利用熒光標(biāo)記ssr構(gòu)建百合種質(zhì)資源分子身份證

李立偉，中國約47個品種和變種（龍亞宜，張金正，1998）。近50年來已培育的百合品種達(dá)9400個(InternationalLilyRegister,/)。隨著育成品種數(shù)量的不斷增長以及種質(zhì)交流的日趨頻繁,準(zhǔn)確地鑒別百合品種非常重要。用于種質(zhì)鑒定的分子標(biāo)記技術(shù)主要包括ISSR、RAPD、SRAP、SSR和SNP等,其中SSR(simplesequencerepeats)分析技術(shù)更具有在染色體上分布均勻、多態(tài)性豐富、共顯性、分辨率高和易于檢測等優(yōu)點(diǎn)(Morgante&Olivieri,1993)。Dangl等(2009)采用12對SSR引物構(gòu)建了18份加利福尼亞扁桃種質(zhì)的指紋圖譜。Oliveira等(2010)采用48對SSR引物構(gòu)建了32份大豆種質(zhì)的指紋圖譜。Pan(2010)利用21對SSR引物構(gòu)建了1025份甘蔗種質(zhì)的分子身份證庫;Moriya等(2011)利用15對引物構(gòu)建了95份蘋果種質(zhì)的指紋圖譜。楊陽等(2010)利用17對SSR引物構(gòu)建了湖南省36份茶樹品種(系)的分子指紋圖譜;王黎明等(2011)利用103對SSR引物構(gòu)建了142份甜高粱品種的分子身份證。由于分子身份證是指紋圖譜數(shù)字化后得到的字符串,其構(gòu)建實(shí)現(xiàn)了品種比對的自動化,具有高效、準(zhǔn)確和方便的優(yōu)點(diǎn),更適合進(jìn)行大規(guī)模的品種比對。目前常用的SSR-PCR分析是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,但該方法的缺點(diǎn)是不能準(zhǔn)確讀出目標(biāo)DNA片段的大小,檢測效率偏低和難以對大規(guī)模不同批次品種DNA指紋鑒定數(shù)據(jù)進(jìn)行有效整合(程本義等,2011)。與常規(guī)的凝膠電泳檢測法相比,基于DNA測序儀的SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測方法可以得到目標(biāo)DNA片段的準(zhǔn)確大小,檢測結(jié)果更為精確,適用于大批量樣品的檢測分析。SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)電泳檢測技術(shù)已成功應(yīng)用于小麥(Fujitaetal.,2009)、無花果(Achtaketal.,2009)、甘蔗(Pan,2010)、大豆(Oliveiraetal.,2010)、蘋果(Moriyaetal.,2011)、水稻(程本義等,2011)、棗(麻麗穎等,2012)和梨(高源等,2012)等的品種鑒定研究中。近年來在百合中也開發(fā)了一批穩(wěn)定性好的SSR標(biāo)記,并已應(yīng)用于系統(tǒng)進(jìn)化和遺傳多樣性等研究中。楊素麗等(2008)和Lee等(2011)先后利用NCBI上的百合EST序列開發(fā)了一批SSR引物;葛亮等(2012)利用19對SSR核心引物對部分百合資源進(jìn)行了遺傳系統(tǒng)進(jìn)化分析;Kawase等(2010)和Sakazono等(2013)利用雙重抑制PCR技術(shù)開發(fā)了一批SSR引物;Yuan等(2013)利用岷江百合(L.regale)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)了494對SSR引物。這些工作為利用SSR引物構(gòu)建百合的分子身份證奠定了良好基礎(chǔ),但至今尚未見相關(guān)研究報道。本試驗(yàn)中利用篩選到的SSR引物,采用熒光測序技術(shù)結(jié)合新的帶型編碼方式構(gòu)建96份百合樣本的分子身份證,并探索高精度、高通量和高效率構(gòu)建百合分子身份證的技術(shù)體系,以期為品種鑒定和親緣關(guān)系分析等相關(guān)研究提供參考。1材料和方法1.1蔬菜花物學(xué)試驗(yàn)于2010年10月至2012年6月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所進(jìn)行。試驗(yàn)材料共96份,其中包括22個原生種,74個雜交品種。1.2ssr引物合成及優(yōu)化選取新鮮的百合幼葉,用改良CTAB法(Beeketal.,1992)提取各樣品材料的總DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計(jì)檢測DNA質(zhì)量和濃度,并將其濃度稀釋至50ng·μL從Yuan等(2013)報道的172對EST-SSR引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性高的20對引物(表1)用于樣品的擴(kuò)增。合成20對熒光標(biāo)記引物,每4對標(biāo)記為一組,共分5組,每組4對引物的正向引物上分別加注的熒光染料為6-FAM(藍(lán))、HEX(黃)、TAMRA(黑色)和ROX(紅)熒光基團(tuán)(表1),由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。SSR-PCR反應(yīng)體系參照葛亮等(2012)的體系進(jìn)行。采用溫度梯度PCR(GradientPCR)對引物退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,得到各對引物合適的退火溫度(表1)。PCR循環(huán)條件是:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,合適退火溫度退火30s,72℃延伸45s,35個循環(huán);72℃延伸7min。反應(yīng)在Bio-RadPTC-200上進(jìn)行。1.3熒光標(biāo)記產(chǎn)物片段大小測定對96份百合樣品熒光標(biāo)記引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化,去除殘留的鹽分、蛋白質(zhì)等雜質(zhì);取純化后的熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增產(chǎn)物2μL,4種熒光標(biāo)記引物6-FAM、HEX、TAMRA、ROX擴(kuò)增產(chǎn)物分別稀釋50倍、30倍、10倍、10倍;將每組的4種熒光標(biāo)記產(chǎn)物每種取1μL混合,離心混勻,取1μL加入96孔板中;按每孔10μL體系,每孔含1μL稀釋后的擴(kuò)增產(chǎn)物、8.9μL甲酰胺和0.1μL片段大小標(biāo)準(zhǔn)GS500(-250)LIZ,計(jì)算所需甲酰胺和LIZ的量,將兩者混合做成預(yù)混液,分裝到96孔板中;95℃變性5min,置冰上10min,離心后在ABI3130xl遺傳分析儀上進(jìn)行片段大小測定;用GeneMapper對上機(jī)結(jié)果進(jìn)行片段大小及基因分型分析。1.4帶型的編碼和編碼利用20對引物對96個樣品進(jìn)行擴(kuò)增,得到各樣品擴(kuò)增的指紋數(shù)據(jù),將指紋數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為數(shù)字編碼,即分子身份證。轉(zhuǎn)換方法如下:將每對引物在某一樣品上擴(kuò)增出的每一種帶型用個位阿拉伯?dāng)?shù)字1,2,3,……,9編碼表示,為保證每一種帶型只占一位數(shù)字,帶型數(shù)大于9時,分別用a,b,c代表第10,11,12種帶型,依次類推,無帶用0表示,這樣,每種引物在某一樣品上的擴(kuò)增帶型用1位數(shù)字或字母表示;按照引物擴(kuò)增帶型數(shù)由少到多的順序,將每個樣品在20對引物上的擴(kuò)增帶型數(shù)據(jù)串聯(lián)起來,即得到每個樣品以20位數(shù)字或字母表示的分子身份證。2結(jié)果與分析2.1pcr檢測結(jié)果如表1所示,20對SSR引物對96份百合種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增,共檢測到69個等位位點(diǎn),每個引物檢測到的等位位點(diǎn)2~6個,每對引物平均3.45個。共檢測到170個帶型,每個引物檢測到帶型數(shù)3~17個,每對引物平均8.50個。擴(kuò)增的片段長101~471bp。由于采用四重?zé)晒饷?xì)管電泳技術(shù),可以完成對4對引物擴(kuò)增條帶的同時檢測,檢測的效率得以顯著提高。圖1為引物ivflmre125在‘Rita’、‘Prato’和‘Brunello’間的擴(kuò)增帶型。2.2分子身份證編碼按表2引物的順序即ivflmre125、ivflmre342、ivflmre1014、ivflmre407、ivflmre422、ivflmre138、ivflmre771、ivflmre141、ivflmre302、ivflmre179、ivflmre588、ivflmre79、ivflmre486、ivflmre381、ivflmre136、ivflmre725、ivflmre768、ivflmre738、ivflmre100和ivflmre1024,將每對引物在樣品上擴(kuò)增的帶型編碼進(jìn)行串聯(lián)排列,得到96份樣品的分子身份證代碼(表3)。得到的96個供試材料的分子身份證代碼均不相同,能夠?qū)⑺蟹N或品種區(qū)分開,在對應(yīng)的位置上,代碼相同表示該引物在樣品上擴(kuò)增帶型相同。此外,由于不是來自同一個克隆的無性系,來自不同產(chǎn)地的3個湖北百合(L.henryi)樣品76、94和96的分子身份證互不相同,來自不同產(chǎn)地的兩個川百合(L.davidii)樣品87和93的分子身份證也不相同。3討論3.1熒光標(biāo)記ssr毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果SSR標(biāo)記已被證明是一種具有高穩(wěn)定性和高準(zhǔn)確性的分子標(biāo)記(Powelletal.,1996;明軍等,2002)。此外,在對SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測的方法中,基于DNA測序儀建立的熒光標(biāo)記SSR毛細(xì)管電泳檢測法可以得到目標(biāo)DNA片段的準(zhǔn)確大小,檢測結(jié)果更為穩(wěn)定、準(zhǔn)確和高效,更適用大批量品種的檢測分析。龔亞明等(2009)針對豌豆的研究表明,EST-SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測法具有很好的重復(fù)性,表現(xiàn)很高的穩(wěn)定性。程本義等(2011)對水稻的研究表明SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測法的數(shù)據(jù)具有高重復(fù)性、高準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法對熒光標(biāo)記SSR毛細(xì)管電泳檢測法的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示兩種檢測技術(shù)的結(jié)果完全一致(數(shù)據(jù)未列出),表明該檢測方法可以對目標(biāo)DNA片段進(jìn)行準(zhǔn)確檢測,結(jié)果可靠。3.2分子身份證的應(yīng)用與不足指紋圖譜和分子身份證是兩個不同的概念。指紋圖譜是指能夠鑒別生物個體之間差異的電泳圖譜,其鑒定品種的基礎(chǔ)在于對比電泳圖譜中的差異來區(qū)分品種(高運(yùn)來等,2009),但由于指紋圖譜存在譜帶較多、人工比對判讀費(fèi)時費(fèi)力和統(tǒng)計(jì)分析較繁瑣復(fù)雜等問題,限制了其在大規(guī)模品種鑒定中的使用。而分子身份證是指在得到電泳圖譜的基礎(chǔ)上,通過運(yùn)用不同的編碼方式對電泳圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理后得到字符串形式的結(jié)果。相對于指紋圖譜,分子身份證能夠簡單明了地區(qū)分品種間的差異。由于分子身份證是指紋圖譜數(shù)字化后的結(jié)果,這樣就可以通過計(jì)算機(jī)對各品種的分子身份證自動比對,使品種的比對更加高效、方便和準(zhǔn)確,從而克服了指紋圖譜進(jìn)行人工比對的繁瑣、低效等問題,可以在大規(guī)模品種比對中廣泛使用。3.3分子身份證編碼構(gòu)建分子身份證的編碼方法主要有以下3類:(1)根據(jù)SSR指紋圖譜,以1和0分別代表某個等位基因位點(diǎn)擴(kuò)增DNA條帶的有無,將SSR圖譜轉(zhuǎn)換為由1和0組成的字符串,即構(gòu)成分子身份證(Ohtsubo&Nakamura,2007;劉新龍等,2010;趙新燕等,2010)。也有在此基礎(chǔ)上將二進(jìn)制轉(zhuǎn)化成十進(jìn)制進(jìn)行編碼(郝冬梅等,2011)。(2)將每對引物擴(kuò)增的條帶按從小到大排列,依次編碼;有兩個等位基因時取其中堿基數(shù)較少的一個(陳昌文等,2011)。(3)將獲得一系列帶型用數(shù)字進(jìn)行編碼,按照固定引物順序,串聯(lián)各帶型編碼,即可形成一組數(shù)據(jù),也就是該品種的分子身份證(王立新等,2006,2007)。本研究中所使用的分子標(biāo)記是EST-SSR標(biāo)記,為充分利用每一個位點(diǎn)的帶型數(shù)據(jù),雜合帶型也進(jìn)行了編碼,這樣可以充分利用引物區(qū)分更多的品種。本研究中所用的20對引物,只擴(kuò)增出69個等位位點(diǎn),而帶型卻有170種,多態(tài)性增加了1倍之多。在對帶型編碼時,首次采用0到9的10個個位數(shù)字和26個小寫英文字母對帶型進(jìn)行編碼,使一對引物在分子身份證上對應(yīng)一位數(shù)或一個字母,書寫簡潔,從而避免了僅使用數(shù)字對帶型編碼時,因引物擴(kuò)增帶型過多需要使用兩位數(shù)字進(jìn)行編碼的情況。研究者在選取分子身份證的編碼方法時,應(yīng)根據(jù)研究對象的特點(diǎn),秉著統(tǒng)計(jì)方便,書寫簡潔的原則進(jìn)行。針對SSR標(biāo)記多態(tài)性豐富的作物,可以采取第二種編碼方法進(jìn)行編碼。針對SSR標(biāo)記多態(tài)性不好或者引物不足的作物,為了充分利用帶型的多態(tài)性可以采用本研究中使用的編碼方式進(jìn)行編碼。3.4編碼更新數(shù)據(jù)庫的增加世界各國育種機(jī)構(gòu)每年都有大量的百合新品種育成并推向市場,所以,必須建立新品種的分子身份證來及時更新數(shù)據(jù)庫。隨著新品種的不斷增多,可能產(chǎn)生本研究中不包含的新的帶型,此時可以按照本研究的編碼方法對新的基因型進(jìn)行編碼。理論上每對引物最多可以編碼36(10個個位數(shù)和26個小寫字母)種帶型,所以,利用所選用的20對引物最多可以區(qū)分203.5分子標(biāo)記不一定和重要的