一株多粘類芽孢桿菌對(duì)番茄幼苗生長的促生效果

多酚類半體生長菌是一種廣泛屬于主體的根際促生菌，對(duì)由真菌、細(xì)菌和線蟲引起的植物疾病有預(yù)防作用。Timmusk等研究發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌處理后,可在植物根際大量定殖,有效拮抗棕櫚疫霉Phytophthorapalmivora和瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum。Khan等報(bào)道P.polymyxaGBR-1能抑制根結(jié)線蟲卵孵化和毒殺幼蟲,可有效減少番茄根結(jié)形成。Mageshwaran等報(bào)道P.polymyxaHKA-15的代謝產(chǎn)物可以有效拮抗植物病原細(xì)菌Xanthomonascampestrispv.phaseoli。Ryu等報(bào)道在田間試驗(yàn)中芝麻種子經(jīng)P.polymyxaE681包衣處理后,可以顯著控制猝倒病,解決了芝麻連作的難題。多粘類芽孢桿菌可產(chǎn)生多種抗生素、多粘菌素及各種水解酶等拮抗物質(zhì),這些拮抗物質(zhì)是多粘類芽孢桿菌發(fā)揮生物防治作用的重要機(jī)制之一。除此之外,多粘類芽孢桿菌能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生水楊酸,從而引發(fā)誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗性(ISR)。多粘類芽孢桿菌還可以合成植物生長素、細(xì)胞分裂素、胞外多糖,增強(qiáng)土壤通透性,具有溶磷、固氮的活性[11~13]。多粘類芽孢桿菌可定殖于植物的根際及土壤,為生防功能的表現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。本研究從浙江天目山柳杉中分離獲得了1株細(xì)菌CF05,通過菌株形態(tài)特征、16SrDNA序列分析及其生理生化反應(yīng),確定菌株CF05為1株多粘類芽孢桿菌,平板測定表現(xiàn)出對(duì)植物病原真菌和細(xì)菌明顯的拮抗特征。本研究從離體拮抗、種子萌發(fā)、防病、促生、根際定殖穩(wěn)定性等方面,初步測定了該細(xì)菌的促生及生防效果,探討了其作為生防促生細(xì)菌的應(yīng)用潛力。1材料和方法1.1枯病菌種cr種植多粘類芽孢桿菌P.polymyxaCF05,P.polymyxaATCC842T,枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis168病原真菌水稻稻瘟病菌Magnaportheoryzae,水稻紋枯病菌Rhizoctoniasolani,小麥紋枯病菌Rhizoctoniacerealis,番茄灰霉菌Botrytiscinerea,番茄早疫病菌Alternariasolani,棉花枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum,瓜果腐霉P.aphanidermatum,西瓜枯萎病菌F.oxysporumf.sp.niveum,百合根腐病菌F.oxysporumf.sp.lilii,病原細(xì)菌水稻白葉枯菌X.campestrispv.oryzae,白菜軟腐病菌Dickeyadadantii,葡萄根癌菌Agrobacteriumvitis,均為本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2細(xì)菌形態(tài)特征牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(nutritionagar,NA)培養(yǎng)細(xì)菌16h,戊二醛固定后,掃描電子顯微鏡(HitachiTM-1000,KYKY-EM3200)觀察細(xì)菌形態(tài)特征。1.31細(xì)菌16srdna序列及測序采用CTAB法提取菌株CF05的基因組DNA。通用引物(8F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1513R:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌的16SrDNA序列。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳純化,進(jìn)行測序。利用DNAMAN和MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。1.4生理生化反應(yīng)生理生化特征鑒定參照文獻(xiàn)和方法進(jìn)行。1.5抗病菌抗氧化活性測定馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potatodextroseagar,PDA)平板中接入直徑約6mm的新鮮病原真菌菌絲餅,距菌絲餅約2.5cm處接種待測菌株,以枯草芽孢桿菌B.subtilis168菌株為對(duì)照,25℃培養(yǎng),測量拮抗圈直徑。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。采用Stonier雙層法測定其拮抗病原細(xì)菌效果。菌株CF05作為下層產(chǎn)素層,上層為病原細(xì)菌,以B.subtilis168為對(duì)照。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。1.6從cf06菌體制備cf2005菌懸液菌株CF05發(fā)酵液和菌懸液的制備:挑取菌株CF05單菌落接種于PDB(PDA中不加瓊脂)培養(yǎng)基中,28℃、160r/min培養(yǎng)24h,取100μL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于100mL的PDB培養(yǎng)基中,28℃、160r/min培養(yǎng)80h。所得培養(yǎng)液10000r/min離心10min。離心所得上清液用細(xì)菌過濾器(Millipore,0.22μm)過濾后即為發(fā)酵液;離心所得菌體用無菌水清洗5次,然后再用無菌水重懸并調(diào)濃度至107CFU/mL,即為菌株CF05菌懸液。番茄種子(浙粉202,浙江浙農(nóng)種業(yè)有限公司)用75%乙醇表面消毒30s,無菌水漂洗3次。30℃溫水浸種4~5h,種子于28℃催芽。種子發(fā)芽后,播種于穴盤(32孔,6cm×4.5cm)中,每穴2~3粒種子,覆蓋1cm厚基質(zhì)(蛭石:珍珠巖:泥炭:土壤體積比為1:1:1:1)。待幼苗長出2片以上葉子后,開始澆灌發(fā)酵液和菌懸液,每次每穴澆灌10mL。發(fā)酵液處理分為4個(gè)濃度梯度,將原發(fā)酵液分別稀釋1、10、20、50倍,對(duì)照為無菌水;菌懸液處理分為3個(gè)濃度梯度,分別為107、106和105CFU/mL,對(duì)照為無菌水。每個(gè)濃度5個(gè)重復(fù),生長3周后測量幼苗鮮重及干重。1.7抗性菌株cf2005的催芽、出苗平板篩選菌株CF05抗利福平的突變體,獲得能在含20μg/mL的利福平培養(yǎng)基上生長的抗性突變體。制備抗性菌株CF05菌懸液(方法同原始菌株CF05),菌懸液濃度分別為108、107、106和105CFU/mL。經(jīng)表面消毒的番茄種子浸入抗性菌株CF05不同濃度的菌懸液中,25℃、80r/min振蕩培養(yǎng)2~3h后,將種子置于28℃催芽,期間噴灑相應(yīng)處理濃度的抗性菌株CF05菌懸液保持種子濕潤。2~3d種子發(fā)芽,將其種入穴盤(培養(yǎng)基質(zhì)配方同1.6并經(jīng)滅菌處理)中。待番茄出苗后2、7、12、17、22、27d取土樣(整個(gè)根系以及緊密黏著的土壤),每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。將1g土樣浸泡在9mL的磷酸緩沖液(50mmol/L)中,置于轉(zhuǎn)速為150r/min搖床振蕩30min。梯度稀釋所得含菌緩沖液,涂布于含20μg/mL利福平的LB培養(yǎng)基上,每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)。平板于28℃靜置培養(yǎng)2d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。根際定殖細(xì)菌量以logCFU/g根計(jì)數(shù)。1.8種子萌發(fā)率測定制備濃度為108CFU/mL的菌株CF05、168菌液,多菌靈4000倍液(四川國光農(nóng)化股份有限公司,50%可濕性粉劑)。滅菌培養(yǎng)皿中分別放入10mL的菌株CF05、168菌液及多菌靈溶液,以無菌水為對(duì)照,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。每皿放入1g經(jīng)表面消毒的番茄種子,處理12h。種子置于28℃催芽,計(jì)算萌發(fā)率。PDB培養(yǎng)基培養(yǎng)番茄猝倒病病原菌P.aphanidermatum,制備菌絲懸浮液。菌絲懸浮液與無菌基質(zhì)按照1:10(V/W)均勻混合,制成感病基質(zhì),分裝入營養(yǎng)缽(26cm×21cm)中。將上述所得萌芽種子種入營養(yǎng)缽中,每處理3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)25粒萌芽種子,播種25d后計(jì)算發(fā)病率。1.9數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用DPSv7.05數(shù)據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,顯著性水平采用Duncan’s新復(fù)極差法分析。2結(jié)果與分析2.1菌株的生理生化特性菌株CF05在NA培養(yǎng)基上形成乳白色菌落,半透明,菌落光滑,挑起有黏性。掃描電鏡顯示,菌體為棒狀,單個(gè),0.7μm×4.2μm(圖1A),產(chǎn)生近球形芽孢(圖1B)。PCR擴(kuò)增獲得菌株CF0516SrDNA部分序列(JX997944)。DNAMAN和MEGA5.1軟件系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,該菌株的遺傳進(jìn)化與多粘類芽孢桿菌最近,構(gòu)成一個(gè)分支(圖2)。生理生化反應(yīng)特征(表1)顯示,菌株CF05的耐鹽性為2%,在5%含鹽培養(yǎng)基上不能生長。在糖發(fā)酵反應(yīng)中,可以利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、甘露醇、甘油、乳糖、蔗糖等多種碳源。厭氧生長、接觸酶、硝酸還原反應(yīng)、水解淀粉、V-P反應(yīng)、水解酪蛋白反應(yīng)等均為陽性,而檸檬酸鈉利用、琥珀酸鈉利用、H2S產(chǎn)生、氧化酶等反應(yīng)為陰性。菌株CF05與B.subtilis168在耐鹽性、氧化酶等方面的反應(yīng)特點(diǎn)有所不同,與文獻(xiàn)報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān).polymyxaATCC842T的反應(yīng)特點(diǎn)相同。結(jié)合16SrDNA序列分析和生理生化特征,將菌株CF05鑒定為多粘類芽孢桿菌P.polymyxa。2.2對(duì)真菌的誘導(dǎo)誘導(dǎo)菌株CF05對(duì)供試病原真菌、細(xì)菌均具有較好拮抗效果。其中在真菌拮抗中,對(duì)番茄灰霉菌拮抗效果最好,拮抗圈直徑達(dá)到3.13cm,其次是水稻稻瘟病菌,番茄早疫病菌,棉花枯萎病菌,水稻紋枯病菌,小麥紋枯病菌,所有拮抗真菌效果均優(yōu)于B.subtilis168。在細(xì)菌拮抗中,菌株CF05對(duì)水稻白葉枯菌拮抗作用最明顯,拮抗圈直徑為4.51cm,其次是白菜軟腐病菌,拮抗病原細(xì)菌效果也均優(yōu)于B.subtilis168(表2)。2.3發(fā)酵液、干重、菌懸液的制備溫室條件下測定了菌株CF05不同濃度發(fā)酵液(圖3A)和菌懸液(圖3B)的促生效果。發(fā)酵液對(duì)番茄幼苗促生效果明顯,鮮重和干重均有較大增量。發(fā)酵液稀釋倍數(shù)為1、10、20、50倍時(shí),與對(duì)照相比鮮重分別提高為272.0%、199.3%、142.7%、70.6%;干重分別提高為266.7%、127.8%、88.9%、33.3%。菌懸液同樣具有促生作用,細(xì)菌濃度為107、106、105CFU/mL時(shí),與對(duì)照相比鮮重分別提高為121.7%、83.9%、13.3%;與對(duì)照相比干重分別提高為122.2%、66.7%、27.8%。發(fā)酵液的促生效果優(yōu)于菌懸液。2.4olcu/g根濃度為108、107、106、105CFU/mL的菌懸液處理,出苗2d后番茄根際細(xì)菌濃度分別為5.5、5.1、4.2、3.8logCFU/g根,4個(gè)處理之間根際細(xì)菌濃度差異顯著;7d后濃度為108、107CFU/mL菌懸液處理的菌量增加,濃度為106、105CFU/mL菌懸液處理的菌量減少,濃度分別為5.8、5.5、4.2、3.6logCFU/g根;此后,根際菌量持續(xù)下降,22d后趨于穩(wěn)定,27d后終濃度為3.8、3.6、3.1、3.1logCFU/g根(圖4)。2.5對(duì)于番茄個(gè)人基因型的影響菌株CF05處理番茄種子發(fā)芽率為87.25%,B.subtilis168處理為81.46%,2個(gè)處理與對(duì)照差異不顯著(P>0.05),多菌靈處理后種子萌發(fā)率為74.45%,與對(duì)照差異顯著(P<0.05)。菌株CF05處理后種子萌發(fā)率最高,與對(duì)照組相比效果提高11.7%,與B.subtilis168處理相比提高7.6%,與多菌靈處理相比顯著提高17.2%,說明菌株CF05對(duì)種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用。菌株CF05處理番茄猝倒病發(fā)病率為17.28%,B.subtilis168處理為21.78%,多菌靈處理為13.85%,對(duì)照為38.16%,3個(gè)處理與對(duì)照相比,發(fā)病率均差異顯著(P<0.05)。其中菌株CF05處理防效比對(duì)照防效高38.6%,比B.subtilis168處理防效高20.7%,略低于多菌靈處理,但差異不顯著(P>0.05)。3p.poluscyfb基因回復(fù)突變?cè)囼?yàn),主要發(fā)生在植物致病和植物微生物本研究經(jīng)形態(tài)特征、16SrDNA序列、生理生化反應(yīng)特性分析,鑒定1株從柳杉上分離獲得對(duì)多種病原真菌、病原細(xì)菌具有拮抗效果的菌株CF05,鑒定為多粘類芽孢桿菌P.polymyxa。該菌株對(duì)番茄幼苗具有顯著的促生效果,能提高種子萌發(fā)率,穩(wěn)定定殖于番茄根際,對(duì)番茄猝倒病具有明顯的防治效果,表現(xiàn)出良好的應(yīng)用開發(fā)潛力。多粘類芽孢桿菌對(duì)植物病原真菌的拮抗作用已有大量報(bào)道,其作用主要表現(xiàn)在產(chǎn)生真菌細(xì)胞壁水解酶等拮抗物質(zhì)。Dijksterhuis等報(bào)道P.polymyxa細(xì)胞直接作用于棉花枯萎病菌,說明持續(xù)抑制真菌生長要有活菌的存在。P.polymyxaCF05對(duì)鞭毛菌門、子囊菌門等真菌都表現(xiàn)拮抗效果,其作用機(jī)制可能與細(xì)菌產(chǎn)生的真菌細(xì)胞壁水解酶相關(guān)。多粘類芽孢桿菌能產(chǎn)生多粘菌素、嗜鐵素等細(xì)菌拮抗物質(zhì)。與本文報(bào)道的P.polymyxaCF05對(duì)多種植物病原細(xì)菌表現(xiàn)明顯拮抗效果一致。P.polymyxaCF05在溫室條件下對(duì)番茄幼苗具有較好的促生作用,生物量明顯增加,而且P.polymyxaCF05的發(fā)酵液比菌懸液促生效果顯著。其原因可能是通過固氮、溶磷作用產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)或產(chǎn)生激素直接促進(jìn)植物生長,或者通過抑制植物病原菌間接促進(jìn)植物生長。P.polymyxa中發(fā)現(xiàn)了植物生長素合成通路的相關(guān)基因以及吲哚-3-丙酮酸脫羧化酶(IPDC),說明該細(xì)菌可以產(chǎn)生植物生長素(IAA)。同時(shí),固氮基因nifH也在多粘類芽孢桿菌中得到克隆,說明該細(xì)菌具有生物固氮的特性。P.polymyxa在多種植物上報(bào)道可以防治真菌、細(xì)菌以及線蟲引起的植物病害。P.polymyxa處理植物后,