生物醫(yī)學電鏡技術與細胞及組織超微結構BiomedicalElectronMicroscopyandCell&TissueUltrastructure重慶醫(yī)科大學電子顯微鏡室2/1/20231電子顯微鏡（ElectronMicroscope,EM)簡稱電鏡，它是用電子束代替可見光的顯微裝置，一種高放大、高分辨的大型精密儀器。目前電鏡已廣泛應用于醫(yī)學、生物學、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、軍事等多個領域。EM在光學顯微鏡基礎上使細胞學的概念更加完善，對疾病的認識,特別是對發(fā)病機理的研究做出了巨大貢獻。緒論2/1/20232（一）、電鏡技術發(fā)展簡史⑴、RobertHooke(1665)&Leeuwenhoek(1674)發(fā)現(xiàn)細胞；⑵、19世紀30年代,Schleiden(1938)&Schwann（1839）提出細胞學說(celltheory)；⑶、1932年，德國Knoll&Ruska建造第一臺電鏡(ElectronMicroscope,EM,×12);1933～1934年,電鏡的性能已達光鏡的分辨率0.2um,×10,000；1938-1939，第一批商品電鏡問世，分辨率達100A；由于受到樣品制備技術的限制，20世紀50年代初，電鏡技術才開始運用于生物醫(yī)學方面的研究。⑷、細胞超微結構的分子細胞生物學的基礎。2/1/20233(二)、分辨率與形態(tài)研究的關系1、分辨率（Resolution）

又稱分辯本領（Resolvingpower），是將鄰近兩點清晰區(qū)分、辯認的能力，用能被辨認的鄰近兩點的距離表示。肉眼：在明視距離（25cm）時，為0.25mm；LM：可見光的平均波長為500nm，r=λ/2，LM的極限分辨率為0.25um;EM：電子波波長短,且波長隨加速電壓的增高而更短，目前較好的電鏡分辨率為0.2nm左右,比LM提高1000倍,比人眼提高100萬倍.(注)：①由于電鏡存在各種像差（包括球差、像散等）,限制了分辨率,不能真正達到其波長的一半;②分辨率還受到許多因素的影響,如切片的厚度等，超薄切片較薄時,分辨率可達1～2.5nm,切片較厚時,實際分辨率為5～10nm.2/1/202342、反差：

被觀察物與其背景在亮度（黑白對比度）上有所不同，這種差別稱為反差；透射電鏡的反差主要由樣品對電子的散射產(chǎn)生。3、空放大

不能提供更為清晰的圖像放大，稱為無效放大，也稱無效放大。4、不同分辨率的形態(tài)研究2/1/202355、亞微結構與超微結構的概念及關系亞顯微結構（submicroscopicstructure）：介于細胞水平和大分子水平之間的結構；簡稱為“亞微結構”或“亞細胞結構（subcellullarstructure）”，也稱“細微結構（finestructure）”超微結構（ultrastructure）：嚴格的講，是指分子水平的結構，目前一般書刊對亞顯微結構和超微結構無嚴格的界限，往往將普通光鏡分辯界限以下的結構籠統(tǒng)稱為超微結構。2/1/20236(三)、基本原理、構造及電鏡的類型電鏡的基本構造及原理①、電子束主要特點：a、由電子組成，真空中直線前進，具波動特性；b、電子束受電力和磁力作用；c、電子束照射樣品時，能透過極薄樣品，得到透射電子，或產(chǎn)生二次電子，特征X射線，背散射電子等。2/1/20237②、電鏡的基本構造：以透射電鏡為例2/1/20238電鏡的類型①、透射式電子顯微鏡(TransmissionElectronMicroscope,TEM)；

最常用、最典型，主要用于觀察超薄切片和負染樣品，點分辨率的理論值可達1.4～2A。②、掃描式電子顯微鏡（ScanningElectronMicroscope，SEM）；

具有景深長，視野廣，觀察樣品表面立體圖像的特點，其分辨率和放大倍數(shù)都遠低于TEM，一般分辨率為60A左右。上述兩種電鏡可綜合，兼有功能，是現(xiàn)代電鏡發(fā)展的代表（STEM）。2/1/20239③、超高壓電鏡（HighVoltageElectronMicroscope,HVEM）；常規(guī)電鏡加速電壓一般在200KV以下，如果加速電壓在500KV以上，則稱為HVEM。特點:觀察厚切片(0.5-3um)，提高分辨率。觀察到原子水平，期望觀察生活標本（含水份）④、分析電鏡（ElectronMicroscopeMicroanalyser，EMMA）；I、波譜儀（wavelength-dispersivespectrometer，WDS）II、能譜儀（energy-dispersivespectrometer，EDS）⑤、掃描探針顯微鏡(Scanningprobemicroscope,SPM):原子力顯微鏡(atomicforcemicroscope,AFM)；掃描隧道顯微鏡(scanningtunnelingmicroscope,STM)。2/1/2023102/1/2023112/1/2023122/1/2023132/1/2023142/1/2023152/1/202316③、掃描電鏡的二次成像原理掃描電鏡一般可分為四個重要的組成部分：a、形成電子探針的電子光學系統(tǒng)；b、探針的電子束打擊樣品表面形成信息信號；c、檢測系統(tǒng)；d、電子偏轉系統(tǒng)（是電子探針在樣品表面按一定順序掃描，并且使這一掃描過程與陰極射線管的電子束在熒光屏上移動同步）。2/1/2023172/1/202318掃描電鏡的結構示意圖：2/1/2023192/1/2023202/1/2023212/1/2023222/1/2023232/1/2023242/1/2023252/1/202326(四)、細胞超微結構研究的展望①、二維三維，如三維重建技術；②、從單純的形態(tài)觀察,深入到對其功能、代謝、化學組成、分子結構及元素分布的研究。如X線顯微分析(electronprobex-raymicroanalysis)；③、定性描述定量測定方向發(fā)展，如電鏡形態(tài)測量技術（morphometry）；④、從經(jīng)化學固定的結構向活細胞整體方向發(fā)展，如超高壓電鏡技術的應用；⑤、儀器設備向小型化方向發(fā)展。2/1/202327本課程的重點內容①電鏡生物樣品制備常規(guī)技術及應用范圍;②電鏡圖片的分析要領;③正常細胞超微結構理論和超微病理內容的基本掌握。學習要點①重視圖像的分析和識別；②注意LM和EM結合；③形態(tài)與功能的聯(lián)系；④正常超微結構與超微病理的聯(lián)系；⑤建立整體的細胞結構和功能概念。主要參考文獻①電子顯微鏡術在臨床醫(yī)學的應用,杭振鑣蔡文琴主編,重慶出版社,1988年8月,第一版；②醫(yī)學細胞生物學,宋今丹主編,人民衛(wèi)生出版社,1997年5月,第一版；③醫(yī)用電子顯微學，薄愛華主編,人民衛(wèi)生出版社,2000年11月,第一版；④超微病理學基礎,武忠弼主編,人民衛(wèi)生出版社,1990年9月,第一版；⑤UltrastructuralPathologyoftheCellandMatrix.ThirdEditionVol.1FeroceN,GhadiallyButterworths19882/1/202328電鏡生物樣品制備技術

樣品制備是電鏡技術中一個很重要的組成部分，是電鏡工作中最繁重的環(huán)節(jié)。要學習掌握好細胞超微結構知識及應用電鏡技術進行研究工作，都必須首先了解電鏡的標本制備技術，故屬于本課程的重點內容。2/1/202329（一）、超薄切片及其染色技術超薄切片（ultrathin-section）制備過程示意圖：2/1/2023301、取材的基本原則：快：1min?。?mm3利：靜：冷：4℃取材部位要準確；成批取材，部位一致、；標本的編號和標簽。2/1/2023312、固定：①、幾種常用的固定劑的理化特性和使用原則：a、四氧化鋨（Osmiumtetroxide，OsO4）；又稱鋨酸，是電鏡生物樣品使用最廣泛的固定劑，兼有電子染色作用，可作單固定，一般不用于電鏡細胞化學實驗的固定。對糖原和核酸的保護作用差。多用于后固定。b、戊二醛（glutaraldehyde，C5H8O2）；不能單獨作為電鏡樣品固定液，對脂肪的保護作用差。沒有“電子染色”的作用，通常用于前固定。c、甲醛（formaldehyde）。電鏡多用多聚甲醛，對酶活性保存好，可與戊二醛混合或單獨用于細胞化學灌流固定或作為前固定液。②、固定方法：

a、雙重固定法；b、體內原位固定法；c、灌流固定法。

2/1/2023323、脫水：應遞增濃度進行4、浸透：半浸透純浸透5、包埋、聚合：環(huán)氧樹脂（epoxyresin）618#，Epon8126、切片：修塊光切（半薄切片，0.5-1um）定位超切(超薄切片,50-70nm)超薄切片機(ultramicrotome)，玻璃刀，鉆石刀，復有支持膜的載網(wǎng)（grid）（銅、鎳、金網(wǎng)）。2/1/2023337、電子染色：利用重金屬離子對不同細胞結構的結合能力不同，使各細胞結構對電子產(chǎn)生不同散射程度，以增強明暗之比（反差）。①常用的電子染色劑有以下幾種

a、醋酸鈾（Uranylacetate），即醋酸雙氧鈾，多用于塊染；b、枸櫞酸鉛（Leadcitrate），用于片染，易被空氣中的CO2污染。

②電子密度（electrondensity）的概念：2/1/202334（二）、負染技術利用高密度無結構的重金屬物質把生物標本包繞起來。這種反差是負像（與正染色的超薄切片相比較）。最常用的染色劑是磷鎢酸鈉（phosphotungsticacid，PTA），此法常用于病毒、蛋白分子或細胞亞單位的分子結構研究，制樣簡單，可作快速診斷。2/1/202335（三）、電鏡細胞化學技術

（electronmicroscopiccytochemistry）在保持細胞超微結構完整的條件下，借助細胞中的化學反應，研究細胞乃至細胞器的結構與功能的關系，是與化學、生物化學及免疫學有密切聯(lián)系的一門學科。廣義的電鏡細胞化學研究方法主要有細胞超微標記示蹤技術、電鏡酶細胞化學技術和電鏡免疫細胞化學技術（簡稱免疫電鏡技術）等幾種。2/1/2023361、電鏡酶細胞化學術(electronmicroscopiccytochemistryofenzymeorultracytochemistryofenzyme)基本原理及內容:酶細胞化學術（enzymecytochemistry）是利用酶催化反應特點，從亞微結構上研究酶的分布和活性。按其催化反應的性質可分為水解酶、氧化還原酶、轉移酶、裂解酶、合成酶和異構酶六大類，應用較多的有水解酶和氧化還原酶?，F(xiàn)以水解酶為例，介紹此技術的主要過程和基本原理。初級反應：底物被磷酸水解酶作用后分解產(chǎn)生磷酸。底物磷酸水解酶H3PO4

最終反應：磷酸與金屬捕捉劑結合形成反應產(chǎn)物。H3PO4捕捉劑（如Pb2+）Pb3(PO4)2↓反應產(chǎn)物為電子致密的沉淀物，電鏡下易于觀察并顯示出酶的定位。近年來常用鈰（Ce3+）作為捕捉劑。2/1/2023372/1/202338應用一般說透射電鏡已能分辨出超微結構和某些化學成份，如糖原顆粒、核糖體、染色質和脂類等。電鏡酶細胞化學則著重顯示各超微結構的酶特別是標志酶，研究細胞器的化學、功能及其動態(tài)變化，由于電鏡方法的限制，迄今所能顯示的酶為數(shù)尚少。酶細胞化學技術主要用于：（1）酶在超微結構上的定位，（2）標記和鑒定某些細胞和細胞器，（3）通過顯示過氧化物酶，定位示蹤HRP,（4）利用免疫酶技術，電鏡下顯示特異性標記物的定位。目前應用電鏡技術常顯示的標志酶有：各種細胞器的標志酶細胞器標志酶內質網(wǎng)核苷二磷酸酶，葡萄糖-6-磷酸酶高爾基體焦磷酸硫胺素酶（Trans膜囊）、煙酸胺腺嘌呤二核苷磷酸酶（中間膜囊）溶酶體酸性磷酸酶微體過氧化氫酶線粒體細胞色素氧化酶、琥珀酸脫氨酶細胞膜核糖核苷磷酸酶（如ATP酶）、堿性磷酸酶2/1/202339Figure10G-6-PasereactionproductswererichinLeydigcellofthecontrolgrouprats.×20000Figure11G-6-Pasereactionproductsdecreasedmarkedlyafter3dofcadiumtreatment.×20000Figure12ShowingintenseG-6-PasereactionproductsofLeydigcellafter3dofcadiumaddzinctreatment.×200002/1/2023402/1/202341RER,G-6-PasePlasmalemma,AlPMito.,SDH2/1/2023422、免疫電鏡技術(immunoelectronmicroscopy)

免疫細胞化學術（immunocytochemistry）是用標記特異性抗體對組織內抗原分布進行形態(tài)學研究的一門分支學科。60年代，Nakane建立了酶標記抗體技術，70年代，Sternberger在此基礎上改良并建立了非標記過氧化物酶--抗過氧化物酶（PAP）技術，80年代Hsu建立了抗生物素--生物素（ABC）法之后，膠體金標記技術、免疫金銀染色和親和免疫細胞化學技術等相繼問世，使免疫細胞化學技術成為當今生物醫(yī)學中形態(tài)、功能、代謝綜合研究的一項有力工具。目前免疫細胞化學正在向定量和分子水平發(fā)展。2/1/202343

常用免疫電鏡方法的原理及步驟

PAP法

基本原理：PAP（peroxidase-antiperoxidase）法，又稱可溶性酶--抗酶法。特點為參加反應的抗體都不被酶直接標記。包括以下步驟：①用第一抗體（Ab1）與組織中特異性抗原（Ag）相結合形成抗原抗體（Ag－Ab1）復合物；②用第二抗體（Ab2）的一個Fab段與第一抗體結合，另一個Fab段游離，形成抗原--第一抗體--第二抗體（Ag-Ab1-Ab2）復合物；③用過氧化物酶--抗過氧化物酶復合物（PAP，與Ab1同種動物的血清）與第二抗體的游離Fab段結合，形成Ag-Ab1-Ab2－PAP復合物；④用過氧化氫和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）使PAP的過氧化物酶形成不溶的、暗棕色的嗜鋨化合物。

優(yōu)點：①保存抗體活性好；②PAP復合物穩(wěn)定；③敏感性高，比間接免疫熒光抗體法敏感性高100～1000倍；④由于敏感性高,節(jié)約了抗體用量,也減少了非特異性背景染色。

缺點：①反應產(chǎn)物顆粒較大，遮蓋背景；②DAB有致癌作用，操作中需格外小心；③內源性氧化酶對此法有干擾。2/1/2023442/1/202345

ABC法

基本原理：抗生物素--生物素--過氧化物酶復合物技術（Avidin-Biotin-PeroxidaseComplexTechnique）簡稱ABC技術，是目前常用的免疫細胞化學技術之一。1979年Guessdon首先把生物素--卵白素技術用于免疫組織化學，先后設計出橋式卵白素--生物素（BAB）技術和標記式卵白素一生物素（LAB）技術，1981年Hsu和許世明在BAB法和LAB法基礎上改良而建立了ABC法，其基本原理與PAP法相似，特點是利用抗生物素分別連接生物素標記的第二抗體和生物素標記的過氧化物酶，形成抗原--第一抗體--生物素標記的第二抗體--抗生物素過氧化物酶復合體（Ag－Ab1－Ab2－ABC）。抗生物素又稱卵白素（Avidin），它有四個活動結合點，并與生物素有特別高的親和力，一旦和生物素結合就極為穩(wěn)定。當生物素和第二抗體共價偶聯(lián)后，就使第二抗體獲得與抗生物素相結合的能力。2/1/2023462/1/202347膠體金標記技術優(yōu)點：（l）膠體金可標記各種不同的生物大分子(如免疫球蛋白、葡萄球菌A蛋白、植物凝集素、刀豆球蛋白A等)，并使其保持原有的生物學活性。（2）膠體金標記技術可適用于光鏡、透射及掃描電鏡、X射線能譜分析、熒光顯微鏡等。（3）膠體金非特異性吸附作用小、特異性強。（4）金顆粒電子密度大，電鏡下檢出率遠比DAB反應產(chǎn)物高，敏感性比PAP法高20～200倍、比ABC法亦高數(shù)倍。（5）膠體金標記物是顆粒狀物，電鏡下易于計數(shù)，可直接定量檢測抗原。（6）膠體金標記不受內源性物質影響。（7）膠體金顆粒直徑可根據(jù)需要控制，將不同直徑的肢體金分別標記不同抗體或抗原，可在同一張切片上同時區(qū)分兩種或兩種以上的抗原或抗體，特別適合于電鏡水平的雙標記或多標記。（8）膠體金標記和IGSS特別有利于回顧性研究,如過去病理外檢的石蠟切片和電鏡包埋塊,需要時可進行膠體金標記研究。膠體金的顆粒較大,穿透性弱,是它的主要缺點。電鏡水平的免疫金技術，同PAP和ABC法免疫電鏡一樣，關鍵在于抗原的保存。用L.R.White和LowicrylK4M包埋，其保存抗原優(yōu)于Epon812，用冷凍超薄切片作IGS，由于抗原性保存很好，更易成功。目前多采用包埋后染色。包埋前染色，免疫金試劑對細胞膜的穿透性差,一般只用于細胞表面抗原的標記。2/1/2023482/1/202349（四）、真空噴鍍和離子濺射技術真空噴鍍：

真空條件下金屬加熱至一定溫度后，將以細顆粒向四周發(fā)射，在樣品面對噴鍍源的一面形成一層重金屬薄膜。又稱金屬投影法（metalshadowing）。離子濺射：

與真空噴鍍的區(qū)別在于：真空度不同，重金屬離子運動的方向不同，鍍膜效果較前者好，金屬用量可少10倍，鍍膜更為均勻。2/1/202350（五）、冷凍蝕刻技術（freezeetching）及冷凍割斷技術（freezefracture）冷凍蝕刻技術又稱冷凍蝕刻復型法（freezeetchingreplica），該技術主要用于生物膜內部及細胞內部三維結構的研究，如核孔復合體、細胞連接等。2/1/2023512/1/2023522/1/202353（六）、掃描電鏡樣品制備技術

2/1/202354（七）、電鏡X線顯微分析術（electronmicroscopicX-raymicroanalysis）

又稱電子探針X線顯微分析（electronprobeX-raymicroanalysis）或簡稱X線微區(qū)分析（X-rayMA），是電鏡技術與X線分析技術相結合的一種方法?；驹恚寒敻咚匐娮邮Z擊固體標本表面的微小區(qū)域，使該區(qū)域所含的元素發(fā)射X線，各種元素都能發(fā)射自己的特征X線，通過檢測發(fā)射的X線的波長和強度，便可了解該微小區(qū)域所含元素的種類及含量。分析儀器包括：a、電子探針顯微分析儀；b、掃描電境與X線檢測器的結合；c、掃描透射電境與X線檢測器的結合；d、專用分析電鏡（electronmicroscopemicroanlyser，EMMA）；e、透射電鏡與X線檢測器的結合。2/1/202355優(yōu)點：①、分析過程不破壞樣品結構，在保持各元素原有分布情況下對生物細胞內各種元素同時進行分析；②、結合拍攝透射或掃描電鏡圖像，可在形態(tài)觀察的同時對一定結構內的元素進行測量，從而獲知超微結構變化與其組成元素變化的關系。③、靈敏度高，可辨別＜1um3區(qū)域內質量小于10-14g的元素。應用：中藥研究，鈣庫研究，重金屬中毒（如鎘）研究等。2/1/202356(八)、電鏡細胞立體形態(tài)計量技術用立體學方法來分析形態(tài)結構，稱為形態(tài)計量學（morphometry）或體視學，形態(tài)定量分析目的是從二維圖像推導出三維結構參數(shù)。①人工法；②生物醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（九）、掃描血管鑄型（casting）技術

觀察和研究腔隙性器官，特別是器官內的血管立體構筑和分布情況。鑄型劑----甲基丙烯酸酯樣品經(jīng)腐蝕，清洗，鍍膜后在SEM下觀察。（十）、特殊樣品制備①甲醛固定石蠟包埋樣品；②培養(yǎng)細胞及游離細胞；③血液（白細胞、血小板），精液等液體標本；④骨組織。2/1/2023572/1/202358電鏡技術在生物醫(yī)學中的應用基礎研究方面：

在病毒學、細胞生物學、組織學、病理學、分子生物學及分子病理學上均做出了卓有成效的貢獻。如核蛋白體超微結構的研究；核蛋白體與mRNA關系的闡明；核小體的發(fā)現(xiàn)；DNA復制及RNA轉錄的分子形態(tài)觀察；線粒體內膜的ATP合成酶顆粒的發(fā)現(xiàn)；電鏡是直接觀察病毒的唯一工具。臨床醫(yī)學方面：電鏡在醫(yī)學上的應用近10多年來已從醫(yī)學基礎性理論研究逐漸擴大到臨床醫(yī)學的實際應用方面。對疾病的病情、病因的鑒定，對腫瘤、血液病及腎臟病等的分型診斷上都取得顯著成效。由于內窺鏡的應用和穿刺技術的發(fā)展，使得臨床上獲得如心臟、肝、腎、胃等臟器的標本變得較容易。2/1/2023592/1/202360正確評價電鏡的使用：電鏡是一種先進的科學儀器，其主要特點是分辨率高，能觀察細微結構。但正是由于其高放大，使得觀察范圍較小，且制樣復雜。而光鏡則有制樣簡單，觀察面大，能動態(tài)觀察活細胞等優(yōu)點。因此電鏡不能取代光鏡，二者應配合使用，取長補短。在科學研究中，電鏡所起作用具體表現(xiàn)為：

a、探查作用：觀察很早期的改變，功能活動的提示，因復雜的代謝過程中的定位往往是光鏡看不見的；病毒學、病因學、免疫損傷等病因的探討；

b、依據(jù)作用：“眼見為實”的重要性，在機理研究中從形態(tài)學上證實了許多理論假說；

C、輔助作用：電鏡結果注意與光鏡的關系，與宏觀的關系，因其本身有較大的局限性，如取材小，觀察范圍亦小，特別是在病理診斷上應與其他方法結合進行研究。

2/1/202361觀察要領1、正確判斷和應用放大倍率：原則：從低倍到高倍，以利于判斷細胞組織種類，醫(yī)學生物學范圍內多用1-2萬倍，多數(shù)問題在5萬倍以下就能解決。電子放大，光學放大，總放大的概念。2、具有全局的觀點：

注意宏觀提示，光鏡和其他檢查結果，防止片面性；電鏡觀察時注意連續(xù)追蹤，仔細全面，一定要有嚴格的正常對照；提倡2人以上同時觀察。3、及時作好拍片記錄和觀察小結；4、重視基礎理論指導：良好的認識水平來自于堅實的專業(yè)理論知識和豐富的實踐經(jīng)驗。電鏡觀察如果缺少必要的認識基礎，其結果是視而不見，見而不知其義。因此必須做好文獻準備，科研設計，有一定的超微結構知識，才能解釋圖像，提高觀察分析水平。電鏡觀察要領及人工損傷的識別2/1/2023622/1/20