胚胎試驗(yàn)在水生動(dòng)物中的應(yīng)用第1頁(yè)/共49頁(yè)建立靈敏、簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)方法急性暴露試驗(yàn)雖然簡(jiǎn)便易行，但是其檢測(cè)指標(biāo)過(guò)于簡(jiǎn)單。各種慢性毒性試驗(yàn)雖然提供多個(gè)檢測(cè)終點(diǎn)，但存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、費(fèi)用高等不足。而水生生物胚胎試驗(yàn)具有成本低、影響因素少、靈敏度高等方面的優(yōu)勢(shì)，受試物種也由最初的魚類向多樣化發(fā)展，其應(yīng)用日益廣泛。第2頁(yè)/共49頁(yè)魚類成體和胚胎試驗(yàn)靈敏度比較第3頁(yè)/共49頁(yè)胚胎試驗(yàn)胚胎試驗(yàn)是又稱胚胎毒性試驗(yàn)或胚胎致畸試驗(yàn)，指通過(guò)把胚胎暴露于受試化學(xué)物質(zhì)而受到毒害作用，繼而影響胚胎的發(fā)育、導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯或胚胎畸形。廣義上的胚胎試驗(yàn)包括所有以胚胎為材料的生物學(xué)試驗(yàn)，其內(nèi)容涵蓋形態(tài)學(xué)、發(fā)育學(xué)、毒理學(xué)、行為學(xué)等方面。第4頁(yè)/共49頁(yè)魚類

魚類因具有繁殖力高、體外產(chǎn)卵、體外受精等生殖特性成為胚胎試驗(yàn)的最主要材料。第5頁(yè)/共49頁(yè)用于胚胎試驗(yàn)的一些種類第6頁(yè)/共49頁(yè)斑馬魚

在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)單一物質(zhì)的毒性評(píng)價(jià)往往使用特定的種類，斑馬魚是其中一個(gè)重要代表。歐洲和美國(guó)都有已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)方法。第7頁(yè)/共49頁(yè)Zebrafish(Daniorerio)第8頁(yè)/共49頁(yè)第9頁(yè)/共49頁(yè)甲殼類——草蝦

草蝦屬?gòu)V鹽性甲殼動(dòng)物(3-31ppt)。分布廣(遍布美國(guó)東海岸和墨西哥灣的廣大河口)。個(gè)體小，只要水溫，光照條件適宜，成體在實(shí)驗(yàn)室容易繁殖，只需分離不同發(fā)育階段的胚胎即可用于試驗(yàn)。盡管雌體產(chǎn)卵后抱卵于腹部直至孵化，胚胎離體后同樣可以正常發(fā)育至孵化，卵外被膜、胚胎透明而易于觀察形態(tài)異常。第10頁(yè)/共49頁(yè)Grassshrimp(Palaemonetespugio)第11頁(yè)/共49頁(yè)第12頁(yè)/共49頁(yè)Grassshrimp(Palaemonetespugio)第13頁(yè)/共49頁(yè)其它動(dòng)物

TheFrogEmbryoTeratogenesisAssay-Xenopus(FETAX)——爪蟾ASTME1563-98:StandardguideforConductingStaticAcutetoscicityTestswithEchinoidEmbryos——海膽

第14頁(yè)/共49頁(yè)Medaka(Oryziaslatipes)第15頁(yè)/共49頁(yè)Bluecrab(Callinectessapidus)第16頁(yè)/共49頁(yè)試驗(yàn)動(dòng)物的選取被廣泛利用在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)容易大量培養(yǎng)具有代表性和對(duì)受試物的敏感性遺傳背景清楚試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)也有相應(yīng)的規(guī)范第17頁(yè)/共49頁(yè)胚胎來(lái)源多數(shù)魚類產(chǎn)卵后離體孵化，易于收集。一般可采用親魚人工催產(chǎn)結(jié)合人工受精的方法獲得。對(duì)于如斑馬魚，青鳉等小型種類，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)養(yǎng)殖相對(duì)容易，只需控制適當(dāng)?shù)奈锢項(xiàng)l件，一般都能在試驗(yàn)當(dāng)天取到足夠數(shù)量的受精卵。第18頁(yè)/共49頁(yè)野外試驗(yàn)收集魚卵在實(shí)驗(yàn)室完成剩余的發(fā)育過(guò)程，檢測(cè)多個(gè)終點(diǎn)指標(biāo)。原位暴露在室內(nèi)得到受精卵，用適當(dāng)?shù)难b置放置于待檢測(cè)的地點(diǎn)，全部發(fā)育過(guò)程或絕大部分發(fā)育過(guò)程在野外完成。有抱卵習(xí)性的甲殼動(dòng)物，胚胎在母體腹部附肢發(fā)育成幼體，通過(guò)捕撈帶卵的母體，分離胚胎。第19頁(yè)/共49頁(yè)分類胚胎試驗(yàn)同樣可分成急性毒性試驗(yàn)和亞急性毒性試驗(yàn)。急性毒性試驗(yàn)時(shí)間較短，其目的是獲得有關(guān)受試物的初步毒性信息；亞急性毒性試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，可以貫穿胚胎發(fā)育的整個(gè)時(shí)期。暴露途徑可分為靜態(tài)，半靜態(tài)和流動(dòng)等，或微注射的途徑。第20頁(yè)/共49頁(yè)容器透明的試驗(yàn)容器通常是首選，燒杯、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)管是最普通的工具。在野外暴露試驗(yàn)中，有黏性的受精卵可以被直接負(fù)在載玻片上，后者固定在特制的容器里。第21頁(yè)/共49頁(yè)第22頁(yè)/共49頁(yè)第23頁(yè)/共49頁(yè)溶劑有機(jī)物質(zhì)水溶性較差，則需要化學(xué)溶劑來(lái)助溶，但不適當(dāng)?shù)娜軇?huì)影響結(jié)果的可靠性，化學(xué)溶劑本身對(duì)胚胎具有毒性甚至?xí)褪茉囄锂a(chǎn)生協(xié)同作用，因此，選用適當(dāng)?shù)娜軇┮约斑m當(dāng)?shù)臐舛葘?duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性都是有益的。乙醇，丙酮，二甲亞砜是常用的溶劑，終濃度一般在0.1%以下。第24頁(yè)/共49頁(yè)0.5%(V/V)乙醇1%(V/V)乙醇對(duì)照Grassshrimp(Palaemonetespugio)第25頁(yè)/共49頁(yè)檢測(cè)終點(diǎn)半致死濃度（LC50）形態(tài)異常孵化延遲生化指標(biāo)遺傳物質(zhì)生長(zhǎng)指標(biāo)第26頁(yè)/共49頁(yè)半致死濃度（LC50）

半致死濃度（LC50）死亡是檢測(cè)的可見(jiàn)終點(diǎn)，初步反映受試物的毒性，是急性毒性試驗(yàn)的常用指標(biāo)。孵化也可作為終點(diǎn)來(lái)反映受試物毒性，指標(biāo)采用半效應(yīng)濃度（EC50）。在發(fā)育早期可以胚胎完整性來(lái)判斷存活與否，當(dāng)器官出現(xiàn)后則用器官的運(yùn)動(dòng)作為標(biāo)準(zhǔn)。第27頁(yè)/共49頁(yè)形態(tài)異常

形態(tài)異常是胚胎致畸試驗(yàn)的核心內(nèi)容。斑馬魚和爪蟾胚胎發(fā)育過(guò)程中有多種可以觀察的反應(yīng)指標(biāo)，被列入標(biāo)準(zhǔn)方法的觀察終點(diǎn)。對(duì)于甲殼動(dòng)物，常見(jiàn)的觀察結(jié)構(gòu)有眼、卵黃形狀、心臟、頭部、肝胰腺。發(fā)育異常往往會(huì)導(dǎo)致導(dǎo)致終止發(fā)育或發(fā)育延遲，進(jìn)而推遲孵化時(shí)間。第28頁(yè)/共49頁(yè)第29頁(yè)/共49頁(yè)第30頁(yè)/共49頁(yè)B=brain;C=chorda;Ch=chorion;E=ear;Ed=edema;Eud=earunderdeveloped;Ey=eye;Eyud=eyeunderdeveloped;NC=negativecontrol;Tnd=tailnotdetached;woEy=withouteyes;woH=withouthead;woS=withoutsomites第31頁(yè)/共49頁(yè)Catfish(Clariasgariepinus)

對(duì)照Cd和Cu第32頁(yè)/共49頁(yè)1%(V/V)乙醇對(duì)照Grassshrimp(Palaemonetespugio)第33頁(yè)/共49頁(yè)孵化延遲Grassshrimp(Palaemonetespugio)第34頁(yè)/共49頁(yè)生化指標(biāo)

隨著胚胎發(fā)育的深入，器官逐漸建成，一些酶活性也顯示出來(lái)，在暴露條件下酶活性的改變也可作為檢測(cè)終點(diǎn)；受試物既可抑制酶活性，也可使一些酶出現(xiàn)應(yīng)激性增強(qiáng)。第35頁(yè)/共49頁(yè)Grassshrimp(Palaemonetespugio)第36頁(yè)/共49頁(yè)受試物及其代謝物還可能對(duì)遺傳物質(zhì)產(chǎn)生影響第37頁(yè)/共49頁(yè)Grassshrimp(Palaemonetespugio)第38頁(yè)/共49頁(yè)生長(zhǎng)指標(biāo)Catfish(Clariasgariepinus)Pacficherring(Clupeapallasi)第39頁(yè)/共49頁(yè)應(yīng)用現(xiàn)狀單一化學(xué)品毒性環(huán)境檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)土壤、沉積物污染。石油降解產(chǎn)物；溢油事件的生態(tài)恢復(fù)研究?；旌闲怨I(yè)生產(chǎn)廢水，生活污水的毒性，特別是致畸效應(yīng)，被用于探討遺傳毒性。第40頁(yè)/共49頁(yè)第41頁(yè)/共49頁(yè)第42頁(yè)/共49頁(yè)發(fā)展前景盡管胚胎試驗(yàn)有著高重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)，但試驗(yàn)材料和檢測(cè)指標(biāo)的選取都會(huì)影響到試驗(yàn)的結(jié)果。不同發(fā)育階段的材料應(yīng)選取適當(dāng)?shù)闹笜?biāo)，因不同發(fā)育階段的胚胎對(duì)同一毒物具有不同的敏感度。各國(guó)研究者正在進(jìn)一步建立和完善針對(duì)更多的試驗(yàn)材料的胚胎試驗(yàn)，以滿足各種生態(tài)環(huán)境的評(píng)估。隨著多學(xué)科專業(yè)相互滲透的加深，工具日益完善，