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中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

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牛流行熱微量中和試驗(yàn)方法

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┐┐發(fā)布┐┐實(shí)施

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布

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前言

牛流行熱（簡(jiǎn)稱ＢＥＦ）又稱牛暫時(shí)熱、三日熱、一日熱、僵硬病等，本病在亞、非和大洋洲許多國(guó)家均

有發(fā)生。該病是由彈狀病毒科暫時(shí)熱病毒屬牛流行熱病毒引起的一種急性、熱性傳染病，呈周期性流行。

在發(fā)病期間，對(duì)牛的產(chǎn)奶量、使役能力、增重、精液品質(zhì)都有嚴(yán)重影響，還可導(dǎo)致少數(shù)病牛癱瘓，流產(chǎn)甚至

死亡。嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。

本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)我國(guó)科研成果，與澳大利亞合作研究成果和我國(guó)的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)制定的。

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄Ａ、附錄Ｂ、附錄Ｃ為規(guī)范性附錄，附錄Ｄ為資料性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：白文彬、嚴(yán)雋端。

Ⅰ

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牛流行熱微量中和試驗(yàn)方法

范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛流行熱微量血清中和試驗(yàn)技術(shù)。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛流行熱的診斷、免疫監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。

微量血清中和試驗(yàn)

器材

營(yíng)養(yǎng)液和００５％胰酶ＥＤＴＡ（簡(jiǎn)稱ＡＴＶ）液，配制方法見附錄Ａ。

細(xì)胞及其制備、傳代、計(jì)數(shù)方法，見附錄Ｂ。

抗原（指示毒）、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清由法定單位提供，按說明書使用?？乖緝r(jià)以及工作抗

原（１００ＴＣＩＤ５０）測(cè)定方法見附錄Ｃ。

微量滴定板：無菌帶蓋９６孔微量滴定板（簡(jiǎn)稱微量板）。

微量加樣器：２５μＬ、５０μＬ及１００μＬ單道和多道加樣器，加樣塑料滴頭（裝量為２５μＬ～

１００μＬ，與加樣器配套使用）。

二氧化碳培養(yǎng)箱。

操作方法

滅活

被檢血清以及陰、陽性血清用前均于５６℃水浴鍋中滅活３０ｍｉｎ。

準(zhǔn)備

制備工作抗原（指示毒）方法（見第Ｃ１章），將已知毒價(jià)的合格種毒用生長(zhǎng)液（見第Ａ１章）稀釋成

１００ＴＣＩＤ５０燉ｍＬ。

定性試驗(yàn)

向微量板的每孔各加２５μＬ生長(zhǎng)液。

在第一排加被檢血清，每份占２孔，每孔２５μＬ，混合均勻，即成２倍稀釋。

用多道加樣器從第１孔?。玻郸蹋桃后w對(duì)應(yīng)移入第２排孔內(nèi)，混勻即成４倍稀釋。再?gòu)目變?nèi)吸

出２５μＬ丟棄。

每孔加工作抗原２５μＬ，混勻置３７℃孵育６０ｍｉｎ。

每孔加細(xì)胞懸液１００μＬ（３００００個(gè)細(xì)胞）。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法見第Ｂ３章。

試驗(yàn)對(duì)照系統(tǒng)的設(shè)置。每批試驗(yàn)的對(duì)照系統(tǒng)的設(shè)置：標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，從第１列至第６列，每列

４孔，逐列稀釋（即２倍～６４倍），標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照各１列４孔。同時(shí)對(duì)本試驗(yàn)使用的

工作抗原，隨同試驗(yàn)再次進(jìn)行測(cè)定。

用滅菌的蓋子蓋上微量板，置３７℃二氧化碳（ＣＯ２）培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)５ｄ。從第３ｄ起逐日記錄

細(xì)胞病變效應(yīng)（ＣＰＥ）。

結(jié)果判定：標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和抗體價(jià)≥６４，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、病毒對(duì)照排各孔均出現(xiàn)ＣＰＥ，工作

抗原含量滴定在規(guī)定的范圍之內(nèi)（ＣＰＥ出現(xiàn)的孔數(shù)與毒價(jià)查閱方法見第Ｄ１章），細(xì)胞對(duì)照孔正常情況

下，４倍稀釋的被檢血清列，兩孔都出現(xiàn)ＣＰＥ時(shí)，判為陰性；僅１孔出現(xiàn)ＣＰＥ，被判為可疑