第四章基因克隆的載體第1頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二第2頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

載體（vector）是由在細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的ＤＮＡ分子構(gòu)成的一種遺傳成分，通過實驗手段可使其它的ＤＮＡ片段連接在它的上面，而進(jìn)行復(fù)制，作為基因工程的載體，必須具備以下幾個性能：第3頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二1、分子較小，可攜帶比較大的ＤＮＡ片段。2、能獨立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。3、要有盡可能多種限制酶的切割位點，但每一種限制酶又要最少的切割位點（多克隆位點multiplecloningsites，MCS）。4、有適合的標(biāo)記，易于選擇。5、有時還要求載體要能啟動外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。6、從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實驗室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。第4頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二功能克隆載體:

克隆一個基因或DNA片斷表達(dá)載體:

用于一個基因的蛋白表達(dá)整合載體:

把一個基因插入到染色體組中第5頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二來源：

質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體真核細(xì)胞克隆載體第6頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體〉1000kb病毒載體動物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒載體的種類和特征第7頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二1.質(zhì)粒（plasmid）載體

質(zhì)粒是一種獨立于染色體外的小分子環(huán)狀DNA，一般大小約106～108D，可自身復(fù)制和表達(dá)，有的質(zhì)粒還帶有可做為選擇性標(biāo)記的抗藥性基因，所以質(zhì)粒經(jīng)過適當(dāng)改選后便可成為良好的載體。作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適當(dāng)改造而成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的質(zhì)粒載體。第8頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

質(zhì)粒（plasmid）是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA

分子。大小約為數(shù)千堿基對。常有1～

3個抗藥性基因，以利于篩選。第9頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體允許外源的DNA插入，儲存。主要是DNA水平上的操作?；虮磉_(dá)的質(zhì)粒載體允許外源DNA的插入、儲存和表達(dá)。第10頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二1.1質(zhì)粒的生物學(xué)特性：

1、質(zhì)粒DNA的構(gòu)型：

SC型共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA）

OC型開環(huán)DNA（ocDNA）

L型線性DNA（cDNA）2、不同質(zhì)粒的分子量大小差異相當(dāng)顯著：

106～108D

3、作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分：

復(fù)制基因（replicator）、選擇性記號、克隆位點

第11頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二LOCSC第12頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二4、質(zhì)粒DNA編碼著一些重要的非染色體控制的遺傳性狀。

抗性特征、代謝特征、修飾寄主生活方式的因子都等5、質(zhì)粒DNA的類型：

接合型和非接合型；含大腸桿菌素Col質(zhì)粒和含抗菌素抗性基因的R質(zhì)粒；F因子和F`因子等。按接合轉(zhuǎn)移功能分類主要基因按抗性記號分類非接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，長生大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子)

接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，細(xì)菌染色體區(qū)段F質(zhì)粒（F因子）自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子)自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Ent質(zhì)粒第13頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二6、質(zhì)粒DNA的復(fù)制類型：

低拷貝的質(zhì)粒（1～3）：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（接合型）高拷貝的質(zhì)粒（10~60）：松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（非接合型）

7、質(zhì)粒的不親合性

在同一個大腸桿菌細(xì)胞，一般不能同時含有兩種不同的。也稱為質(zhì)粒的不相容性:

是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。質(zhì)粒的不親合性分子基礎(chǔ)，主要是由于它們在復(fù)制功能之間的相互干擾造成的。第14頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二第15頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二1.2質(zhì)粒DNA的分離與純化

1、氯化銫密度梯度離心法

2、堿變性法

第16頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二1.2.1氯化銫密度梯度離心法1、質(zhì)粒DNA占總DNA的1%～2%；2、在細(xì)胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細(xì)菌染色體易斷裂成線性片斷，而質(zhì)粒DNA分子量小，結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整的狀態(tài)；3、染色劑溴化乙錠（EB）能摻入到DNA鏈的堿基中，導(dǎo)致鏈的解旋；而且形成的EB-DNA復(fù)合物中，EB含量越高，密度會越低。第17頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二流程：首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（SDS）來促進(jìn)大腸桿菌的細(xì)胞裂解。將溴化乙錠的氯化銫溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中，EB會嵌入到DNA鏈的堿基中去。在EB達(dá)到飽和時，進(jìn)行氯化銫密度梯度離心。

第18頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二第19頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二第20頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二1.2.2堿變性法：

根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來的。在PH值12.0～12.5范圍內(nèi)時，線性的DNA會被變性而共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會被變性。通過冷卻或恢復(fù)中性PH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速復(fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA第21頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二流程：1、取1.5毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，加在微量離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀；2、加入100微升冰冷的液，（50mM葡萄糖，25mMTris-HClPH=8.0,10mMEDTA，4～5mg溶菌酶）靜置5分鐘；3、加入200微升微冷的液（0.2NaOH，1.0%SDS）緩緩混勻置室溫5分鐘。

65度水浴一段時間會加強(qiáng)染色體DNA的變性作用。4、加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸鈉，振蕩后，冰浴5分鐘。5、離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒DNA第22頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二1.2.3影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素：

1）、寄主菌株的遺傳背景使用endA基因發(fā)生突變的菌株，編碼核酸內(nèi)切酶從野生型的菌株中提取質(zhì)粒須采取的措施：

選擇最適的培養(yǎng)條件，以限制在細(xì)胞生長期間，體內(nèi)核酸內(nèi)切酶的表達(dá)；在純化質(zhì)粒DNA的過程中，用加熱法核酸內(nèi)切酶使失活；采用最佳的實驗流程，減少核酸內(nèi)切酶的污染并在純化了質(zhì)粒DNA之后，迅速除去污染的核酸酶。第23頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

2）、質(zhì)粒的拷貝數(shù)及分子的大小插入分子量大的外源DNA會引起質(zhì)?？截悢?shù)的下降。第24頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二1.3質(zhì)粒載體的構(gòu)建與類型

天然質(zhì)粒：沒有經(jīng)過以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒。在大腸桿菌中，常見的可用于基因克隆的天然質(zhì)粒有EolE1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。

第25頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，它含有一個EcoR酶切位點，一個四環(huán)素抗性選擇記號（Tetr

），插入外源片斷后不影響其復(fù)制功能，但該質(zhì)粒分子量較大，拷貝數(shù)低只具有抗菌素抗性基因，無法使用插入失活技術(shù)選擇重組分子。第26頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

ColE1質(zhì)粒在其唯一的單切割位點EcoRl中克隆外源DNA片斷后，可根據(jù)對大腸桿菌素E1的免疫性選擇轉(zhuǎn)化子，不能合成大腸桿菌素E1的菌落是具有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。但對大腸桿菌素E1的免疫篩選，在化學(xué)上是相當(dāng)麻煩的。第27頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二1.4質(zhì)粒載體必須具備的基本條件(1)、具有復(fù)制起點；

自我增值的基本條件，一般具一個復(fù)制子。(2)、具有抗菌素抗性；

理想的質(zhì)粒載體具有兩種抗菌素抗性基因。(3)、具有若干限制酶切單一位點（CMS）；(4)、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。

低分子量的質(zhì)粒易于操作，克隆外源片斷后仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞同時低分子量的質(zhì)粒對限制酶具有多重識別位點的幾率也較低；較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基因第28頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

以Ampr和Tetr為選擇性標(biāo)記，克隆位點在這兩個選擇性標(biāo)記的單酶切位點上。選擇AmprTets或AmpsTetr的重組子。（4363bp）第29頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

1.4.1.質(zhì)粒載體的選擇記號新陳代謝特性；對大腸桿菌素E1的免疫性；抗菌素抗性；

四環(huán)素抗性、氨芐青霉素抗性、鏈霉素抗性、卡那霉素抗性大多數(shù)質(zhì)粒本身帶有抗菌素基因；抗菌素抗性記號便于操作、易于選擇。第30頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二1.5不同類型的質(zhì)粒載體高拷貝的質(zhì)粒載體克隆的目的是為分離大量的高純度的克隆基因低拷貝的質(zhì)粒載體有些克隆的編碼基因，其產(chǎn)物含量過高會嚴(yán)重的干擾寄主細(xì)胞的正常新陳代謝活動。編碼表面結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一些基因、調(diào)節(jié)細(xì)胞基礎(chǔ)代謝活動的蛋白質(zhì)編碼基因以及囊纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因等。第31頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

(1)失控的質(zhì)粒載體

復(fù)制控制是溫度敏感型的低拷貝的質(zhì)粒。Example：

pBEU1和pBEU2質(zhì)粒，在30度下，每個寄主細(xì)胞只含有適量的拷貝數(shù)，當(dāng)培養(yǎng)溫度超過35度時，質(zhì)粒的復(fù)制將失去控制，每個細(xì)胞中的拷貝數(shù)便持續(xù)上升。在這種高溫環(huán)境下，細(xì)胞的生長和蛋白質(zhì)的合成可按正常的速率持續(xù)2～3小時。最后得到超量的基因編碼產(chǎn)物，細(xì)胞生長受抑制失去存活能力，積累的質(zhì)粒DNA占細(xì)胞總DNA的50%。第32頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

(2)插入失活型質(zhì)粒載體

將外源DNA片斷插入在質(zhì)粒上會導(dǎo)致選擇記號基因失活的位點，就有可能通過抗菌素抗性的篩選，大幅度的提高獲得陽性克隆的機(jī)會。Example：在pBR329質(zhì)粒載體的EcoR1位點插入外源片斷，會使氯霉素抗性基因失活，在篩選的氯霉素敏感的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞群體中，含有插入片斷的重組體質(zhì)粒的幾率會顯著上升。

第33頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二(3)正選擇的質(zhì)粒載體

正向選擇：應(yīng)用只有突變體或重組體才能正常生長的培養(yǎng)條件進(jìn)行選擇。這種質(zhì)粒載體具有直接選擇記號并可賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。第34頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二Example：

質(zhì)粒pKN80有來自Mu噬菌體DNA的EcoR1-C的片斷，編碼一種致死功能的kil基因。該質(zhì)粒在Mu噬菌體的溶源菌株中正常復(fù)制；在非溶源菌株中是致死的。在Hind或Hpa位點插入外源DNA片斷后，會產(chǎn)生具Ampr表型的Mu噬菌體的非溶源的轉(zhuǎn)化子菌株第35頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二正向選擇質(zhì)粒載體的條件限制：

1、需要特殊的寄主菌株或選擇培養(yǎng)基

2、可使用的克隆位點少

3、假陽性水平高

4、不能夠調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)活性第36頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

(4)表達(dá)型的質(zhì)粒載體表達(dá)載體：

按特殊設(shè)計構(gòu)建的，能使克隆在其中特定位點的外源真核基因的編碼序列，在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體。

第37頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二主要包括：

大腸桿菌的啟動子、及操縱位點序列、多克隆位點、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯信號、質(zhì)粒載體的復(fù)制起點及抗菌素抗性基因。

待表達(dá)的真核基因編碼序列被克隆在緊挨于啟動子下游的多克隆位點上，而且必須是其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸末端這一頭靠近啟動子方向插入，才能在啟動子控制下進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄。第38頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

第39頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二1.6重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體

1、pSC101質(zhì)粒載體；

2、ColE質(zhì)粒載體；

3、pBR322質(zhì)粒載體；

4、pUC質(zhì)粒載體；

5、其它的重要的質(zhì)粒載體第40頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二1.6.1pSC101質(zhì)粒載體

一種嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制控制的地拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。平均每個寄主細(xì)胞僅有1～2個拷貝；分子量9.09kb，編碼有一個四環(huán)素抗性基因（tetr

）。有Hind、EcoR、BamH、Sal、Xho、Pvu、Sma7種核酸內(nèi)切限制酶。其中在Hind、BamH、Sma3個位點克隆外源DNA，都會導(dǎo)致tetr

基因失活。

是第一個真核生物的克隆載體第41頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二第42頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二Example1:

應(yīng)用pSC101質(zhì)粒作基因克隆載體

—葡萄球菌質(zhì)?；蛟诖竽c桿菌中的表達(dá)

金黃色葡萄球菌的質(zhì)粒p1258,編碼若干種能在大腸桿菌檢測的結(jié)構(gòu)基因；能被核酸限制酶EcoR切割成4段。第43頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二第44頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二Example2:應(yīng)用pSC101質(zhì)粒作基因克隆載體

—在大腸桿菌中克隆非洲爪蟾DNA

用核酸內(nèi)切酶EcoR消化非洲爪蟾的核糖體DNA（rDNA），與EcoR消化的pSC101質(zhì)粒進(jìn)行重組。在挑取的55個轉(zhuǎn)化子中，經(jīng)EcoR酶切，電泳后13個轉(zhuǎn)化子含有外源片斷。轉(zhuǎn)化率23.6％第45頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二第46頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二1.6.2ColE1質(zhì)粒載體

松弛型復(fù)制控制的多拷貝的質(zhì)粒，能產(chǎn)生細(xì)菌素。細(xì)菌素對大腸桿菌的正常生命活動有抑制作用（復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯能量代謝等）。但含有對細(xì)菌素的免疫基因。第47頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二第48頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

用ColE1質(zhì)粒特征為基礎(chǔ)建立的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，存在一定的缺陷性：

1、應(yīng)用大腸桿菌素免疫作為標(biāo)記操作上不方便；

2、在細(xì)菌群體中，能夠以相當(dāng)高的頻率自發(fā)的產(chǎn)生出抗菌素的突變體細(xì)胞。第49頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二1.6.3pBR322質(zhì)粒載體

“P”表示是一種質(zhì)粒；“BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示實驗編號。第50頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二第51頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二pBR322的構(gòu)建：

為改進(jìn)轉(zhuǎn)化子篩選技術(shù)，并具有相對小的分子量、高拷貝數(shù)、外源基因插入不影響質(zhì)粒的復(fù)制功能、多克隆位點（多種限制酶的單一切割位點）、質(zhì)粒的穩(wěn)定性（克服質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移能力）

第52頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二第53頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二pBR322的結(jié)構(gòu)來源第54頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點：

1、具有較小的分子量；它的分子量為4363bp?？寺≥d體的分子量大小不要超過10kb。2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。

pBR322DNA分子中總共有24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識別位點。其中7種內(nèi)切酶的識別位點在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種識別位點在于這個基因的啟動區(qū)內(nèi)，所以9個限制酶切位點插入外源片斷可以導(dǎo)致tetr

基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識別位點，第55頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二Example:a.在pBR322質(zhì)粒的BamH或Sal位點插入外源DNA片斷，切斷了tetr基因編碼序列的連續(xù)性，使之失去活性，產(chǎn)生出AmprTets表型的重組pBR322質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入AmpsTets的大腸桿菌細(xì)胞。先涂布在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，篩選出具Ampr菌落，再將它們涂布于含四環(huán)素的選擇性培養(yǎng)基上。插入外源片斷的重組質(zhì)粒不能在這種培養(yǎng)基上生長。第56頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二BXBBBXAmproriAmpsTetroriAmprTetroripBR322BABBTetsX第57頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二b.在Pst或Sca識別位點插入外源片斷會導(dǎo)致Ampr基因的失活，產(chǎn)生AmpsTetr表型的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌之后，獲得的重組子可以比較快的檢測出來。其依據(jù)是Ampr表型的細(xì)胞可以合成β–內(nèi)酰胺酶，它能使青霉素轉(zhuǎn)變成青霉酮酸，而這種青霉酮酸能與碘結(jié)合。在含有可溶性淀粉和四環(huán)素的富裕培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子，經(jīng)37度培養(yǎng)過夜后，在此平板上加入少量的碘指示劑溶液產(chǎn)生青霉素β–內(nèi)酰胺酶Ampr的菌落，其周圍的碘指示劑溶液變得明亮，而Amps菌落無此反應(yīng)。第58頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴(kuò)增之后每個細(xì)胞中可積累1000～3000個拷貝。第59頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

pBR322質(zhì)粒載體的改良

為了更加實用，人們對pBR322質(zhì)粒進(jìn)行了改良，得到許多pBR322質(zhì)粒衍生質(zhì)粒，它們各自具有不同的特點。第60頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二應(yīng)用pBR322質(zhì)粒作為基因克隆載體

—水稻葉綠體光誘導(dǎo)基因psbA的結(jié)構(gòu)分析

基因psbA編碼的蛋白質(zhì)，與光合作用系統(tǒng)相關(guān)，并且它能與除草劑阿特拉津結(jié)合，它的第264位氨基酸發(fā)生取代反應(yīng)，由絲氨酸變?yōu)楦拾彼?，可?dǎo)致其失去與除草劑阿特拉津結(jié)合的能力，推測是三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變；在原生生物衣藻、藍(lán)色細(xì)菌中，此蛋白質(zhì)在同一位置由絲氨酸變?yōu)楸彼岬娜〈磻?yīng)，會使他們獲得對除草劑的抗性功能。而且，非競爭條件下，對除草劑阿特拉津抗性的千里光屬和莧屬，干物質(zhì)產(chǎn)量比敏感植物下降了25%和40%。

第61頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

通過對基因psbA的體外操作，有可能創(chuàng)造出抗除草劑的或高光效的轉(zhuǎn)基因植株。用pBR322質(zhì)粒作為載體，成功的克隆了水稻的psbA基因。首先將水稻葉綠體DNA，用EcoR內(nèi)切酶消化，經(jīng)含有溴化乙錠的熔點瓊脂糖電泳，回收分子大小為1.8～2.5kb之間的DNA片斷。再與經(jīng)過EcoR內(nèi)切酶切割并用堿性磷酸酶作了脫磷酸處理的pBR322質(zhì)粒DNA連接。然后轉(zhuǎn)化給大腸桿菌，在氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，形成Ampr轉(zhuǎn)化子菌落群體。用經(jīng)32p標(biāo)記的玉米psdADNA探針作菌落雜交，從1000多個菌落中篩選出8個陽性克隆。第62頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

對這8個陽性克隆進(jìn)行進(jìn)一步的Southern分析，表明6個片斷帶有長度為2.2kb的編碼水稻葉綠體psdA基因。實際上其中1.2kb的片斷編碼著水稻psdA基因的全部序列。通過dna序列分析表明與高等植物的同原性在92%，與藍(lán)色細(xì)菌同源性75%第63頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二1.6.4pUC質(zhì)粒載體

人們應(yīng)用多克隆位點技術(shù)，在pBR322的基礎(chǔ)上，組入了一個在其5’-端帶有一段多克隆位點的lacZ’基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測特性的新型質(zhì)粒載體系列。

第64頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二

一種典型的pUC系列的質(zhì)粒載體，包括以下四個部分：

1、來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點（ori）；

2、氨芐青霉素抗性基因（ampr

）,但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不在含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的但識別位點。

3、大腸桿菌β-半乳糖基因（lacZ）的啟動子及編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱之為lacZ’基因；

4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)段。但它并不破壞該基因的功能。第65頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二AmproripUC18(3kb)MCS

(Multiplecloningsites,

多科隆位點）LacpromoterlacZ’第66頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二pUC質(zhì)粒載體的形體圖第67頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點第一，具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù);

僅保留了pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點；在操作過程中復(fù)制起點內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)突變造成了基因rop的缺失，它是控制質(zhì)粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個細(xì)胞500～700個拷貝。第68頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二第二，適用于組織化學(xué)檢測重組體；具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的α-肽鏈可參與α-互補(bǔ)作用，用Xgal顯色對重組子進(jìn)行鑒定，而pBR322質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩步的選擇。第三，具有多克隆位點MCS區(qū)段．方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。第69頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二1.6.5其它的重要的質(zhì)粒載體喪失遷移功能的質(zhì)粒載體能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體第70頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二（1）喪失遷移功能的質(zhì)粒載體

第一,擁有較高水平的拷貝數(shù),平均每個大腸桿菌寄主細(xì)胞可達(dá)30～45份;

第二,失去了bom位點，即便在共存的F質(zhì)粒提供轉(zhuǎn)移裝置的條件下，也不可能發(fā)生遷移作用。第71頁，共83頁，2023年，2月20日，星期二第72頁，共83頁，2023年，2月20日，星