第四章 生物制品的研品的出口問題生物制品管理辦法》、 新生物制品管理辦 二、菌（毒）三、菌（毒）

滅活（脫毒）或濃縮、加佐劑等，

活 2診 與處理

試血 的處菌（毒）致病性微生物，一般用于制造滅活 弱毒，常用于制造 、診斷試劑因此對(duì)菌（毒）種必須加強(qiáng)管理，防止散毒和丟失。1（毒）生物學(xué)性狀明顯遺傳性狀穩(wěn)定純凈（粹）免疫原性良好安全可靠 。毒力在適當(dāng)范圍內(nèi)：滅活應(yīng)該是強(qiáng)毒，弱安全，中等毒力的如ND-I系，IBD 原

2（毒）種的選育（圖強(qiáng)強(qiáng)性質(zhì)弱毒力毒 來源制造弱滅活 用途抗 和抗毒素 診斷制品 血液制 微生態(tài)制劑的毒 標(biāo)準(zhǔn)攻毒株

天然的（強(qiáng)、弱毒）毒株改造的（致弱毒株、菌種毒種蟲種工程菌株）菌種毒種蟲種弱毒菌（毒）弱毒菌（毒）影響，且真空保存的菌（毒）種保存期長。有些毒株如 體的細(xì)胞種也在-196C的液氮罐中保存。弱凍干保護(hù)劑亦稱穩(wěn)定劑，是指冷凍真空干燥生物制品中抗原活性物質(zhì)以外的添加物。能防止在凍干過程中活性物質(zhì)失去結(jié)構(gòu)水及結(jié)構(gòu)水形成結(jié)晶，保持 中微生物在干燥狀態(tài)下 復(fù)蘇時(shí)迅速 力1010%蔗糖、5%蔗糖脫脂乳、5%蔗糖、1.5%明膠；10—20乳、含1%谷氨酸鈉的10%脫脂乳；5%牛白蛋白的蔗糖；含0.1%谷氨酸鈉的10%脫脂乳，10%脫脂乳，7.5明膠、、谷氨酸鈉、羊水、蛋白胨、蔗糖、乳糖、山梨醇、葡萄糖、牛白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、水解乳蛋白、活馬

菌（毒） 告第2139號(hào)（核發(fā)獸藥GMP 可證）雞病專業(yè)網(wǎng)-養(yǎng)雞與雞病防治門 菌（毒）種是生產(chǎn)必備的原材料，國生產(chǎn)的菌（毒）種來源：中國獸獸品監(jiān)察所或其委托的保管單位進(jìn)行生產(chǎn)、鑒定和保管，生產(chǎn)用批由企業(yè) 家法定標(biāo)準(zhǔn)。..\農(nóng)業(yè)部公告第1801號(hào)――關(guān)于發(fā) (VG-GA株)制造及檢驗(yàn)規(guī)程、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、說明書和 是可行的，并報(bào)農(nóng)業(yè)部評(píng)準(zhǔn)，形成新《規(guī)程》 GMP 污水處理站鍋爐房脾林苗質(zhì)檢樓廠房菌（毒） 物、禽胚或細(xì)胞等） 收獲抗原（培養(yǎng) 配分裝 凍干成活 或滅活后制成 生產(chǎn)用生產(chǎn)用 分裝凍干、扎蓋帖活 活 健康動(dòng)物（或胚胎健康動(dòng)物（或胚胎 細(xì)胞懸液生產(chǎn)用種毒細(xì)胞懸液

傳代細(xì)胞液液液液活配苗（混勻 佐活分裝凍干分裝凍干 健康動(dòng)物或SPF健康動(dòng)物或SPF生產(chǎn)用種毒健康動(dòng)物或SPF滅 配苗 分裝分裝活活 活生產(chǎn)用菌（毒）種 是否優(yōu)制苗用抗 （微生物增殖）是否高生產(chǎn)用菌（毒）種 是否優(yōu)制苗用抗 （微生物增殖）是否高 養(yǎng)）生長繁殖的過程。細(xì)菌性都是利用培落，細(xì)菌，然后逐級(jí)培養(yǎng)進(jìn)行規(guī)模化 活物理性狀（凍干苗無菌檢驗(yàn)（純粹檢驗(yàn)鑒別檢驗(yàn)：特異 中和檢驗(yàn)外 檢驗(yàn) ）：中和法檢驗(yàn)活菌計(jì)數(shù)（細(xì)菌 ）：平板計(jì)數(shù) ）：EID50、ELD50或TCID50。安全檢驗(yàn)：動(dòng)物或雞胚（劑量幾倍至幾十倍水份測定（凍干苗）：4TCID50。

松），將細(xì)胞單層消化成單個(gè)細(xì)胞；

工藝使其降溫至-70℃；德國引進(jìn)R921 1必須選擇SPF達(dá)512效價(jià)達(dá) 2 入孵前進(jìn)行熏蒸； 3接入到尿囊腔內(nèi)；左右；將后孵至72-96小時(shí)的雞胚置4℃冷卻6； ；胚液HA達(dá)512 縮（產(chǎn)品的均一與穩(wěn)定）；引進(jìn) 濃縮。。56水）；份）、包裝（即時(shí)包裝）。德國STERIS公司引進(jìn)LYOVAC凍干機(jī)德國引進(jìn)BOSCH全自 分裝線德國引進(jìn)BOSCH全自 分裝線德國引進(jìn)BOSCH全自 分裝線外 檢 嚴(yán)重受損（尤其是活）或劑型破壞，并導(dǎo)致失效，因此應(yīng)嚴(yán)格在規(guī)定的條冷凍真空干燥可以保護(hù)蛋白質(zhì)不變性，減少氧化環(huán)節(jié)，微生物活性和某些酶不受影響，且真空封口保存的產(chǎn)品具有保存時(shí)間較長、使用時(shí)加稀釋液能迅速溶解、復(fù)原性狀不變等許多優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用：活與抗等生物制品，在醫(yī)藥工業(yè)和食品工業(yè)方面(抗生素、維生素、 液或懸濁液，因此其冰點(diǎn)與水同。水在0C時(shí)結(jié)冰，而海水卻要在低于0C的溫度才結(jié)隨著溫度的下降，晶體的數(shù)量不斷增加。直到最后，溶液才全部凝結(jié)。這樣，溶液并不是在某一固定溫度時(shí)凝結(jié)，而是在某一溫度范圍內(nèi)凝結(jié)，當(dāng)冷卻時(shí)開始析出晶體的溫度稱為溶液的冰點(diǎn)。而媒共同熔化的溫度點(diǎn)。所以又叫做共，或溶液的冰點(diǎn)與共是不相同的。共才是熔液真正全部凝成固體的溫度。共的概念對(duì)于冰凍干燥是重要的，因?yàn)閮龈僧a(chǎn)品是一種復(fù)雜的液體，它的凍結(jié)過程肯定也是一個(gè)復(fù)雜的過程，與溶液相似，也有一個(gè)真正全部凝結(jié)成固由于冷凍干燥是在真空狀態(tài)下進(jìn)行，只有產(chǎn)品全部凍結(jié)后才能在真空下進(jìn)行升華，否則有部分液體存在時(shí)在真空下不僅會(huì)迅速冒出來，造成象液體沸騰的樣子，使凍干產(chǎn)品鼓泡、甚至冒出瓶外。為此凍干產(chǎn)品在升華開始時(shí)必須要冷到共以下的溫度，使凍干產(chǎn)品真正全部凍結(jié)。 共的測定：電阻法，冰凍溶液在-40℃電阻突然降低，此時(shí)溫度叫共，水分子共的數(shù)值從0C-40C不等，與產(chǎn)品的品 6.3 6.4冷凍干燥的程序：在凍干前，把需要凍干的產(chǎn)品分裝在合適的容器內(nèi)，一般是玻瓶或安瓿，裝置要均勻，蒸 面盡量大而厚度盡量薄些；然后放入與凍干箱尺寸相適應(yīng)的金屬盤內(nèi)。裝箱之前，先將凍干箱進(jìn)行空箱降溫，然后將產(chǎn)品放入凍干箱內(nèi)進(jìn)行預(yù)凍，抽真空之前要根據(jù)冷凝器、冷凍機(jī)的降溫速度提前使冷凝器工作，抽空時(shí)冷凝器應(yīng)達(dá)到-40C左右的溫度，待真空度達(dá)到一定數(shù)值后(通常應(yīng)達(dá)到13.33Pa以上的真 ①升華干燥：真空條件下（10—30Pa），加熱 ②解析干燥：使 ④解析干燥時(shí)的溫度：非生命物質(zhì)可以到40℃, 18— 3.6豬瘟 產(chǎn)品介類型使用種毒抗原方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)成本臨床使用豬瘟活疫苗（成兔脾淋源豬瘟兔化弱150個(gè)高非特異免疫強(qiáng)抗原含量高過敏率低豬瘟活疫苗（乳兔源）豬瘟兔化弱150個(gè)較高無非特異免疫抗原含量較低過敏率高豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）豬瘟兔化弱培養(yǎng)液750個(gè)（新標(biāo)準(zhǔn)7500RID）低抗原含量高，過敏率較高豬瘟活疫苗（牛體源）豬瘟兔化弱150個(gè)較底非特異免疫強(qiáng)抗原含量高過敏率低 純凈（細(xì)菌和外 毒污染代次控制在5 診斷劑；是利用微生物，，及其代謝產(chǎn)物，及高免制成,用于鑒定微一）診斷抗原：用已知抗原成分，來檢測未知抗體 1、凝集反應(yīng)抗原：常見有雞白痢、布氏、馬，下面講雞白痢沙門氏菌全血平板抗原步驟； 反應(yīng)，多用于胞內(nèi)細(xì)菌，病測 —高壓滅菌水解—濾器過濾—?jiǎng)捠隙ǘ? 因子：是僅含某主要抗原的抗體。。 三）為買商品，一般單位不自己。 熒光素主要有異硫酸熒光素(FITC)或羅達(dá)（二）乳過氧化物酶法 免 制造流一）動(dòng)物的選擇與管理二）免疫原三）四）血 五）幾種重要畜禽用免疫 六）免疫 又稱高免 疫制品。經(jīng)過反復(fù)多次注射同一動(dòng)物體，促使動(dòng)物不斷產(chǎn)生免疫應(yīng)答，在 對(duì)應(yīng)的特異性抗體而制成。分類（據(jù)免疫 作用的對(duì)象不同）：抗病和抗毒素。2 謂的人工 免疫。當(dāng)動(dòng)物已 3、應(yīng)用用作緊急預(yù)防注射，通常是在已經(jīng)發(fā)生傳染 缺點(diǎn)：持續(xù)期短（一般僅2~3周）目前生產(chǎn)較多的抗 有：破傷風(fēng)抗毒素 動(dòng)物的選擇與管理→免疫原的 →免疫程序→血液 提取一）（一）1、動(dòng)物的品種 用同種動(dòng)物產(chǎn)生的稱同源 用異種動(dòng)物生產(chǎn)的稱異 多用同種動(dòng)物。如犬瘟 免疫 用馬較多，也可使用多種動(dòng)物（如馬、牛、羊三種動(dòng)物） 。選定動(dòng)物應(yīng)有一定的數(shù)量，一個(gè)批次應(yīng)用多頭動(dòng)物。 及健康情 馬 察2周以上，確認(rèn)健康者方可應(yīng)用。（二）1、動(dòng)物應(yīng)在 時(shí)散毒。2、應(yīng)詳細(xì)登記每頭動(dòng)物的來源、品種、 料。隨時(shí)觀察其健康情況。每日至少運(yùn)動(dòng)4h。動(dòng)物采血前1d禁食喂水，避免血中出現(xiàn)乳糜。5、在生產(chǎn)過程中，若發(fā)現(xiàn)健康狀況異?；蛴谢疾?療。（一）理性狀。一般來說，顆粒性抗原較可溶性抗原的抗原性（二）1基礎(chǔ)免疫用抗原多為 或死菌，而高度免疫的抗原，一般選用毒力較強(qiáng)的毒株。多價(jià)抗病用的抗原，要求用 型菌株細(xì)菌抗原：培養(yǎng)→洗菌苔→離心→計(jì)數(shù)→稀釋為含菌100億/毫升→滅活（水浴80℃2h或加0.4%甲醛37℃24~48h）。2、 3、抗毒素免疫原可用類毒素、毒素或全培養(yǎng)物（活菌加毒素），但后兩者只有在需要加強(qiáng)免疫刺激的情況下三）高度免疫（加強(qiáng)免疫采用多部位注射法。隔時(shí)間1~2周，劑量逐漸加大。首免1頭份→1~2 份。3~5次），間隔1周?；A(chǔ)免疫后2周第一次加強(qiáng)免疫 體效價(jià)→符合要求→采血→ （高免的注射次數(shù)要 抗體效價(jià)而定。有的只要大量注，才能產(chǎn)生高效價(jià)的免 。（三） 四）血 提（試血）， （一）1、采血時(shí)間一 抗體的效 在最后一次免疫后的2 34、采血部位豚鼠由心臟穿刺采血；家兔可以從心臟采血或頸靜脈、頸動(dòng)脈放血，少量采血可通過耳靜脈采??；頸動(dòng)脈或頸靜脈放血；羊可從頸靜脈采血或頸動(dòng)脈、頸靜脈放血；家禽可以心臟穿刺采血或頸動(dòng)脈放血。（二 采血時(shí)一般不加抗凝劑，全血在室溫中自然凝固，在置于371~2h，然后置于4℃冰箱過夜，次日離心收集。 提取的 放入滅菌瓶中，加入0.5%石炭酸或0.02%硫柳防腐。放置數(shù)日作無菌檢驗(yàn)。無菌 ，組批分裝，保存于－15℃半成品庫，待 （一）1、動(dòng)物的選擇

抗的多用同種動(dòng)物；通動(dòng)物。選用60kg左右，健康、營養(yǎng)良好的豬2、免疫原基礎(chǔ)免疫：高度免疫：血毒基礎(chǔ)免疫用抗原多為疫，而高度免疫的抗原，一般選用毒力較強(qiáng)。3、免疫程序 基礎(chǔ)免疫注射豬瘟兔化 （2）高度免疫

免疫劑量基礎(chǔ)免疫后隔14～21d第一次高免，肌肉注射血毒第二次，肌肉注射血毒第三次，肌肉注射血毒300ml；每次間隔10d4、血液第三次高免后9～11d（二）1、動(dòng)物的選擇選擇5～122、免疫原基礎(chǔ)免疫：破傷風(fēng)類毒素高度免疫：血毒3、免疫程序 基礎(chǔ)免疫第一次， 制破傷風(fēng)類毒素油佐劑抗原第二次，注射2ml（2）高度免疫基礎(chǔ)免疫1～3第一程高度免疫，一般注射5～8針，1～4針各針之間間隔2～3d，5～8針各針之間間隔4～6d。抗原量每針遞增1～2ml。第5次開始試血至第8次。第一程采血后，休息14～16d后進(jìn)行第二程高度免疫，第二程高度免疫，一般免疫3次，間隔5～7d，最后一次免疫后7～9d采血。4、血液

第 免最后一次免疫后6～7d采血，第免最后一次免疫后7～9d采血，隔1天再次采血，檢測效價(jià)。5 的純化 20%硫酸銨進(jìn)行沉淀，然后加入10%的明礬使明礬含量為1%，靜置使之沉淀。取沉淀后的上清加38%的硫酸銨沉淀，沉淀物經(jīng)透析即成精制破傷風(fēng)抗毒素。（三）1、動(dòng)物的選擇選擇健壯馬匹2、免疫原基礎(chǔ)免疫：炭疽 （無毒炭疽芽孢苗或Ⅱ號(hào)炭疽芽孢苗）3、免疫程序 基礎(chǔ)免疫 于第、、、日共進(jìn)行次基礎(chǔ)免疫。（2）高度免疫用炭疽強(qiáng)毒或炭 ，于第、、、、、、、、、、日共高免次，劑量遞增。4、血液和第45日試血，試血合格后，再按最后一次的劑量免疫一次，7～8d后采血分離，加防腐劑，密封于冷暗處，靜置1～2個(gè)月使之澄清，經(jīng)檢驗(yàn)合格后分裝。（四）1、定義通過免疫注射產(chǎn)蛋雞，即可由其生產(chǎn)的蛋黃中提取相應(yīng)得抗體，并可用于相應(yīng)疾病的預(yù)防和治療，該類制劑稱為卵黃抗體。連續(xù)生產(chǎn)。缺點(diǎn)：有潛伏野毒 2 過程例如：IBD（雞傳染病法氏囊?。┻_(dá)1：128時(shí)開始收集高免蛋，4℃?zhèn)溆谩－倲U(kuò)效價(jià)降將高免蛋用0.5%，再 棉擦拭蛋殼，打取雞卵分離蛋黃行稀釋（稀釋后的卵黃抗體瓊擴(kuò)效價(jià)不低于1：16~1：32），加青、鏈霉素各1000IU/ml，加硫柳濃度達(dá)0.01%，充分?jǐn)嚢韬蠓盅b于滅菌瓶內(nèi) 六）免 早效果越好。 的用量根據(jù)動(dòng)物的體重 不同而定預(yù)防量，大動(dòng)物10~12ml，中等動(dòng)物（豬、羊等）5~10ml；以皮 射為主，也可肌肉注射。治療量，按預(yù)防量加倍，并根據(jù)病情采取重復(fù)注射；注射方法以靜脈為好，以使其盡速奏效。 射1：100腎上腺素，大動(dòng)物5~10ml，中小動(dòng)物2~5ml微生態(tài)制劑的英文名“probioties”，源于古希臘語，意為“forlife”(有益于生命)，我國有人翻動(dòng)物健康狀況。拌料或溶于水中。也可局部使用（如用于上呼吸道、及生殖道）和噴霧使用試驗(yàn)的1菌株的生物安全性生產(chǎn)和加工的可能性微生態(tài)制劑的使用及菌株保持所必須的條件。的安全（GRAS）菌。此外應(yīng)盡量選用與靶動(dòng)物性良好的菌株。2生產(chǎn)微生態(tài)制劑的菌種3幾種微生態(tài)制劑的生產(chǎn)方法3.1包括蠟樣芽孢桿菌和枯草桿菌，蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)菌株有：DM423SA38、N42、BC901、BNL4和枯草桿菌(B.subtilis)有：BNLl、BNL2、BC”“乳”、“止痢靈”等。特點(diǎn)：對(duì)高溫的耐受力強(qiáng)，因而適于制成各種養(yǎng)要求不高。一般通氣培養(yǎng)18～24小時(shí)，芽孢形成率就能達(dá)到90％以上，此時(shí)即可收獲菌液。如果要制成賦形劑（醫(yī)用淀粉、碳酸鈣粉、食用淀粉、玉米粉等）或?qū)①x形劑直接加入菌液中調(diào)勻成糊狀，并置40～50C左右中烘干。制片或制粒。乳桿菌制劑乳桿菌(Lactobacillus)乳球菌(S.1actis)主要是糞鏈球菌(J．faecalis)或尿鏈球菌(S.faecium)。營養(yǎng)吸收，促進(jìn)代謝，克服過程。在防治動(dòng) 雙歧桿菌制劑雙歧桿菌(Bifidobacterium)是寄生在人、動(dòng)物小腸下段的重要正常菌群，起著微生態(tài)平衡的作用，與動(dòng)物和的許多生理功能如生免疫功能等有關(guān)，特別是腸道細(xì)菌間的生態(tài)平衡，