免疫組化方法研究女性胎兒尿道括約肌的神經(jīng)支配【摘要】目的探討支配女性尿道括約肌神經(jīng)纖維的定位、定量及定性。方法12例21周至40周的女性胎兒尿道，分別進(jìn)行石蠟包埋、膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(cholineacetylcatransferase,CHAT)及神經(jīng)肽Y(neuropeptideY,NPY)免疫組化染色，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行半定量和定量分析。結(jié)果從尿道內(nèi)口至外口，神經(jīng)肽Y陽(yáng)性區(qū)域顯色范圍逐漸變小、強(qiáng)度減弱，膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶陽(yáng)性區(qū)域主要位于尿道中三分之一，統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異。結(jié)論尿道括約肌的膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶及神經(jīng)肽Y免疫組化染色對(duì)理解參與控尿的尿道括約肌神經(jīng)支配提供了很有價(jià)值的幫助。

【關(guān)鍵詞】控尿神經(jīng)支配尿道括約肌免疫組織化學(xué)

Innervationofthefemalehumanfetusurethralsphincterbyimmunohistochemicalstudies

ABSTRACT:ObjectiveToexplorethelocation,quantityandnatureofnervefibersinnervatingtheurethralsphincter.MethodsUrethraof12femalehumanfetusesbetween21and40weeksofgestationweretreatedbyparaffinembeddedwithcholineacetylcatransferase(CHAT)andneuropeptideY(NPY)immunohistochemicalstaining.Thestainingresultswereanalyzedquantitativelyandsemiquantitatively.ResultsFromtheurethrainternalorificetoexternalorifice,thepositiveregionofNPYbecamesmallerandthedensitythinner;thepositiveregionofCHATwasmainlylocatedinthemiddlepartofarethra,andtherewasstatisticallysignificantdifferencebetweenthem.ConclusionTheimmunohistochemicalstainingofcholineacetylcatransferaseandneuropeptideYintheanatomicalstructuresoftheurethralsphincterprovidesabetterunderstandingoftheoriginandnatureoftheinnervationparticipatinginurinarycontinence.

KEYWORDS:urinarycontinence;innervation;urethralsphincter;immunohistochemitry

女性尿道括約肌的內(nèi)在機(jī)制是由平滑肌和橫紋肌成分組成，它們各自接受相互獨(dú)立的神經(jīng)支配，這些機(jī)制目前尚不十分清楚[1]。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為女性尿道括約肌是由來(lái)自陰部神經(jīng)(軀體神經(jīng))和盆叢(自主神經(jīng))的神經(jīng)纖維共同支配，但有關(guān)女性尿道括約肌及其支配神經(jīng)精確的定位、定量及定性方面的研究在國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)染色及顯微圖像分析技術(shù)，對(duì)國(guó)人正常女性胎兒尿道的膽堿能及腎上腺素能神經(jīng)進(jìn)行定位、定量研究，從而探討它們?cè)诳啬蚍矫娴淖饔谩?/p>

1資料與方法

資料選取12個(gè)正常女性胎兒，21-40周胎齡。測(cè)其冠臀長(zhǎng)度為165-340mm，胎兒死亡1h內(nèi)完整取下尿道，尿道長(zhǎng)度為9-15mm，另取成人新鮮大腦皮質(zhì)及腎上腺髓質(zhì)標(biāo)本做陽(yáng)性對(duì)照，以上標(biāo)本均經(jīng)40g/L多聚甲醛固定后石蠟包埋。

我們應(yīng)用12個(gè)21-40周胎齡的女性胎兒尿道，是因?yàn)樘涸谌焉?5周時(shí)橫紋肌和平滑肌之間已顯示出明顯的區(qū)別，這個(gè)階段的胎兒能夠在肉眼下解剖，括約肌的基本類型已經(jīng)建立。

試劑和儀器NPY多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物制藥有限公司，CHAT多克隆抗體及ABC檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Biogenexi6000全自動(dòng)免疫組化染色系統(tǒng)由廣州新捷儀器有限公司生產(chǎn)，Quantimet970型顯微圖像分析儀產(chǎn)自英國(guó)劍橋儀器公司。

方法

制作切片將石蠟包埋的女性尿道標(biāo)本從內(nèi)口至外口做連續(xù)切片，片厚4μm，根據(jù)尿道長(zhǎng)度平均分成8個(gè)截面，加之內(nèi)、外口，每個(gè)截面各取2張切片，分別做CHAT和NPY染色。

免疫組化染色常規(guī)ABC法。切片脫蠟至80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，甲醇H2O2溶液中震蕩10min，置于枸櫞酸鹽緩沖液中，微波爐加熱12min，溫度在96℃左右，取出后自然冷卻(抗原修復(fù))。一抗分別為多克隆抗CHAT抗體及多克隆抗NPY抗體，濕盒內(nèi)孵育60min，二抗37℃30min，三抗37℃50min，DAB液顯色約8min。以成人大腦皮質(zhì)作CHAT的陽(yáng)性對(duì)照，成人腎上腺髓質(zhì)作NPY的陽(yáng)性對(duì)照，以TBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。一抗稀釋度為1∶200。

觀察指標(biāo)采用半定量的方法根據(jù)免疫組化反應(yīng)呈色深淺及反應(yīng)顆粒多少，將酶活性反應(yīng)強(qiáng)度分為：(-)陰性，(+)陽(yáng)性，()中等陽(yáng)性，()強(qiáng)陽(yáng)性，四個(gè)級(jí)度，將其用數(shù)字化表示分別為0-3，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

切片中CHAT及NPY陽(yáng)性區(qū)域顯色為棕黃色至棕褐色，經(jīng)顯微攝像掃描后，將圖像輸入計(jì)算機(jī)，采用顯微圖像分析技術(shù)對(duì)計(jì)算機(jī)圖像進(jìn)行定量分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，統(tǒng)計(jì)分析采用軟件包，兩樣本均數(shù)差別應(yīng)用t檢驗(yàn)，為差異有顯著性。

2結(jié)果

觀察21-40周女性胎兒尿道的組成，可見(jiàn)胎兒尿道已具有三層基本結(jié)構(gòu)，發(fā)育良好：內(nèi)層為充滿皺折的黏膜，中間為黏膜下血管組織，外層為纖維肌肉鞘，由平滑肌和橫紋肌彈性組織組成。

腎上腺素能神經(jīng)的分布NPY免疫組化染色分析提示，交感神經(jīng)介質(zhì)NPY免疫組化陽(yáng)性纖維呈棕黃色，多位于血管壁中層平滑肌細(xì)胞間和神經(jīng)束中，在部分細(xì)小動(dòng)脈壁可觀察到較粗大的陽(yáng)性纖維。從尿道內(nèi)口至外口，NPY染色陽(yáng)性區(qū)域(尿道平滑肌)逐漸變小，顏色變淺，至外口處幾乎完全消失(圖1)。將NPY免疫組化反應(yīng)強(qiáng)度“0-3”數(shù)字化后結(jié)果可見(jiàn)：近1/3與遠(yuǎn)1/3，中1/3與遠(yuǎn)1/3之間差異均有顯著性()，但近1/3與中1/3之間差異無(wú)顯著性(，表1)。

圖112例女性胎兒尿道免疫組化染色分析(半定量)

膽堿能神經(jīng)的分布從CHAT免疫組化反應(yīng)染色分析可見(jiàn)女性胎兒尿道的中間1/3染色最強(qiáng)，近端1/3次之，遠(yuǎn)端1/3最弱。將CHAT免疫組化反應(yīng)強(qiáng)度“0-3”數(shù)字化后結(jié)果可見(jiàn)：遠(yuǎn)、中、近端三者差異均具有顯著性(，表1)，在膀胱頸部和尿道近1/3橫紋肌纖維很少。

表1女性尿道NPY與CHAT免疫組化分析結(jié)果

注：近1/3是指圖1中從內(nèi)口至2；中1/3是圖1中從3至5；遠(yuǎn)1/3是圖1中從6至8.與遠(yuǎn)1/3比較*；與中1/3比較Δ

3討論

關(guān)于此項(xiàng)研究?jī)?nèi)容，國(guó)外的研究結(jié)果并不完全相符，甚至結(jié)論互相矛盾。女性尿道的復(fù)雜結(jié)構(gòu)組成了混合的神經(jīng)支配：自主神經(jīng)支配平滑肌，軀體神經(jīng)支配橫紋肌，自主神經(jīng)和感覺(jué)神經(jīng)支配黏膜和黏膜下組織。平滑肌和橫紋肌的連接也非常緊密，使得識(shí)別支配每種肌肉結(jié)構(gòu)的神經(jīng)纖維變得非常困難。

女性尿道的尿道內(nèi)括約肌主要由交感、副交感神經(jīng)支配，尿道外括約肌主要由軀體神經(jīng)支配，其中交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)節(jié)前纖維為腎上腺素能神經(jīng)，副交感神經(jīng)節(jié)后纖維和軀體神經(jīng)為膽堿能神經(jīng)，其神經(jīng)纖維末稍釋放乙酰膽堿，作用于尿道外括約肌的N型膽堿能受體，引起該肌收縮，阻止尿液排出。

乙酰膽堿作為神經(jīng)遞質(zhì)，作用于靶受體發(fā)揮作用。膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶是膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志酶，是乙酰膽堿的合成酶，分布在膽堿能神經(jīng)元和纖維內(nèi)；腎上腺素能神經(jīng)釋放單胺類遞質(zhì)，故可以用顯示單胺類遞質(zhì)的方法來(lái)研究腎上腺素能神經(jīng)纖維的分布，神經(jīng)肽Y(NPY)是腎上腺素能神經(jīng)的標(biāo)志性神經(jīng)肽。應(yīng)用免疫組化染色來(lái)研究?jī)煞N神經(jīng)遞質(zhì)含量的多少，可說(shuō)明神經(jīng)的興奮性高低，能充分反映神經(jīng)的功能,是了解膽堿能、腎上腺素能神經(jīng)及其所支配器官的重要方法。

本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)尿道肌肉組織進(jìn)行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)分析顯示，在女性胎兒尿道的膀胱頸及近端三分之一，橫紋肌纖維相對(duì)較少，這與Borirakchanyavat等的觀點(diǎn)相矛盾，他們發(fā)現(xiàn)胎兒的橫紋肌纖維出現(xiàn)在尿道的近端及中間三分之一處，認(rèn)為胎兒尿道的橫紋括約肌向近端延伸，這些纖維在后側(cè)表面是不完整的。

Stolzenburg等認(rèn)為女性膀胱逼尿肌止于尿道內(nèi)口，與尿道無(wú)任何延續(xù)，尿道平滑肌的內(nèi)縱肌在近端三分之一開(kāi)始變薄，遠(yuǎn)端三分之二逐漸消失，外縱肌多數(shù)在尿道內(nèi)口處消失，中間環(huán)形肌則在近端三分之一形成強(qiáng)大的環(huán)形平滑肌括約肌。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)平滑肌標(biāo)志性抗體(NPY)免疫組織化學(xué)染色證實(shí)，該括約肌向遠(yuǎn)端尿道逐漸減少，開(kāi)始減少處恰好為橫紋括約肌可檢測(cè)的部位。在中間三分之一尿道平滑肌和橫紋括約肌環(huán)繞整個(gè)尿道，平滑肌在尿道遠(yuǎn)端三分之一處消失。橫紋括約肌開(kāi)始于尿道近端三分之一的遠(yuǎn)端，位于平滑肌的外側(cè)，向遠(yuǎn)端逐漸增厚。

本實(shí)驗(yàn)研究還從CHAT及NPY免疫組化染色分析中發(fā)現(xiàn)女性胎兒尿道的中間1/3染色最強(qiáng)，在女性胎兒尿道的平滑肌與橫紋括約肌之間并沒(méi)有明顯的界限，在尿道中三分之一處可清楚地看到平滑肌和橫紋肌纖維互相交錯(cuò)分布，逐漸過(guò)渡，形成所謂的尿道括約肌復(fù)合體，是女性重要的控尿機(jī)制。Stein等通過(guò)尿動(dòng)力學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，女性患者全膀胱切除術(shù)后施行原位尿流改道，其控尿功能完全依靠橫紋括約肌，雖然尿道長(zhǎng)度縮短了，最大尿道壓下降12cmH2O，卻仍能有效地控制排尿。

Rother等認(rèn)為女性尿道的平滑肌具有括約肌作用，主要在持續(xù)控尿過(guò)程中發(fā)揮作用，能夠控制尿道的關(guān)閉。橫紋括約肌可以隨意中斷排尿、對(duì)抗壓力性尿失禁，橫紋括約肌在中間三分之一處最厚并且環(huán)繞尿道，并可見(jiàn)到平滑肌纖維與橫紋肌纖維交錯(cuò)移行。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化方法研究了12例21-40周胎齡的正常女性胎兒尿道，結(jié)果表明膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶及神經(jīng)肽Y陽(yáng)性區(qū)域主要位于尿道中三分之一，是膽堿能及腎上腺素能神經(jīng)遞質(zhì)集中的部位，在女性尿道的控尿功能中發(fā)揮著極其重要的作用。這些知識(shí)有助于提高膀胱切除手術(shù)后保留尿道的控尿功能質(zhì)量，也有助于理解控尿機(jī)制、對(duì)女性尿失禁進(jìn)行更有效的管理。

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