的表達增加,見表2和圖3。4大鼠非梗死區(qū)心肌組織病理學(xué)變化心肌重塑(cardiacremodeling)是指在各種因素(心肌缺血、梗塞、血流動力負荷、炎癥等)直接或間接作用下所造成的心肌結(jié)構(gòu)、功能的變化,心肌細胞適應(yīng)性肥大、壞死、凋亡,心肌細胞外基質(zhì)膠原沉積和纖維化,心肌僵硬度增加等病理變化。大鼠冠脈結(jié)扎8周后,模型組大鼠左心室標本可見心肌細胞染色不均勻,多數(shù)心肌細胞排列不規(guī)則,細胞間隙變寬,并有斷裂現(xiàn)象,心肌廣泛壞死,在壞死區(qū)炎性浸潤明顯、纖維結(jié)締組織增生嚴重,提示冠脈結(jié)扎8周已發(fā)生嚴重心肌梗死并出現(xiàn)典型的心肌重塑的病理表現(xiàn)。與模型組比較,OMT各組均有輕微的病理改變。顯微鏡下可見心肌細胞染色基本均勻,外觀基本正常,排列基本整齊,心肌細胞間隙均勻,心肌壞死較少見,梗死區(qū)炎性浸潤輕微,纖維結(jié)締組織增生程度較輕。結(jié)果提示連續(xù)給予OMT8周,具有抑制心肌纖維化作用?；罨霓D(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowthfactorβ,TGF-β)是與細胞外基質(zhì)積聚關(guān)系最為密切的細胞因子,是公認的器官纖維化的治療靶標,在調(diào)節(jié)CFs的表型和基因表達,促進膠原蛋白和纖維連接蛋白的合成,誘導(dǎo)蛋白酶抑制物從而導(dǎo)致細胞外基質(zhì)沉積中發(fā)揮重要的作用。TGF-β是心肌細胞或者心臟非心肌細胞自分泌或旁分泌的生長因子,在梗死心肌組織中顯著增加,而且被快速激活,在肥厚心肌穩(wěn)定狀態(tài)向CHF狀態(tài)轉(zhuǎn)化時也顯著增加。TGF-β通過細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用,而Smads蛋白家族是TGF-β信號系統(tǒng)中TGF-β的重要作用底物,故TGF-β-Smads信號通路對CFs激活/細胞外基質(zhì)(ECM)病變作用引起研究人員極大關(guān)注。本研究實驗結(jié)果證實,M組大鼠非梗死區(qū)心肌中TGF-β1,TβR1,Smad2,Smad3,Smad4(P<0.01)的表達明顯增加,Smad7表達明顯減少,提示冠脈結(jié)扎8周后,TGF-β-S