第四章酶提取與分離純化酶的提?。╡xtraction）與分離（separation,isolation）純化（purification）是將酶從細(xì)胞或其它含酶原料中提取出來(lái)，再與雜質(zhì)分開，而獲得所需酶的技術(shù)過(guò)程。第一節(jié)細(xì)胞破碎一、機(jī)械破碎法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切力，使組織細(xì)胞破碎的方法稱為機(jī)械破碎法。1.機(jī)械搗碎法2.研磨法3.勻漿法二、物理破碎法通過(guò)溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法統(tǒng)稱為物理破碎法。該方法多用于微生物細(xì)胞的破碎。1.溫度差破碎法2.壓力差破碎法3.超聲波破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法三、化學(xué)破碎法應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)改變或破壞的方法。1.有機(jī)溶劑處理：利用有機(jī)溶劑可使細(xì)胞膜的磷質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過(guò)性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋放出胞外。2.表面活性劑處理：表面活性劑可以和細(xì)胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，增加膜的通透性。四、酶學(xué)破碎法在一定條件下，通過(guò)外加的酶或細(xì)胞本身存在的酶的作用，使細(xì)胞破碎。1.外加酶處理：根據(jù)細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，選用適當(dāng)?shù)拿?，使?xì)胞壁破壞，并在低滲透壓的溶液中使細(xì)胞破裂。2.自溶法：將細(xì)胞在一定的pH和適宜的溫度條件下保溫一段時(shí)間，通過(guò)細(xì)胞本身存在的酶系將細(xì)胞破壞，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)的方法。G+：溶菌酶酵母：β－葡聚糖酶霉菌：幾丁質(zhì)酶植物細(xì)胞：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶混合使用第二節(jié)酶的提取酶的提取：在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過(guò)程，也稱作酶的抽提。1.鹽溶液提取2.酸溶液提取：胰蛋白酶，0.12MH2SO43.堿溶液提?。篖-天冬酰胺酶，pH11－12.54.有機(jī)溶劑提?。耗憠A酯酶一、主要方法二、影響酶提取的主要因素1.溫度：0－10℃2.pH3.提取液的體積：原材料的3－5倍4.添加保護(hù)劑：底物、輔酶、抗氧化劑第三節(jié)酶的提取過(guò)程中常用的技術(shù)離心是指借助離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)一、離心分離（一）離心機(jī)的種類及用途1.常速離心機(jī)：<8000r/min,<1x104g2.高速離心機(jī)：1x104——2.5x104r/min,1x104——1x105g3.超速離心機(jī)：2.5x104——8x104r/min,5x105g（二）離心方法的選擇1.差速離心：采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。2.密度梯度離心：密度梯度的離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)得以分離的一種區(qū)帶分離方法。3.等密度離心：當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)時(shí)，在離心力的作用下，不同浮力密度的物質(zhì)顆?；蛳蛳鲁两?，或向上漂浮，一直移動(dòng)到與它們各自浮力密度恰好相等的位置（等密度點(diǎn)），形成區(qū)帶。也叫平衡等密度梯度。介質(zhì)為CsCl,Cs2SO4,CsBr等（三）離心條件的確定1.離心力2.離心時(shí)間3.溫度和pH離心力的轉(zhuǎn)換列線圖是通過(guò)改變某些條件，使溶液中某種溶質(zhì)的溶解度降低，從而從溶液中沉淀出來(lái)，達(dá)到與其他溶質(zhì)分離的目的。

二、沉淀分離1.鹽析沉淀法

2.等電點(diǎn)沉淀法

3.有機(jī)溶劑沉淀法

4.復(fù)合沉淀法疏水區(qū)域蛋白質(zhì)分子上的電荷與疏水區(qū)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的溶解度最小pH與鹽濃度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的共同作用三、層析分離（一）什么是層析-chromatography利用混合物中個(gè)組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的大小和形狀、分子特性、吸附力、分子親和力和分配系數(shù)等）的不同，使各組分在兩相中的分布程度不同而達(dá)到分離的目的。March21,1903,MeetingoftheWarsawSocietyofNaturalScientists,MikhailSemenovichTswettpresentedalectureentitled"OnaNewCategoryofAdsorptionPhenomenaanditsApplicationinBiochemicalAnalysis".

（二）層析是酶分離提純的好手段疏水區(qū)域蛋白質(zhì)分子上的電荷與疏水區(qū)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的溶解度最小pH與鹽濃度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的共同作用1.吸附層析

2.凝膠層析

3.離子交換層析

4.親和層析（三）常用的層析方式1.凝膠層析又稱分子篩層析，凝膠過(guò)濾或分子排阻層析，是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中個(gè)組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。概念分配系數(shù)KaKa=(Ve-Vo)/V1Ve:洗脫體積Vo:外體積Vt:內(nèi)體積2.親和層析是利用生物分子對(duì)之間所具有的專一性而又可逆的親和力使生物分子分離純化的技術(shù)。配體：底物、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、輔酶3.離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)對(duì)各種離子的親和力不同，而使不同物質(zhì)分離的方法。離子交換劑的選擇陰離子交換劑陽(yáng)離子交換劑離子交換劑的處理（四）層析系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室用層析柱工業(yè)用層析柱0.5-5cm5-100cm帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的過(guò)程稱為電泳。

四、電泳分離1.紙電泳

2.薄層電泳

3.凝膠電泳

4.等電聚焦電泳凝膠電泳以各種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠作為支持體的電泳技術(shù)。由于凝膠電泳同時(shí)具有電泳和分子篩的雙重作用，故具有很高的分辨率。1.連續(xù)凝膠電泳

2.不連續(xù)凝膠電泳

3.濃度梯度凝膠電泳

4.SDS凝膠電泳SDS------------------------等電聚焦電泳是利用組分的等電點(diǎn)不同而進(jìn)行分離的電泳技術(shù)。（1）兩性電解質(zhì)

（2）穩(wěn)定pH梯度

（3）支持pH梯度的介質(zhì)磷酸、硫酸+-NaOH1708年Reuss的實(shí)驗(yàn)1930年Tiselius的裝置最早的電泳裝置1948年分離血清蛋白的工作獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)酶以晶體的形式從溶液中析出。

1.一定的純度

2.一定的濃度

3.溫度

4.pH

5.離子強(qiáng)度條件：1.鹽析結(jié)晶法

2.有機(jī)溶劑結(jié)晶法

3.滲透平衡結(jié)晶法

4.等電點(diǎn)結(jié)晶法方法：五、酶的結(jié)晶六、酶的濃縮與干燥酶的濃縮：從低濃度酶液中除去部分的水或其他溶劑而成為高