副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)方法副溶血性弧菌〔Vibrioparahaemolyticus〕是廣泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和魚貝類中的海洋性細(xì)菌，為海產(chǎn)食品引起急性胃腸炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季節(jié)的沿海地區(qū)，常常由于食用帶有大量副溶血性弧菌的海產(chǎn)食品，引起爆發(fā)性食物中毒。在非沿海地區(qū)，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦時(shí)有發(fā)生。為保障食品衛(wèi)生質(zhì)量和食用安全，依據(jù)副溶血性弧菌的特性，進(jìn)展以下檢驗(yàn)，以便鑒別診斷。第一節(jié)副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)方法一、檢驗(yàn)方法〔一〕操作步驟分別培育：首先稱取樣品25g，加225mL3.5％滅菌鹽水，用均質(zhì)器打碎或用乳缽磨碎，接種氯化鈉瓊脂平板和嗜鹽性瓊脂平板各一個(gè)，同時(shí)取10mL參加100mL增菌液中，放37℃8~16h培育后，涂上述平板進(jìn)展分別，37℃培育18~24h取出觀看，挑取可疑菌落，3.5％氯化鈉三糖鐵斜面，37℃、24h涂片鏡檢：將三糖鐵培育基上反響可疑者即底層變黃〔葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣〕、上層斜面不變〔乳糖、蔗糖不分解〕、有動(dòng)力、不產(chǎn)生硫化氫，進(jìn)展革蘭氏染色鏡檢形態(tài)。嗜鹽性試驗(yàn)：將上述可疑培育物分別接種不同含量的鹽胨水〔0％，3％，7％，10％〕于37℃24h培育后觀看生長狀況，在無鹽和10％鹽的胨水中不生長，在3％和7％鹽的胨水中生長良好者，連續(xù)進(jìn)展以下有關(guān)試驗(yàn)。生化試驗(yàn)：分別接種以下各類生化培育基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基紅、靛基質(zhì)、V-P，賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸、硫化氫及溶血性試驗(yàn)，放37℃培育，除V-P、靛基質(zhì)和甲基紅試驗(yàn)培育48h24h動(dòng)物試驗(yàn)：將上述符合各類反響的副溶血性弧菌，接種3.5％氯化鈉胨水，經(jīng)37℃、16~18h培育后，小鼠腹腔注射0.3mL，觀看2~3d，將死亡小鼠進(jìn)展解剖作分別培育。〔二〕檢驗(yàn)程序圖6-1副溶血性弧菌檢驗(yàn)程序二、結(jié)果分析判定及留意事項(xiàng)〔一〕樣品處理采樣時(shí)應(yīng)留意首選預(yù)備好滅菌用具及容器，以無菌手續(xù)取有代表性的樣品，樣品必需盡快送檢，不宜存放時(shí)間過長，副溶血性弧菌在適宜溫度下生殖較快，但不適于低溫生存，在嚴(yán)寒的狀況下簡潔死亡，防止待檢材料冷凍，以免影響檢驗(yàn)結(jié)果。對(duì)實(shí)行的樣品有時(shí)因受存放條件的影響〔如低溫冷凍或枯燥時(shí)間過長等緣由〕，使菌體處于受傷狀態(tài)，故需對(duì)此類可疑食品或可疑中毒材料進(jìn)展增菌培育，但應(yīng)留意為有利于細(xì)菌恢復(fù)，不宜選用抑制性較強(qiáng)的培育基，否則影響細(xì)菌生長。樣品經(jīng)增菌8~16h后，轉(zhuǎn)種平板進(jìn)展分別，選擇可疑菌落，接種于含有3.5％鹽的三糖鐵培育基，此時(shí)選擇數(shù)目不應(yīng)少于5個(gè)，尤其夏季海產(chǎn)食品混放，相互污染嚴(yán)峻，時(shí)有不同型別的大量細(xì)菌存在，以防漏檢?！捕承螒B(tài)與染色為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，易呈多形態(tài)，有棒狀、弧狀、卵圓狀、球狀、絲狀等，排列不規(guī)章，多數(shù)散在，偶而有成對(duì)排列，一般大小為0.3~0.7ｕm×1~2ｕm，單端一根鞭毛，有動(dòng)力，運(yùn)動(dòng)活潑，兩端濃染，在固體培育條件下能生長周鞭毛?！踩撑嘤匦栽谝话悱傊嘤鸵话阋后w培育基中都可生長，在無鹽的條件下不生長，在含2％~3％氯化鈉的培育基中生長最旺盛，氯化鈉溶液10％以上時(shí)不生殖。在肉湯和胨水等液體培育基中混濁生長，需氧性強(qiáng)，常在液體外表形成菌膜，在液體培育條件下菌體多生長為單鞭毛，運(yùn)行活潑。在固體培育基上，菌落常為隆起，圓形，稍混濁不透亮，外表光滑，潮濕，不產(chǎn)生色素。在比較穎潮濕或軟瓊脂培育基上，有些副溶血性弧菌可形成不規(guī)章菌落或片狀集中生長，在0.7％以上瓊脂的培育基上能生長周鞭毛〔側(cè)毛〕。一般在20~25℃在37℃培育或24h以上的培育物，周鞭毛易于由菌體自發(fā)脫落，具有周鞭毛的菌株，在固體培育基上多表現(xiàn)集中生長，單鞭毛的菌株在固體培育基上呈典型菌落，不表現(xiàn)集中生長。培育基的成分、種類、溫度、濕度等條件的不同，都能對(duì)集中生長有所影響，菌落形態(tài)也簡潔受條件的影響有所轉(zhuǎn)變，如在嗜鹽性平板上一般生長良好，而在SS瓊脂平板上多呈較小的扁平菌落，不易挑起。在血平反上生長快可消滅溶血環(huán)，在BCBS〔硫代硫酸鹽，檸檬酸鹽，膽鹽，蔗糖〕和氯化鈉蔗糖瓊脂平板上，呈淡藍(lán)或藍(lán)綠色菌落。一般由腹瀉病人初期分別者多為典型菌落，長期保存的細(xì)菌或條件不適宜時(shí)，常有菌落變粗糙，外形不整齊或菌落消滅解離，有的在液體培育時(shí)呈沉淀生長現(xiàn)象。pH生長范圍為5~10，最適pH為7.2~8.2，發(fā)育最適溫度為30~37℃?！菜摹成匦员揪鷮?duì)葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖和蔗糖，能分解甘露醇，產(chǎn)生靛基質(zhì)，不產(chǎn)生硫化氫，甲基紅陽性，V-P陰性，賴氨酸陽性，精氨酸陰性，鳥氨酸多數(shù)為陽性少數(shù)呈陰性，溶血性多數(shù)陽性，有少6-1。近年來由于細(xì)菌學(xué)根底爭論的深入和檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，漸漸對(duì)一些海水來源的嗜鹽性弧菌有所生疏，對(duì)其主要生化學(xué)性狀與副溶血性6-2。表6-1副溶血性弧菌的主要生物化學(xué)性狀工程工程耐鹽性0％－甲基紅＋7％＋v╟p－10％－靛基質(zhì)＋葡萄糖產(chǎn)酸＋賴氨酸＋葡萄糖產(chǎn)氣－鳥氨酸＋/－蔗糖－精氨酸－甘露醇＋溶血性＋/－硫化氫－注：＋陽性；－陰性；＋/－多數(shù)陽性，少數(shù)陰性。6-2菌名氧化酶葡萄糖產(chǎn)氣賴氨酸精氨酸鳥氨酸靛基質(zhì)明膠液化v！p乳糖蔗糖甘露醇肌醇阿拉伯糖甘露糖鼠李糖β半乳糖苷硝酸鹽泳動(dòng)06810副溶血性弧菌＋－＋－＋＋＋－－－＋－d＋－－＋d－＋＋v.parahaemoly-ticus溶藻弧菌＋－＋－＋＋＋＋－＋＋－－＋－－＋＋－＋＋v.alginolyicuso1＋－＋－＋＋＋d(d)＋＋－－＋－＋＋－d－－v.choleraeo1o1＋－＋－＋＋＋d(d)＋＋－－d－＋＋d＋d－v.choleraenono1擬態(tài)弧菌v.mimicus(d)－＋－－＋－＋＋－＋d－v.fluialis＋d－＋－d＋－－＋＋－＋dd＋＋－＋＋v.ｖ＋－＋－＋＋＋－＋dd－－＋－＋＋－－d－ulnificus梅氏弧菌－－dddddddv.metschnikouii霍利斯弧菌＋－－－－＋－－－－－－＋＋－－＋－－d－v.hollisaev.damsela－－d＋－－－＋－－－－－＋－－＋－－d－注：＋90％以上為陽性；－90％以上為陰性；〔＋〕緩慢陽性； d11％~89％為陽性；〔d〕11~89％緩慢陽性。〔五〕溶血性試驗(yàn)我妻氏用高鹽血瓊脂培育基，在限定的條件下培育副溶血性弧菌時(shí)消滅的溶血反響，稱此溶血性能為“神奈川現(xiàn)象”。此試驗(yàn)要求是用人或兔的穎紅血球制備高鹽血平板，經(jīng)37℃、24h圍呈現(xiàn)透亮溶血環(huán)或在菌落下面有明顯溶血者，為“神奈川現(xiàn)象”陽性，假設(shè)不消滅透亮溶血環(huán)或無明顯溶血者，為“神奈川現(xiàn)象”陰性。有致病性的副溶血性弧菌，多數(shù)為神奈川現(xiàn)象陽性，但亦有少數(shù)為陰性?！擦硠?dòng)物試驗(yàn)經(jīng)上述檢驗(yàn)的可疑菌株，用小鼠測定毒力，將16~18h的蛋白胨水或肉湯培育物，注射小鼠腹腔0.3~0.5mL，有毒力者可在5~10h發(fā)病死亡，長者有24h右發(fā)病死亡。發(fā)病時(shí)有豎毛、運(yùn)動(dòng)不活潑，腹部緊貼罐底，呼吸困難，四肢抽搐、尾部痙攣震顫等病癥。將死亡小鼠解剖后，取心血等內(nèi)臟進(jìn)展分別，可檢出試驗(yàn)菌的純培育。比照動(dòng)物2~3d但應(yīng)留意，尚有一些溶藻弧菌也可引起小鼠死亡，有時(shí)不易區(qū)分，需要上述毓的檢驗(yàn)后，進(jìn)行毒力證明，綜合判定結(jié)果。三、培育基〔一〕氯化鈉結(jié)晶紫增菌液20g氯化鈉40g0.01％結(jié)晶紫溶液5mL1000mLpH9.0制法：除結(jié)晶紫外其他按上述成安排好，加熱溶解，約加3％氫氧化鉀溶液4.5mL，校正pH，加熱煮沸，過濾，再參加結(jié)晶紫溶液，混合分裝試管，121℃15min。〔二〕氯化鈉蔗糖瓊脂10g牛肉膏10g氯化鈉50g蔗糖10g18g0.2％溴麝香草酚藍(lán)溶液20mL1000mLpH7.8制法：將牛肉膏、蛋白胨及氯化鈉溶解于蒸餾水中，校正pH，參加瓊脂，加熱溶解，過濾，參加指示劑，分裝燒瓶100mL，121℃高壓滅菌15min備用。臨用前在100mL培育基內(nèi)參加蔗糖1g，加熱溶化，冷至50℃傾注平板?！踩呈塞}菌選擇性培育基20g氯化鈉40g17g0.01％結(jié)晶紫溶液5mL1000mLpH8.7制法：除結(jié)晶紫和瓊脂外，其他按上述成安排好，校正pH，參加瓊脂，加熱溶解，再加結(jié)晶紫溶液，分裝燒瓶，每瓶100mL?！菜摹?.5％氯化鈉三糖鐵瓊脂20g牛肉膏5g乳糖10g蔗糖10g葡萄糖1g35g硫酸亞鐵銨0.2g硫代硫酸鈉0.2g12g酚紅0.025g蒸餾水1000mLpH7.4制法：將除瓊脂和酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，校正pH，參加瓊脂，加熱煮沸使瓊脂溶化，參加0.2％酚紅溶液12.5mL，搖勻，分裝試管，121℃15min，放置高層斜面?zhèn)溆??！参濉陈然c血瓊脂〔我妻氏培育基〕3g蛋白胨10g70g磷酸氫二鈉5g10g結(jié)晶紫0.001g15g蒸餾水1000mL制法：調(diào)pH8.0，加熱30min〔不必高壓〕，待冷至45℃左右時(shí)，參加穎人或兔血〔5％~10％〕，混合均勻，傾注平皿?！擦呈塞}性試驗(yàn)培育基2g氯化鈉按不同量參加蒸餾水100mLpH7.7〔七〕3.5％氯化鈉生化試驗(yàn)培育基5g蛋白胨10g35g磷酸氫二鈉2g0.2％溴麝香草酚藍(lán)溶液12mL1000mLpH7.7制法：將上述成安排好后，依據(jù)所需的糖發(fā)酵管分別參加各種糖類，葡萄糖發(fā)酵管可按0.5％葡萄糖參加后，分裝有小倒管的試管內(nèi)，121℃高壓滅菌15min。其他培育基可分裝為每瓶100mL，121℃高壓滅菌15min，另將各糖類分別配好10％溶液，同時(shí)高壓滅菌后，取5mL100mL〔八〕葡萄糖食鹽胨水〔MR-VP試驗(yàn)用〕5g葡萄糖5g磷酸氫二鉀5g30g制法：參加1000mL蒸餾水，振搖加熱，使全部溶解，冷卻后分裝小試管，121℃15min?！簿拧呈雏}胨水〔靛基質(zhì)試驗(yàn)用〕20g氯化鈉30g蒸餾水1000mLpH7.4制法：按上述安排制，分裝小試管，121℃高壓滅菌15min。〔十〕運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)培育基3g蛋白胨10g氯化鈉30g4g制法：將全部成分參加1000mL蒸餾水，加熱溶解，分裝試管，121℃15minpH7.4。其次節(jié)副溶血性弧菌參考檢驗(yàn)方法一、日本食品微生物檢驗(yàn)方法〔一〕分別、菌數(shù)測定6-2〔二〕鑒定將TCBS2個(gè)以上，接種以下培育基：6-3〔三〕檢查用培育基3％氯化鈉蛋白胨稀釋液：蛋白胨 10g、氯化鈉 30g溶于1000mL蒸餾水中，校正pH7.0，121℃15min高壓滅菌。TCBS成分：酵母膏5g10g蔗糖20g硫代硫酸鈉10g檸檬酸鈉10g3g牛膽汁粉5g氯化鈉10g1g溴麝香草酚藍(lán)〔2％溶液〕20mL草酚藍(lán)〔1％溶液〕4mL瓊脂15gpH8.6制法：將上述成分加蒸餾水至1000mL，混合，使全部溶解，校pH8.615~20mL。不分解蔗糖的副溶血性弧菌，在此培育基上生長呈藍(lán)綠色菌落，分解蔗糖的細(xì)菌呈黃色菌落。我妻氏瓊脂〔改進(jìn)〕培育基5g蛋白胨10g氯化鈉70g5g結(jié)晶紫〔0.1％酒精溶液〕1mL15g1000mLpH為7.5，至完全溶解后，加熱煮沸數(shù)分鐘，不需高壓滅菌，冷卻至50℃時(shí)，參加洗20100mL，混合均勻后傾注平皿。紅血球懸液的制備：將人的脫纖維血液，離心沉淀的血球，用0.85％滅菌生理鹽水洗3次，最終沉淀的紅血球，用生理鹽水制成1:4的懸液。亞硫酸鉍肉湯成分：蛋白胨10g25g氯化鉀0.7g5g制法：加蒸餾水950mL溶解，調(diào)pH為9.1，121℃高壓滅菌15min，室溫冷卻，加亞硫酸鉍溶液100mL及95％酒精1mL，混勻，無菌手續(xù)參加滅菌試管，每管100mL，不需加熱。亞硫酸鉍溶液配制：①熱水100mL，加亞硫酸鈉20g；②熱水100mL加檸檬酸鉍銨0.1g；③將①加②溶解甘露醇20g，煮沸1min，最終成白色混濁的混合物，1食鹽碳水化合物肉湯根底液2g硫酸鈉2.5g5g磷酸二氫鈉0.5g磷酸氫二鈉1.5g0.212mL制法：將全部成分溶于1000人工海水中，分裝試管，每管5mL，121℃15min高壓滅菌，冷卻后分別加碳水化合物 10％滅菌溶液0.5mL115℃10min人工海水的配制：氯化鈉23.4g，氯化鉀0.66g，硫酸鈉3.91g，重碳酸鈉0.19g，氯化鎂4.96g，將上述全部成分溶于1000mL蒸餾水。Hugh-Leifson食鹽培育基2g氯酸鈉30g磷酸氫二鉀0.3g10g瓊脂4g0.2％溴麝香草酚藍(lán)溶液12mL1000mLpH7.4制法：將上述成分溶解，調(diào)pH后加指示劑，分裝試管，每管3mL，121℃高壓滅菌15min。試驗(yàn)方法：穿刺接種兩種，一管加礦物油掩蓋外表，于35~37℃培育，兩管同時(shí)變黃為葡萄糖發(fā)酵，只有不加礦物油的培育管變黃時(shí)為葡萄氧化。二、耐熱溶血毒檢驗(yàn)方法依據(jù)試驗(yàn)證明，神奈川現(xiàn)象陽性菌株，多數(shù)對(duì)人的致病性有親熱關(guān)系，神奈川現(xiàn)象的陽性物質(zhì)稱“耐熱性溶血素”，檢驗(yàn)副溶血性弧菌是否產(chǎn)生耐熱性溶血毒，可參考下述方法：〔一〕Sahuria〔櫻井氏〕法用副溶血性弧菌肉湯培育物上清液為抗原，與制備的精制耐熱性溶血毒的抗血清進(jìn)展瓊脂集中試驗(yàn)，觀看沉淀線?！捕矱lek〔本田改進(jìn)法〕以微研No.1瓊脂〔Difco胨30g30g，氯化鈉40g，葡萄糖5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.3〕培育37℃過夜，在平板上菌落旁約為5mm處放一小濾紙片〔上吸有抗血清〕，室溫放一夜，觀看濾紙旁有無沉淀紅?！踩骋后w培育檢驗(yàn)法〔飯?zhí)锩瘛秤?％氯化鈉肉湯，參加少量穎紅血球，傾斜培育，神奈川現(xiàn)象陽性菌株能引起溶血，而陰性菌株不溶血?！菜摹撤聪啾粍?dòng)血球凝集法〔太田氏〕用吸附抗體的紅血球測定抗原〔溶血毒〕，此方法極為敏感，可查出微量耐熱性溶血毒。并覺察神奈川現(xiàn)象陰性的菌株也產(chǎn)生少量的耐熱性溶血毒。三、至病性試驗(yàn)方法〔一〕兔腸袢結(jié)扎試驗(yàn)選用正常安康家兔，首選使家兔斷食24h，用乙醚麻醉，將腹壁切口，露出小腸，選取腸段約5cm左右，于兩端結(jié)扎，注入檢菌的肉湯培育物，同時(shí)另選兩段作陽性和陰性比照，然24h后由耳靜脈注入空氣殺死，開腹檢查，有致病性者注菌腸段可見腫脹積液，消滅壞死現(xiàn)象。一般認(rèn)為神奈川現(xiàn)象陽性菌株，兔腸袢結(jié)扎試驗(yàn)多數(shù)為陽性反響，神奈川現(xiàn)象陰性菌株多數(shù)為陰性，但亦有少數(shù)為陽性者。〔二〕生兔經(jīng)口試驗(yàn)選用