感染性疾病的免疫學(xué)檢測實驗一乙型肝炎病毒表面抗體檢測

實驗?zāi)康拿嘎?lián)免疫吸附試驗（ELISA）是感染性疾病的常用檢驗方法通過乙型肝炎病毒表面抗體檢測實驗，掌握ELISA的基本實驗原理及操作步驟熟悉影響實驗結(jié)果的各種因素，學(xué)習(xí)正確分析判斷實驗結(jié)果及了解檢測的臨床意義。實驗原理

采用純化的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）包被反應(yīng)板，加入待測標(biāo)本，同時加入標(biāo)記了辣根過氧化物酶的HBsAg（HBsAg-HRP），當(dāng)標(biāo)本中存在抗HBs時，該抗-HBs與包被的HBsAg結(jié)合并與酶結(jié)合物結(jié)合形成HBsAg-抗-HBs-HBsAg-HRP復(fù)合物，加入TMB底物顯色，顯色的強弱與待測標(biāo)本中的抗HBs含量成正比。試劑及器材包被有HBsAg的微孔板HBsAg-HRP陽性、陰性及弱陽性對照血清顯色劑，終止液酶標(biāo)儀洗板機取出包被好抗原的酶標(biāo)板1.加樣標(biāo)記各孔，加入50μL/孔1234陰性空白陽性待測2.加酶結(jié)合物3.顯色加入終止溶液1滴/孔，混勻酶標(biāo)儀上讀取吸光度值4.測吸光度實驗流程各孔加入酶標(biāo)抗原1滴/孔用洗滌液洗滌5次37℃，30min甩干孔內(nèi)液體加入顯色液A、B各一滴/孔37℃，15min5弱陽性操作步驟1.將包被孔編號，分別加入標(biāo)本、陰性對照、陽性對照、弱陽性對照及空白對照各50μl。2.每孔加入酶結(jié)合物1滴（空白對照孔除外），充分混勻，置37℃孵育30分鐘。3.甩去孔中液體，加洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復(fù)5次后拍干。4.每孔加顯色劑A液、B液各1滴，充分混勻，置37℃孵育15分鐘。5.每孔加入終止液1滴，混勻。6.在酶標(biāo)儀上于450nm波長處讀取吸光度值（A），以空白孔校零點，分別測定陰性、陽性、弱陽性對照及樣本孔的A450值。結(jié)果判斷

樣本孔吸光度值（S）/陰性對照孔吸光度值（N）≥2.1判斷為陽性。實驗討論ELISA是臨床常用的感染性疾病免疫學(xué)檢測方法，包括間接法、競爭法、捕獲法、雙抗體夾心法及雙抗原夾心法等方法，討論各種方法的臨床應(yīng)用。分析ELISA檢測過程中的各種影響因素，探討本次實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。討論乙型肝炎病毒表面抗體檢測結(jié)果的臨床意義。注意事項加樣應(yīng)加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，避免濺出，避免產(chǎn)生氣泡。洗滌必須徹底，防止產(chǎn)生假陽性。嚴(yán)格控制溫育溫度和時間。實驗二HBsAg不同檢測方法的最低檢測限

（驗證性實驗）

實驗?zāi)康?.用已知濃度HBsAg陽性血清作系列稀釋，分別采用膠體金免疫層析法、ELISA法兩種方法將不同稀釋度的HBsAg進(jìn)行多次重復(fù)定性檢測2.將所得實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，以驗證不同方法的最低檢測限3.初步掌握驗證實驗的原理、步驟及注意事項。熟悉定性檢測的性能驗證方法實驗方案膠體金法酶免疫技術(shù)乙肝表面抗原的定性檢測最低檢測限驗證確定臨界值濃度

制備評價用樣本

評價方法檢測限判斷結(jié)果實驗原理（一）

膠體金免疫層析技術(shù)

一端粘貼了含有金標(biāo)記的HBsAg抗體的硝酸纖維素膜試紙條，當(dāng)其下端浸入血清標(biāo)本后由于毛細(xì)管作用向另一端移動，移動中復(fù)溶金標(biāo)記的HBsAg抗體，若標(biāo)本中含有HBsAg即可形成金標(biāo)記抗HBsAg-HBsAg復(fù)合物，該復(fù)合物移動至測試區(qū)時，與固定在載體膜上的HBsAb結(jié)合而被固相化并顯示紅色線條（陽性條帶），多余的金標(biāo)記抗體則越過該區(qū)域并與質(zhì)控區(qū)中抗同一種屬來源的IgG結(jié)合顯示紅色（質(zhì)控條帶）。AgAbAb顯色劑E將已知的純化抗體（HBsAb）吸附于固相載體上加入待檢標(biāo)本（含相應(yīng)抗原HBsAg）與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標(biāo)抗體（HRP-HBsAb）形成夾心，加酶底物溶液顯色進(jìn)行測定。實驗原理（二）

酶免疫技術(shù)（ELISA）

雙抗體夾心法實驗原理（三）定值參比血清做系列稀釋后重復(fù)檢測確定臨界值C50確定最低檢測限（+20%樣本）最低檢測限的驗證根據(jù)C50制備評價血清-20%樣本+20%樣本實驗試劑及器材1.實驗試劑HBsAg國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（濃度為5ng/ml），HBsAg質(zhì)控血清，HBsAg陰性對照、陽性對照、弱陽性對照血清，

膠體金試劑盒，ELISA試劑盒，MEIA試劑盒。2.實驗器材酶標(biāo)儀、洗板機、恒溫水浴箱、吸水紙、移液器、微量加樣器吸頭等。操作步驟

（一）確定臨界值濃度HBsAg國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(5ng/ml)不同稀釋濃度重復(fù)檢測系列稀釋陰性結(jié)果占50%該濃度即為臨界值C50陽性結(jié)果占50%記錄結(jié)果、統(tǒng)計C5C50C95臨界值表1.不同濃度HBsAg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋參照表試管序號HbsAg(5ng/ml)（ul）陰性血清（ul）終體積（ul）終濃度（ng/ml）110001005280201004360401003450501002.5540601002620801001710901000.585951000.2592981000.1101991000.05110.299.81000.01（二）膠體金操作方法

順序?qū)⒛z體金試紙條浸入血清（不要超過最高檢測線）5秒鐘后取出，平置，20分鐘后判斷結(jié)果。（三）ELISA操作步驟加樣不同稀釋度的陽性血清（均做雙孔測定）及陰性對照、陽性對照、弱陽性對照血清，分別加入對應(yīng)的反應(yīng)孔，留1孔做空白對照，置37℃水浴60min。加酶每孔加入酶標(biāo)記抗體50ul,空白對照孔不加，置37℃水浴30min。洗滌甩去各孔內(nèi)液體，拍干，用洗滌液洗孔6次，每次均拍干。

加酶底物/色原溶液加顯色劑A液、B液每孔各50ul，37℃水浴30min顯色。加終止液每孔50ul。讀數(shù)在酶標(biāo)儀上于450nm波長處讀取吸光度值（A），以空白孔校零點，分別測定陰性對照、陽性對照、弱陽性對照及樣本孔的A值。操作實例：ELISA(雙抗體夾心法）試劑室溫平衡稀釋陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)血清順序加樣溫育加酶結(jié)合物溫育洗板洗板顯色讀取吸光度,判斷結(jié)果結(jié)果判斷

檢測次數(shù)陽性結(jié)果次數(shù)陽性結(jié)果所占百分比C50準(zhǔn)確性判定140≤13次≤32.5%不準(zhǔn)確或不可信（統(tǒng)計學(xué)的錯誤率為5%）≥27次≥67.5%24014～26次35%～65%準(zhǔn)確或可信

C50可信取決于實際檢測結(jié)果以及檢測的樣本數(shù)量

C50是否準(zhǔn)確的判斷：

根據(jù)濃度為C50的樣本在40次檢測中得到陽性結(jié)果的次數(shù)判斷C50是否準(zhǔn)確（表2）。表2表2判斷C50是否準(zhǔn)確表3.重復(fù)檢測次數(shù)與樣本的實際濃度

陽性結(jié)果

重復(fù)性檢測總次數(shù)次數(shù)百分比真正百分比樣本的實際濃度201050%30%～70%C30～C70402050%35%～65%C35～C651005050%40%～60%C40～C60表4.-20%～+20%濃度范圍是否包含了C5-C95區(qū)間

+20%陽性結(jié)果≥90%(36/40)-20%～+20%濃度范圍包含了C5～C95區(qū)間；用該方法檢測，C50±20%的樣本檢測結(jié)果一致-20%陰性結(jié)果≥90%(36/40)如果C50估計不準(zhǔn)，那么-20%到+20%濃度范圍也會變化，這將導(dǎo)致濃度范圍的一側(cè)落在C5～C95區(qū)間之外。最低檢測限的判斷若-20％濃度的樣本陰性結(jié)果次數(shù)和+20％濃度的樣本陽性結(jié)果次數(shù)符合表4，,則說明臨界值可信，而且+20％濃度即為最低檢出限。實驗注意事項加樣的準(zhǔn)確性：加樣及稀釋樣品時應(yīng)準(zhǔn)確標(biāo)準(zhǔn)濃度的樣品應(yīng)按濃度順序加樣，及時更換微量加樣器吸頭防止交叉污染實驗中同時設(shè)置陰性、陽性、弱陽性對照和空白對照洗滌要嚴(yán)格按照要求，徹底洗滌，防止假陽性，但不可沖洗過猛過急導(dǎo)致假陰性嚴(yán)格控制反應(yīng)時間和顯色時間膠體金試條法結(jié)果應(yīng)觀察30分鐘實驗結(jié)果分析兩種方法的實驗結(jié)果進(jìn)行匯總、統(tǒng)計其陽性及陰性次數(shù)，并計算其陽性次數(shù)及陰性次數(shù)的百分比，以分析確定臨界值C50。在臨界值C50的基礎(chǔ)上，重復(fù)測定并記錄+20%濃度樣本的檢測結(jié)果，并計算陽性次數(shù)及陽性次數(shù)百分比，通過對照表4分析與之是否相符，最終確定+20%是否為可信的最低檢測限。實驗小結(jié)總結(jié)本實驗中兩種方法的最低檢測限與試劑盒的給定值是否相符?？偨Y(jié)實驗過程中的操作是否規(guī)范，實驗過程中應(yīng)該注意哪些問題。實驗討論

基本概念：C50:是一個臨界值，是將陽性標(biāo)本做系列稀釋后，能夠獲得50%陽性和50%陰性結(jié)果的測試物的濃度，要保證C50的重復(fù)性較好應(yīng)保證該臨界濃度+20%處于95%的區(qū)間內(nèi)。C5：指一份樣本，在多次重復(fù)實驗中有95%的幾率獲得陰性的結(jié)果時該分析物得濃度。（低于C50濃度的20%）.C95：指一份樣本，在多次重復(fù)實驗中有95%的幾率獲得陽性的結(jié)果時該分析物得濃度。（高于C50濃度的20%）。？實驗討論重復(fù)性驗證實驗：重復(fù)檢測C5、C50、C95樣本各40次；確定每一份樣本結(jié)果為陽性和陰性的百分比；評價其臨界濃度是否準(zhǔn)確；評價+20%～-20%的濃度范圍是否包含于這種方法的95%區(qū)間。？實驗三抗鏈球菌溶血素O檢測

實驗?zāi)康?.掌握檢測ASO的原理和方法、操作注意事項及結(jié)果的判斷分析2.了解不同方法學(xué)的優(yōu)點與缺點3.了解ASO檢測不同方法的臨床應(yīng)用價值A(chǔ)SO檢測方法全自動免疫比濁法乳膠凝集實驗

溶血抑制法定量檢測半定量檢測定性檢測采用乳膠凝聚法和全自動免疫比濁法進(jìn)行實驗，通過比較掌握兩種方法的原理及各自的特點抗鏈球菌溶血素“O”的檢測實驗原理一、乳膠凝集實驗實驗試劑及器材實驗試劑：鏈球菌溶血素“O”，10%乳膠顆粒懸液，陰性、陽性對照血清，pH8.2的甘氨酸緩沖鹽水實驗器材：試管、反應(yīng)板、旋轉(zhuǎn)搖床、微量移液器、微量加樣器、毛細(xì)滴管等操作步驟致敏乳膠顆粒的制備：用蒸餾水將10%乳膠懸液稀釋至1%～2%，再將鏈球菌溶血素“O”溶于pH8.2的甘氨酸緩沖鹽水中，逐滴加入稀釋的乳劑懸液中(1%乳膠懸液1ml可吸附0.1～1mg物質(zhì)），同時搖動使之充分混勻，放置室溫30～60min，4000r/min離心30～45min，棄上清，沉淀用同一甘氨酸緩沖鹽水恢復(fù)懸浮狀態(tài)。操作步驟稀釋血清：將待檢血清、陰性血清、陽性血清分別用生理鹽水作1:20稀釋，備用。加樣：在凝集實驗反應(yīng)板上取三格，用毛細(xì)滴管分別加入稀釋待檢血清、陽性血清、陰性血清各50ul。然后每格加入鏈球菌溶血素“O”致敏乳膠顆粒試劑1滴。反應(yīng)：反應(yīng)板充分混勻后連續(xù)搖動2～3min后與對照比較，觀察結(jié)果。結(jié)果判斷“++++”全部膠乳凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明?！?++”大部分膠乳凝集，顆粒明顯，液體稍渾濁?！?+”約50%膠乳凝集，但顆粒較細(xì)，液體較渾濁“+”有少許凝集，液體呈渾濁?！?”液滴呈原有的均勻乳狀。出現(xiàn)“++”以上凝集判為陽性。間接乳膠凝集實驗的結(jié)果判斷實驗注意事項試劑應(yīng)充分搖勻。觀察結(jié)果應(yīng)及時，時間過長易造成假陽性。血清稀釋應(yīng)準(zhǔn)確，結(jié)果判斷應(yīng)仔細(xì)觀察。實驗中同時設(shè)置陰性、陽性及空白對照測定ASO濃度較高樣品時，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋后再分析，以保證結(jié)果的可靠性。?。。。?！全自動速率散射比濁方法

實驗原理可溶性抗原、抗體在液相中結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物而出現(xiàn)濁度。當(dāng)抗體保持中等過量時，形成的復(fù)合物隨抗原量增加，濁度也相應(yīng)增加。沿水平軸向反應(yīng)液照射一定波長的光，當(dāng)光線通過反應(yīng)體系時，由于抗原抗體復(fù)合物微粒子對光發(fā)生折射、反射及透射、使水平方向的光發(fā)生偏轉(zhuǎn)而產(chǎn)生散射光。光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長和反應(yīng)液中抗原抗體復(fù)合物的顆粒大小及多少密切相關(guān)。測定單位時間內(nèi)免疫復(fù)合物形成的最快時間段的散射信號值，當(dāng)抗體量大于抗原量時，形成的免疫復(fù)合物為小分子不溶性顆粒，產(chǎn)生的散射信號最強，形成的速率散射信號值也最大，儀器將測得的速率峰值轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的ASO濃度。試劑及器材1.全自動速率散射比濁儀2.待檢血清、儀器配套試劑3.試管、水浴箱、移液器、微量加樣器吸頭等操作步驟1.開機；相關(guān)參數(shù)設(shè)置；校準(zhǔn)。2.處理標(biāo)本，3500rpm離心l0min，分離血清。3.輸入杯號；選擇所測項目ASO；存盤；4.編程完畢后，將標(biāo)本放入標(biāo)本杯中，且放入標(biāo)本盤中相應(yīng)位置，將所做項目的試劑放入試劑盤中相位置，確認(rèn)無誤后，開始運行儀器。結(jié)果判斷全自動化散射比濁法：參考值范圍參見不同試劑盒。實驗討論乳膠凝集半定量實驗及全自動免疫比濁法定量檢測的特點？試應(yīng)用所學(xué)知識分析影響乳膠凝集試驗結(jié)果準(zhǔn)確性的因素及處理方法?？實驗四

梅毒螺旋體抗體檢測實驗?zāi)康?.掌握臨床常用檢測梅毒感染的方法及操作程序3.了解多種方法聯(lián)合檢測梅毒感染的臨床意義2.熟悉兩種方法的特點梅毒螺旋體感染的常用檢測方法TRUST（檢測非特異抗體）TPPA(檢測特異性抗體）ELISA(檢測特異性抗體）現(xiàn)癥梅毒的主要指標(biāo)同時是判斷治療效果、復(fù)發(fā)的指標(biāo)特異性強，準(zhǔn)確性高，但無法判斷是否為現(xiàn)癥梅毒敏感性高，有一定的假陽性率不同方法具有各自的特點梅毒感染檢測（一）TRUST實驗

實驗原理凝集法-檢測非特異性抗體+抗心類脂抗原反應(yīng)卡滴加血清產(chǎn)生凝集現(xiàn)象抗原中加入了甲苯胺紅染料，因甲苯胺紅顆粒均勻，結(jié)果易于觀察實驗試劑及器材1.實驗試劑甲苯胺紅溶液重懸的類脂抗原、陽性對照血清、陰性對照血清，2.實驗器材滴管、反應(yīng)紙卡操作步驟一、甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）

1.試劑及待檢血清室溫下平衡10min2.在樣本圈內(nèi)加入待檢血清及陰性、陽性血清，每圈50μl，盡量將血清鋪勻涂滿但不要超出卡圈3.垂直向血清中心加入抗原1滴（50μl）4.旋轉(zhuǎn)搖動卡片8分鐘后立即觀察結(jié)果加血清加抗原旋轉(zhuǎn)搖動觀察結(jié)果結(jié)果分析甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）陰性：呈現(xiàn)粉紅色均勻分散的沉淀物陽性：出現(xiàn)粉紅色凝集塊，根據(jù)凝集塊大小可以分為4個陽性級別（1+～4+）陰性陽性弱陽性實驗注意事項稀釋血清應(yīng)準(zhǔn)確及避免交叉污染及時觀察實驗結(jié)果抗體濃度過高可能發(fā)生前帶現(xiàn)象而致假陰性,若TPPA或ELISA檢測結(jié)果為陽性或弱陽性，需生理鹽水稀釋樣本后重復(fù)實驗。臨床意義

1.TRUST實驗為梅毒螺旋體感染的血清學(xué)過篩試驗，陰性不可排除感染，陽性需用特異性抗體的檢測方法進(jìn)行確認(rèn)。2.TRUST實驗對現(xiàn)癥梅毒的診斷具有較高價值，通過連續(xù)監(jiān)測抗體滴度能夠動態(tài)反映病程，此法在一期、二期梅毒的陽性率較高，與ELISA或TPPA檢測結(jié)果綜合分析能夠更準(zhǔn)確的診斷疾病。（二）TPPA法-檢測特異性抗體明膠顆粒間接凝集實驗（TPPA法)實驗試劑及器材1.實驗試劑血清稀釋液、致敏粒子、未致敏粒子以及其相應(yīng)的溶解液，陽性對照血清2.實驗器材專用滴管、反應(yīng)板、微量加樣器、微量加樣器吸頭、移液管管號1234567稀釋液(μl)100252525252525待檢血清(μl)25252525252525未致敏顆粒(μl)--25----致敏顆粒(μl)---25252525最終稀釋倍數(shù)--1:401:801:1601:3201:64012345未致敏顆粒致敏顆粒倍比稀釋血清TPPA法操作步驟結(jié)果分析

TPPA間接凝集實驗：1）反應(yīng)圖像的判定陰性（-）：粒子集中于孔底呈紐扣狀，呈現(xiàn)外周邊緣均勻平滑的圓圈弱陽性（+）：粒子形成小環(huán)狀，呈現(xiàn)外周邊緣均勻平滑的圓圈陽性（+）：粒子環(huán)明顯變大，其外周邊緣不均勻且雜亂地凝集在周圍。強陽性（++）：產(chǎn)生均勻的凝集，凝集粒子在底部整體上呈膜狀延展。2）最終判定基準(zhǔn)：未致敏粒子的反應(yīng)圖像應(yīng)為陰性。致敏粒子（最終稀釋度1:80及以上）反應(yīng)圖像為陽性，最終應(yīng)判定為陽性。反應(yīng)圖像為陽性的最終稀釋倍數(shù)作為抗體效價。

1:401:80未致敏顆粒陰性致敏顆粒陽性陽性對照最終判斷：陽性待檢血清注意事項1.試劑及檢測樣品應(yīng)充分混勻，及時更換加樣吸頭避免交叉污染。2.實驗中不能隨意移動反應(yīng)板，否則容易造成假陽性。3.保證足夠的反應(yīng)時間、及時觀察結(jié)果。4.陽性結(jié)果用另一種方法如ELISA法復(fù)查。臨床意義

梅毒螺旋體感染后2周左右患者血清中即可出現(xiàn)特異性IgM抗體，4周左右即可檢測出特異性IgG抗體，TPPA法為檢測特異性IgG抗體的較好方法之一，其陽性可以提示曾經(jīng)或現(xiàn)在感染梅毒，與TRUST法的檢測結(jié)果綜合分析對梅毒的診斷、分期及治療效果評價具有重要價值。實驗討論梅毒血清學(xué)的聯(lián)合應(yīng)用對梅毒診斷有何意義？？實驗討論TRUST法檢測非特異性抗體，是現(xiàn)癥梅毒患者實驗室診斷的重要指標(biāo)，但初期或晚期梅毒病人抗體濃度較低可出現(xiàn)假陰性，抗體濃度過高時出現(xiàn)前帶現(xiàn)象也可出現(xiàn)假陰性，而某些疾病如自身免疫性疾病則可出現(xiàn)假陽性。TRUST檢測的非特異性抗體在感染1-2周即可出現(xiàn)，如滴度≥1∶4，又具有典型的臨床表現(xiàn)，則現(xiàn)癥梅毒的可能性較大。需注意TRUST檢測結(jié)果陽性需謹(jǐn)慎對待，低滴度(≤1∶4)除可能為生物學(xué)造成的假陽性外，還有可能是發(fā)病初期或使用抗生素延長了陽性血清出現(xiàn)的潛伏期。TRUST滴度與病情活動呈正相關(guān)，并且可作為判定復(fù)發(fā)或再感染指征,對于高滴度者(≥1∶8)應(yīng)考慮為現(xiàn)癥梅毒病人，并結(jié)合臨床癥狀給予適當(dāng)治療。？實驗討論ELISA檢測梅毒抗體具有較高的敏感性，并可用全自動酶標(biāo)儀進(jìn)行批量初篩，但特異性稍差，有一定的假陽性率，采用ELISA兩步法可在一定程度上提高檢測結(jié)果的敏感性和可靠性。TPPA法特異性及敏感性均較高，可作為ELISA法及TRUST法篩查的確證實驗。但該方法操作復(fù)雜費時。ELISA和TPPA兩種方法檢測的梅毒抗體均為特異性抗體，該抗體即使經(jīng)治療后也可終生陽性，因此不能作為評價治療效果，復(fù)發(fā)或再感染的指標(biāo)。？實驗討論綜合應(yīng)用特異性抗體和非特異性抗體兩種方法檢測及滴度分析不僅能夠提高梅毒感染檢測的敏感性和特異性，同時能夠進(jìn)行療效觀察，對于早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷，早期治療梅毒患者以及有效控制梅毒流行具有重要意義。？實驗五

人類巨細(xì)胞病毒抗體IgM檢測實驗?zāi)康耐ㄟ^ELISA捕獲法檢測HCMV-IgM抗體的操作

掌握ELISA捕獲法檢測HCMV-IgM的實驗原理及操作程序熟悉方法的特點及應(yīng)用實驗原理用抗人IgM（u鏈）包被微孔板，與待檢血清反應(yīng)，使血清中所有IgM（特異性與非特異性IgM）均被捕獲，經(jīng)洗滌除去IgG，加入HCMV抗原，與固相上捕獲的特異性IgM結(jié)合，加入針對HCMV抗原的酶標(biāo)抗體形成固相二抗-IgM-抗原酶標(biāo)抗體復(fù)合物，在底物酶的作用下顯色，根據(jù)吸光度判斷是否存在HCMV特異性抗體IgM及抗體量。實驗試劑及器材1.實驗試劑抗CVBIgM陽性對照、陰性對照、弱陽性對照、血清，抗人IgM（u鏈），稀釋液，底物A、底物B，終止液。2.實驗器材包被有CVB抗原的微孔板、微量移液器、微量加樣器吸頭、試管、恒溫水浴箱操作步驟1.稀釋待測樣本2.溫育3.洗滌4.加抗原5.洗滌同步驟36.加酶結(jié)合物7.洗滌同步驟38.加酶底物/色原溶液9.加終止液10.酶標(biāo)儀測定吸光度值結(jié)果判斷采用反應(yīng)底物的最大吸收波長即（450nm）處測定各孔吸光度值。以樣本孔吸光度值（S）/陰性對照孔吸光度值（N）>1.0時判定為陽性。注意事項1.實驗中同時設(shè)置陰性、陽性、弱陽性、和空白對照。2.洗滌要嚴(yán)格按照要求，徹底洗滌，防止假陽性，但不可沖洗過猛過急導(dǎo)致假陰性。3.嚴(yán)格控制反應(yīng)時間和顯色時間。實驗討論1.捕獲法的靈敏度和特異性均強于間接法,請分析原因?捕獲法是以抗人IgM抗體(抗人μ鏈)作為固相抗體，當(dāng)加入血清標(biāo)本時，其中的IgM類抗體(特異的和非特異的)即可被固相抗體捕獲，而IgG則被洗去，再加入特異抗原可與固相上捕獲的特異性IgM抗體結(jié)合，而不與非特異性IgM結(jié)合，這樣非特異性IgM及IgG均被除去，排除了非特異性IgM等干擾因素。？實驗討論間接法易受RF因子及非特異性IgM的影響。間接法測定時，血清中特異的IgG與包被的特異性抗原結(jié)合，而后與RF反應(yīng)造成假陽性。同時，特異性的IgG能與IgM競爭結(jié)合特異性抗原而造成假陰性。捕獲法利用抗人IgMμ鏈直接從被檢血清中捕獲IgM,再進(jìn)行特異性結(jié)合，避免了RF等干擾物質(zhì)的影響，具有更強的特異性。？實驗討論

請結(jié)合所學(xué)知識，分析酶聯(lián)免疫技術(shù)中其他方法的優(yōu)點及缺陷。？病案討論患者，男，49歲主訴“右上腹隱痛、腹脹隱痛8年，反復(fù)牙齦出血2年”體格檢查：鞏膜黃染，腹壁靜脈曲張，肝臟于肋下4橫指可觸及，質(zhì)硬，壓痛，腹水征陽性。CT示：肝左葉大，肝裂增寬。實驗室檢查：HGB:115g/L，WBC：5.4X109/L，NEU:41.6%，LYM:57.3%,PLT：96X109/L血清抗HCV抗體：陽性，HCV-RNA：9.26X104copies/ml,其余肝炎病毒血清標(biāo)志物檢查均為陰性，肝功能：ALB:29.6g/L，GLB:37.4g/LA/G:0.8，PA:54mg/L，ALT:146U/L，AST:249U/L，ALP:213U/L，r-GGT:169U/L，CHE:1858U/L，TBA:130.4umol/L，T-Bil:46.1mmol/L,D-Bil：26.8mmol/L，LDH:,337U/L,a-HBD:234U/L。問題：

請結(jié)合以上資料，分析該患者可能的診斷及實驗室診斷依據(jù)？病例一患者右上腹隱痛不適、腹脹8年，肝脾腫大，腹壁靜脈曲張，腹水征陽性，提示存在門脈高壓，伴腹水，肝臟血清酶增高明顯，膽紅素升高；應(yīng)考慮肝硬化或肝癌。近兩年反復(fù)出現(xiàn)牙齦出血，考慮因肝臟合成凝血因子減少以及脾功能亢進(jìn)致血小板減少導(dǎo)致凝血功能障礙所致。提示肝臟功能已經(jīng)失代償，出現(xiàn)肝功能嚴(yán)重受損的各種癥狀。丙型肝炎病毒抗體陽性，HCV-RNA拷貝數(shù)高，提示病因為丙型肝炎病毒感染，肝脾增大，影像學(xué)檢查無肝內(nèi)占位性病變，可排除肝癌。診斷：丙型肝炎后肝硬化肝功能失代償期。

答案提示患者，女性，25歲，主訴“會陰部皮疹3月余，全身皮疹伴腹股溝淋巴結(jié)腫大半月余”體格檢查：肛門周圍及外陰部大小陰唇間有隆起的丘疹，部分融合，表面平坦，表面濕爛，有少許滲出液。雙側(cè)下頜、頸前、腹股溝處可捫及多個拇指大小腫大淋巴結(jié)，輕壓痛。實驗室檢查：血清TRUST陽性，TPPA陽性，滴度為1:640，宮頸分泌物查衣原體抗體陰性，腦脊液TPPA陰性。