流式細胞術(shù)

流式細胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。

流式細胞術(shù)最大的特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選。細胞不被破壞，測量快速、大量、準確、靈敏、定量流式細胞術(shù)的特點

流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是在單個細胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對細胞的物理或化學性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進行快速測量并可分類收集的高技術(shù)。第一節(jié)流式細胞儀BDFACSCalibur(BD流式細胞儀）采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標記技術(shù)，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機系統(tǒng)對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數(shù)信號進行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測速度與統(tǒng)計分析精確性。一、工作原理

（1）液流系統(tǒng)（2）光學系統(tǒng)（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1.流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)：由樣本和鞘液組成待測細胞 單個細胞的懸液 熒光染料標記的單抗對其染色受清潔氣體壓力 從樣品管進入流動室形成樣本流鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。

（1）液流系統(tǒng)液流中心由單列勻速運動顆粒組成的液柱液流驅(qū)動系統(tǒng)（示意圖）流速與壓力的關(guān)系服從Bernoulli方程，即P=(1/2)V2

(忽略高度的變化)。改變氣壓,就可獲得不同的流速。

FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個細胞流）樣本管鞘液管噴嘴FluorescencesignalsFocusedlaserbeam鞘液液流系統(tǒng)示意圖激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長/短波長，通過短/長波長光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾片：長通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS（散射光），F(xiàn)L1,FL2,FL3,FL4（熒光）（2）光學系統(tǒng)FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光學系統(tǒng)示意圖PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser1234Flowcell

激光、透鏡組、光電倍增管等。LongpassShortpassBandpass460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50光收集系統(tǒng)：濾光片主要由計算機及其軟件組成（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360°立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。二、散射光的測定

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。FALSSensorLaser前向散射光示意圖

側(cè)向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細胞時，光以90°角散射的訊號，用于檢測細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。FALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向散射光示意圖

測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細胞單核細胞中性粒細胞光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。線性放大器和對數(shù)放大器三、熒光測量熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)

通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。四、細胞分選原理細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細胞的液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機械振動不充電充電（一）分選基本原理參數(shù)：FS,SS,FL數(shù)據(jù)顯示方式（單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數(shù)散點圖）設(shè)門分析技術(shù)第二節(jié)數(shù)據(jù)的顯示與分析FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少一、參數(shù)單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析直分析方圖設(shè)門分析:REGION和GATE設(shè)置二、數(shù)據(jù)顯示方式

由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。（一）單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖細胞相對數(shù)量信道(channel)雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數(shù)，根據(jù)這兩個參數(shù)就可以確定細胞在圖上的表達位置。雙參數(shù)信號通常采用對數(shù)信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。（二）雙參數(shù)直方圖1.雙參數(shù)直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度雙參數(shù)直方圖點圖中性粒細胞單核細胞淋巴細胞2.二維等高圖由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細胞相對或絕對數(shù)，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線)所代表的細胞數(shù)愈多。等高線越密集則表示細胞數(shù)變化率越大。二維等高圖3.假三維等高圖（三）三參數(shù)直方圖

多參數(shù)分析：當細胞標記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號和散射光信號可根據(jù)需要進行組合分析。（四）流式細胞儀的多參數(shù)分析Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細胞的分布情況。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。三、設(shè)門分析技術(shù)A淋巴細胞B單核細胞C中性粒細胞A、B、C均為任意門線性門D1

CD4+/CD3-D2

CD4+/CD3+D3

CD4-/CD3-D4

CD4-/CD3+如十字門分析時，起就可以由四個區(qū)域構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。

熒光素種類FITC(異硫氰酸熒光素）：綠色530nmPE（藻紅蛋白）：橙黃色575nmPerCP(多甲藻黃素葉綠素蛋白）：深紅色 675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色620nm 488nm波長的氬離子激光激發(fā)APC(別藻蘭蛋白）：紅色660nm630nm波長的氦氖激光或紅色二極管激光激發(fā)細胞組成細胞功能大小細胞表面/胞漿/核--特異性抗原粒度細胞活性DNA,RNA含量胞內(nèi)細胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點鈣離子,PH值,膜電位酶活性流式細胞儀常檢測的細胞特性小結(jié)基本工作原理單細胞液柱已標記的單細胞懸液和鞘液硅化管流動室噴嘴熒光檢測系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號計算機系統(tǒng)分析結(jié)果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之基本過程樣品染色步驟PBS洗細胞1~2次加（熒光）單抗，暗處孵育15~30分鐘如果必需，加熒光二抗，暗處孵育15~30分鐘PBS洗細胞一次過300目尼龍網(wǎng)上機檢測區(qū)別流式細胞儀顯微鏡光源激光自然光、燈光對象細胞、生物粒子細胞、組織等承載工具鞘液及流動室載玻片檢測信號光學信號形態(tài)及染色放大方式PMT、放大電路目鏡×物鏡、光學放大統(tǒng)計計算機，>5000人工，200結(jié)果多參數(shù)，綜合分析簡單，單參數(shù)流式細胞儀與顯微鏡的區(qū)別細胞周期分析細胞周期G2MG0G1s0

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNA分析細胞數(shù)量