腦卒中患者血漿中-突觸核蛋白的變化及影響因素

-觸碰核蛋白（i-synu含有140個(gè)氨基酸）。這個(gè)氨基很容易形成兩個(gè)雙螺線體，以促進(jìn)蛋白質(zhì)和膜以及蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的作用。α-Syn在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸前末梢廣泛表達(dá),也存在于正常人群腦脊液和血漿中。研究表明,腦卒中會引起缺血部位α-Syn表達(dá)增加且引起血漿內(nèi)環(huán)境改變。故受損神經(jīng)元中的α-Syn易漏到細(xì)胞間質(zhì),而缺血再灌注引起血腦屏障雙向性開放,為α-Syn彌散至腦脊液、血漿中提供了條件。因此探討血漿中總α-Syn及α-Syn寡聚體形成變化有重要意義。本研究建立了檢測腦卒中患者血漿α-Syn總含量及寡聚體的ELISA法,觀察腦卒中對血漿α-Syn含量變化的影響。1材料和方法1.1對照的性別、年齡從2012年3月至5月首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)科住院患者中,選取50例腦卒中患者,男30例,女20例,平均51~70歲。另選取年齡、性別相匹配的30名健康受試者作為對照組,男女各15例,年齡49~74歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意批準(zhǔn)進(jìn)行。所有受試者在進(jìn)行抽血前均被告知實(shí)驗(yàn)研究目的與研究方案,并簽署知情同意書。1.2土壤中的經(jīng)濟(jì)性狀重組人α-Syn、抗α-Syn單克隆抗體(2D10,3D5)由本室制備;生物素化的3D5、生物素化的兔多克隆抗體(康為世紀(jì)標(biāo)記);親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(Vector公司,美國);4-硝基磷酸二鈉鹽(pNPP)(Sigma公司,美國);ELISA96孔酶標(biāo)板(Corning公司,美國);酶標(biāo)儀(Tecan公司,瑞士)。1.3elisa法檢測血漿中-syn寡聚體的表達(dá)1)血漿中α-Syn總量的ELISA檢測:用質(zhì)量濃度為6×10-3g/L的2D10單抗包被96孔酶標(biāo)板,100μL/孔,37℃孵育2h,4℃過夜,PBST洗板。10%BSA200μL封閉,200μL/孔,37℃孵育2h,PBST洗板。加入倍比稀釋的重組人α-Syn(320μg/L、160μg/L、80μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L、0μg/L)和待測樣品,100μL/孔,37℃孵育2h,PBST洗板,然后加入生物素化的兔多抗(6×10-3g/L),100μL/孔,37℃孵育2h,PBST洗板,再加入親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(1∶5000),100μL/孔,37℃孵育1h,PBST洗板,最后加入pNPP,100μL/孔,37℃顯色30min,405nm處測定吸光度值。每次每個(gè)樣品重復(fù)3孔,重復(fù)3次。2)血漿中α-Syn寡聚體形成量的ELISA檢測:向血漿中加入重組人α-Syn,使其終質(zhì)量濃度為0.1mol/L,37℃280r/min恒溫震蕩48h。用質(zhì)量濃度為1×10-3g/L的3D5單抗包被96孔酶標(biāo)板,100μL/孔,37℃孵育2h,4℃過夜,PBST洗板。10%BSA封閉,200μL/孔,37℃孵育2h,PBST洗板。加入倍比稀釋的重組人α-Syn(0.5mol/L、0.25mol/L、0.125mol/L、0.0625mol/L、0.03125mol/L、0mol/L)和待測樣品,100μL/孔,37℃孵育2h,PBST洗板,然后加入生物素化的3D5(1×10-3g/L)100μL/孔,37℃孵育2h,PBST洗板,再加入親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(1∶5000),100μL/孔,37℃孵育1h,PBST洗板,最后加入pNPP,100μL/孔,37℃顯色30min,405nm處測定吸光度值。每次每個(gè)樣品重復(fù)3孔,重復(fù)3次。3)α-Syn寡聚體的免疫印跡分析:將α-Syn用10%SDS分離后,半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將PVDF膜與3D5單抗(1∶5000)室溫孵育2h,然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG多克隆抗體(1∶5000)室溫孵育1h。ECL法檢測辣根過氧化酶活性。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x珋±s)表示,組間比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1elisa檢測寡聚體的靈敏度用ELISA檢測α-Syn總量,以PBS為空白對照,測定其在405nm處吸光值,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算本方法的靈敏度,結(jié)果為8μg/L(圖1)。如圖2所示,我們建立的檢測寡聚化α-Syn的ELISA方法,可以較特異地識別樣本中α-Syn寡聚體。根據(jù)α-Syn的起始濃度,計(jì)算出本方法的最低檢測限為~48ng/孔。2.2兩組患者的g/l腦卒中病患組血漿中α-Syn質(zhì)量濃度為(108.449±10.04μg/L)(n=50)。而對照組為(74.845±8.95μg/L)(n=30)。兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.8,P<0.05)(圖3)。2.3兩組患者n的比較見表1腦卒中病患組血漿中α-Syn寡聚體質(zhì)量濃度為(243.38±58.29mg/L)(n=50)。而對照組為(153.8±11.6mg/L)(n=30)。兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.42,P<0.01)(圖4)。2.4腦卒中組血漿中-syn寡聚體的形成情況將重組人α-Syn在腦卒中組和對照組血漿中震蕩48h,其免疫印跡結(jié)果顯示,腦卒中組血漿中α-Syn寡聚體形成量較對照組明顯升高(圖5)。3腦卒中患者血漿中-syn的表達(dá)變化該研究利用本實(shí)驗(yàn)室制備的抗α-Syn單克隆(2D10、3D5)及多克隆抗體,分別建立了檢測α-Syn總量及寡聚體的ELISA方法。根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定相關(guān)系數(shù)分別為0.992379和0.9906,并且測得最低值分別為8μg/L和48ng/孔,提示兩種ELISA方法都具有較高靈敏度。本實(shí)驗(yàn)利用上述ELISA方法,發(fā)現(xiàn)腦卒中患者血漿中α-Syn總量較正常對照明顯增高。文獻(xiàn)報(bào)道,腦卒中患者腦梗死部位由于缺血、缺氧,能量代謝下降,導(dǎo)致包括自噬和蛋白酶體依賴的蛋白降解途徑受抑,使神經(jīng)元內(nèi)α-Syn降解減少。因此本課題組研究人員推測,缺血神經(jīng)元胞膜破裂釋放α-Syn至細(xì)胞間質(zhì);同時(shí),受損的神經(jīng)元可能通過分泌囊泡的形式,向細(xì)胞間質(zhì)釋放α-Syn。缺血再灌注引起血腦屏障雙向性開放有可能使梗死灶區(qū)高濃度α-Syn彌散至腦脊液、血漿。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)腦卒中患者血漿中α-Syn寡聚體形成量較正常對照顯著增高。α-Syn寡聚體的形成,一般認(rèn)為與其濃度及氧化修飾有關(guān)。研究報(bào)道,α-Syn濃度越高,寡聚體越易形成。另外,腦卒中患者血漿中多種成分含量變化,導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境