1、第四講細(xì)胞破碎and解析細(xì)胞結(jié)構(gòu)動(dòng)物細(xì)胞：大多無細(xì)胞壁，其培養(yǎng)產(chǎn)物大多分泌在培養(yǎng)液中。 植物細(xì)胞：多為胞內(nèi)產(chǎn)物。微生物：大多數(shù)小分子代謝產(chǎn)物分泌在胞外；大多數(shù)大分子產(chǎn)物和基因重組產(chǎn)物為胞內(nèi)產(chǎn)物，如胰島素、干擾素、白細(xì)胞介素-2等均為胞內(nèi)產(chǎn)物。對于胞內(nèi)產(chǎn)物，首先必須將細(xì)胞破碎， 使產(chǎn)物得以釋放，才能進(jìn)一步提取。有些目標(biāo)產(chǎn)物不在發(fā)酵液中，而是存在于生物體中?；蚬こ叹a(chǎn)生的大多數(shù)蛋白質(zhì)不會(huì)被分泌到發(fā)酵液中，而是在細(xì)胞內(nèi)沉積。脂類物質(zhì)和一些抗生素也是包含在生物體中。還有一些目標(biāo)產(chǎn)物就是細(xì)胞本身，如面包酵母。使胞內(nèi)產(chǎn)物釋放出來一般需要破碎細(xì)胞壁，這也是這一章的主題。細(xì)胞破碎的方法在生物化學(xué)領(lǐng)域中得到了

2、很廣泛的運(yùn)用，但多數(shù)在小規(guī)模生產(chǎn)中，在大規(guī)模生產(chǎn)尤其是基因工程中應(yīng)用極少。概述化學(xué)破碎方法機(jī)械破碎方法TABLE 4.0-1. Chemical Cell Disintegration TechniquesMethodTechniquePrincipleStress CostExamplesChemicalOsmotic shockOsmotic rupture of membrane GentleCheapRupture of red blood cellsEnzyme digestionCell wall digested , providing disruptionGentleExpen

3、siveEgg lysosymeSolubilizationDetergents solubilize cell membraneGentleModerate- expensiveBile salts acting on E.coliLipid dissolutionOrganic solvent dissolves in cell wallModerateCheapToluene disruptionof yeastAlkali treatment Saponification of lipids solubilizes membraneHarshCheap方法技術(shù)原理效果成本舉例化學(xué)法滲透

4、沖擊滲透壓破壞細(xì)胞溫和便宜血紅細(xì)胞的破壞酶消化法細(xì)胞壁被消化，使細(xì)胞破碎溫和昂貴增溶法表面活性劑溶解細(xì)胞壁溫和適中膽鹽作用于大腸桿菌脂溶法有機(jī)溶劑溶解細(xì)胞壁并使之失穩(wěn)適中便宜甲苯破碎酵母細(xì)胞堿處理法堿的皂化作用使細(xì)胞壁融解劇烈便宜MethodTechniquePrincipleProduct CostExamplesMechanicalHomogenization (blade type)Cells chopped in Waring blender ModerateModerateAnimal tissueand cellsGrindingCells ruptured by grinding

5、 with abrasivesModerateCheapUltrasonicationCells broken with ultrasonic cavitation Harsh Expensive Cell suspensions at least on a small scaleHomogenization (orifice type) Cells forced through small hole are broken by shear Harsh Moderate Large scale treatment of cell suspensions,Crushing in ball mil

6、l Cells crushed between glass or steel balls Harsh Cheap Large scale treatment of cell suspensionsand plant cells TABLE 4.0-1. Mechanical Cell Disintegration Techniques方法技術(shù)原理效果成本舉例機(jī)械法勻漿法（片型）細(xì)胞被攪拌器劈碎適中適中動(dòng)物組織及動(dòng)物細(xì)胞研磨法細(xì)胞被研磨物磨碎適中便宜超聲波法用超聲波的空穴作用使細(xì)胞破碎適中昂貴細(xì)胞懸浮液小規(guī)模處理勻漿法（孔型）須使細(xì)胞通過的小孔，使細(xì)胞受到剪切力而破碎劇烈適中細(xì)胞懸浮液大規(guī)模處理

7、珠磨破碎法細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理表 4.0-1. 細(xì)胞物理破碎法化學(xué)方法主要的幾種化學(xué)方法，有滲透沖擊法，表面活性劑增溶法、脂溶法。首先簡單的介紹一下酶消化法和堿處理法。酶消化法和堿處理法都是細(xì)胞破碎的有效方法，但是也都有各自的缺點(diǎn)。原理：利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上的特殊鍵，從而達(dá)到破壁的目的。自溶法控制一定條件，誘發(fā)細(xì)胞自溶酶使細(xì)胞破碎。自溶法常采用加熱法或干燥法。外加酶法根據(jù)細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)及組成選擇合適的酶。細(xì)菌大多用溶菌酶(lysozyme)酵母菌常用溶酶有： -1,3-葡聚糖酶(glucanase)、-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶(protease

8、)、甘露糖酶(mannanase)、糖苷酶(glycosidase)、肽鍵內(nèi)切酶(endopeptidase)、殼多糖酶等。酶溶法酶溶法需要特定的反應(yīng)條件。酶具有高度專一性，必須根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿富蛉苊赶到y(tǒng)，并確定相應(yīng)的次序。酶溶法的優(yōu)點(diǎn)是：具有選擇性釋放產(chǎn)物條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。酶溶法的不足：一是溶酶價(jià)格高；二是酶溶法通用性差，且不易確定最佳的溶解條件；三是存在產(chǎn)物抑制酶消化法的缺點(diǎn)在于酶的價(jià)格昂貴限制了在大規(guī)模生產(chǎn)中的使用，雖然條件溫和、具有選擇性。細(xì)胞懸浮液中加入酶能迅速和細(xì)胞壁反應(yīng)并破壞它們。酶選擇性的催化細(xì)胞壁反應(yīng)，不破壞細(xì)胞內(nèi)的其它物質(zhì)。堿處理法

9、和酶消化法相反，反應(yīng)激烈，不具選擇性，而且較便宜。堿加入細(xì)胞懸浮液中后和細(xì)胞壁進(jìn)行了多種反應(yīng)，包括使磷脂皂化。該操作是細(xì)胞增溶的很好的例子，因?yàn)樗辜?xì)胞壁的成分溶于表面活性劑，也使蛋白質(zhì)變性。該法不僅破壞了細(xì)胞壁也破壞了產(chǎn)物，因此即便很便宜，堿處理也是一種很不常用的方法。Osmotic Shock(滲透沖擊法)三種主要細(xì)胞破碎化學(xué)方法中最簡單的是滲透沖擊法。此法將一定體積的細(xì)胞液加到2倍體積的水中，細(xì)胞中溶質(zhì)濃度高，水不斷進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞膨脹，最后導(dǎo)致破裂。細(xì)胞破裂后釋放到周圍環(huán)境中的胞內(nèi)物可用后面章節(jié)介紹的方法分離。細(xì)胞破碎的難易決定于其類型，紅血球細(xì)胞容易溶破。植物細(xì)胞很難溶破，因?yàn)橹参锛?xì)

10、胞中含有大量的木質(zhì)成分，通過滲透流很難滲透。機(jī)械破碎高壓勻漿超聲粉碎高壓勻漿工作原理：利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)使細(xì)胞破裂。在高壓勻漿器中，高壓室的壓力高達(dá)幾百個(gè)大氣壓，細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時(shí)，速度可達(dá)每 秒幾百米。細(xì)胞的勻漿破碎過程可用下述一級(jí)反應(yīng)方程式來描述： Ct/Cm1et/Ct破碎細(xì)胞經(jīng)t時(shí)間后的產(chǎn)物濃度，mol/LCm 破碎細(xì)胞經(jīng)可達(dá)的最高產(chǎn)物濃度，mol/L 細(xì)胞破碎的時(shí)間常數(shù)，隨剪切強(qiáng)度和壓力而改變，minJJ-2組織搗碎勻漿機(jī) 2. Ultrasonication 超聲波超聲波破碎儀 破碎機(jī)理：可能與空化現(xiàn)象（Cavitation p

11、henomena）引起的沖擊波和剪切作用有關(guān)通常采用的超聲破碎機(jī)在1525KHz的頻率 下操作。超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及菌種類型等因素有關(guān)。細(xì)胞種類：桿菌比球菌較易破碎，革蘭氏陰性細(xì)胞比革蘭氏陽性細(xì)胞較易破碎，對酵母菌的效果較差。超聲波振蕩易引起溫度的劇烈上升，操作時(shí)常在冷卻條件下進(jìn)行。小規(guī)模實(shí)驗(yàn)常采用間歇操作，大規(guī)模生產(chǎn)受限制。超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)失活，因而有一定的局限性WSK臥式高效全能珠磨機(jī)3. Crushing in ball mill 珠磨法 ZM系列臥式密閉珠(砂)磨機(jī)在珠磨法中，細(xì)胞的破碎率也能用一級(jí)速率方程式表示： ln1/(1-R)=KtK破碎速率常數(shù)t停留時(shí)間R破碎率破碎速率常數(shù)K與許多操作參數(shù)有關(guān)，如攪拌轉(zhuǎn)速、料液的循環(huán)流速、細(xì)胞懸浮液的濃度、玻璃小珠的裝置和珠體的直徑以及溫度等。選擇破碎方法的依據(jù)細(xì)胞處理量：大規(guī)模生產(chǎn)多采用機(jī)械法（通用性強(qiáng)，破碎效率高），實(shí)驗(yàn)室規(guī)模多選用非機(jī)械法（選擇性好，固液易分離）。細(xì)胞壁的強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性：對活性物質(zhì)產(chǎn)品，要兼顧效率與穩(wěn)定性。破碎程度：操作條件