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SZDB/Z

基于基因條形碼的魚類物種鑒定技術(shù)要求Technical

for

identification

深圳市市場和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會

SZDB/Z

2018目 次

............................................................................

II

范圍

...............................................................................

規(guī)范性引用文件

.....................................................................

術(shù)語與定義

.........................................................................

縮略語

.............................................................................

原理

...............................................................................

儀器與試劑

.........................................................................

取樣

...............................................................................

實(shí)驗(yàn)步驟

...........................................................................

結(jié)果判斷

...........................................................................

附錄

試劑配制........................................................

附錄

序列的有效性判定................................................

.......................

......................

11SZDB/Z

2018前 言

IISZDB/Z

2018基于基因條形碼的魚類物種鑒定技術(shù)要求

本文件適用于對自然環(huán)境種化產(chǎn)生的野生型魚類或其殘存的組織進(jìn)行物種鑒定,不適用于雜交

SOP

for

Suitable

for

Species

of

3.1

是指可用于物種鑒定的具有生物物種序列特征的DNA片段，本文件中指魚類線粒體基因組中的COI3.2

barcoding

3.3

從基因組DNA取步驟開始至PCR擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物檢測整個過程，沒有加入任何魚源性成分的空白的滅菌潔凈離心管，與其他受試的樣品平行進(jìn)行操作以觀察實(shí)驗(yàn)是否處于正常狀態(tài)?？瞻讓φ諞]有PCR產(chǎn)3.4 （Positive

SZDB/Z

20183.5 （Negative

3.6

3.7 (FASTA

生物信息學(xué)術(shù)語，又稱Pearson格式，是一種用文本表示核苷酸序列或者氨基酸序列的格式。核苷

center

information）

快又相對保守，既有足夠的變異又便于通用引物擴(kuò)增，DNA序列很少有插入與缺失現(xiàn)象，便于序列比對

6.1

6.2

buffer

(不含

DNA

mm

buffer

(不含

DNA

mm

FishF2t1

FishR2t1

除另有規(guī)定，試驗(yàn)用水應(yīng)為符合GB/T

引物用去離子水將每條引物配制成

100

mol/L

10

引物 名稱5’-3’ 備注VF2t1

FR1dt1

42+

3 3

-20

8.2

取20

mg樣品組織剪碎置于潔凈1.5

mL離心管中，加入600

L裂解液（見附錄A.1）和20

蛋白加入200

10

min，使蛋白質(zhì)鹽析出來；4℃，12

000

r/min離心10

min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈的1.5mL

離心管中，4℃，12

000

r/min

心10

12

r/min離心10

mL

r/min離心5min，

Buffer（不含

1×SZDB/Z

2018

Buffer（不含

1×棄上清，晾干；干燥后加入50

L去離子水溶解；DNA取液應(yīng)置于冰上備用，若需長期保存應(yīng)置于-20取純化試劑盒進(jìn)行核酸取，參照說明書使用。

吸取DNA取液

DNA

A260×50×稀釋倍數(shù)(ng/L)

8.4

mL

表1

L) 2+MgCl2

mmol/LdNTPs（10

each）0.2

mmol/L

mol/L）

VF2t1（10

mol/L）

mol/L）

FR1dt1（10

mol/L）

L） 0.05

U/μl 50

500

去離子水 35.5補(bǔ)充至

50

94

℃預(yù)變性2

30

s，30個循環(huán)；72

溴化乙錠（見附錄

V/cm，電泳1

h，用凝膠成像儀或紫外透射儀觀察，拍照記錄結(jié)果。

700bp

SZDB/Z

2018

長度大于500

9.1

9.2

9.3

序列相似度≤98.0％者，不能進(jìn)行種類的判斷。9.4

BOLD

SZDB/Z

2018

mol/L

mL0.5

mol/L

mL0.5

mol/L

20

10%

SDS

mL

將200

ml水中，輕輕搖動，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10

ml，然后分裝成小份貯存于-20℃

稱取578.12

L。

22H2

mL去離子水充分?jǐn)嚢枞芙夂?，加?7.1

mL的醋酸，用去離子水定容至1L，即為50×TAE電泳緩沖液，滅菌后室溫保存。使用時用去離子水稀釋50倍即得1

BrideEB10

的濃縮液。用時每

10

SZDB/Z

2018B.1

B.2

將序列復(fù)制至上圖Step

1中的空格處，Step

給出的六條氨基酸序列中，只要有一條沒有星號，表明可以得到一條具有完整開放閱讀框的拼SZDB/Z

2018

SZDB/Z

2018

SZDB/Z

2018

根