1、有機(jī)溶劑中酶催化活性研究進(jìn)展有機(jī)溶劑中酶催化活性研究進(jìn)展LOGO 1984年，年，Klibanov提出提出:只要條件合適，只要條件合適，酶在非生物體系的酶在非生物體系的有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑中同樣具有中同樣具有催化功能。催化功能。目錄目錄影響有機(jī)溶劑中酶催化活性的因素影響有機(jī)溶劑中酶催化活性的因素提高酶在有機(jī)溶劑中活性的策略提高酶在有機(jī)溶劑中活性的策略有機(jī)溶劑中酶的應(yīng)用有機(jī)溶劑中酶的應(yīng)用有機(jī)有機(jī)溶劑溶劑中酶催化反應(yīng)的優(yōu)勢中酶催化反應(yīng)的優(yōu)勢有機(jī)溶劑中酶催化反應(yīng)的優(yōu)勢有機(jī)溶劑中酶催化反應(yīng)的優(yōu)勢高度的底物選擇性高度的底物選擇性絕大多數(shù)有絕大多數(shù)有機(jī)化合物機(jī)化合物在非水系統(tǒng)內(nèi)溶解度很高在非水系統(tǒng)內(nèi)溶解度很高

2、根據(jù)熱力學(xué)原理，一些根據(jù)熱力學(xué)原理，一些在水中不可能進(jìn)行的反應(yīng)在水中不可能進(jìn)行的反應(yīng)，有可能在，有可能在非水系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行非水系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑可促使熱力學(xué)平衡向合成方向可促使熱力學(xué)平衡向合成方向（如酯合成、肽合成（如酯合成、肽合成等）移動，如蛋白水解酶在水中催化肽鍵水解，而在有機(jī)溶等）移動，如蛋白水解酶在水中催化肽鍵水解，而在有機(jī)溶劑中則催化肽鍵合成劑中則催化肽鍵合成在有機(jī)溶劑中，所有在有機(jī)溶劑中，所有有水參與的副反應(yīng)（如酸酐水解）將受有水參與的副反應(yīng)（如酸酐水解）將受到抑制到抑制有機(jī)溶劑中酶催化反應(yīng)的優(yōu)勢有機(jī)溶劑中酶催化反應(yīng)的優(yōu)勢在有機(jī)溶劑中酶的在有機(jī)溶劑中酶的熱穩(wěn)定性顯著提高熱穩(wěn)定性

3、顯著提高，可通過提高溫度加可通過提高溫度加速催化反應(yīng)進(jìn)行速催化反應(yīng)進(jìn)行從非水系統(tǒng)內(nèi)從非水系統(tǒng)內(nèi)回收反應(yīng)產(chǎn)物比水中容易回收反應(yīng)產(chǎn)物比水中容易在非水系統(tǒng)內(nèi)在非水系統(tǒng)內(nèi)酶很容易回收和反復(fù)使用酶很容易回收和反復(fù)使用在有機(jī)溶劑中在有機(jī)溶劑中不易發(fā)生微生物污染不易發(fā)生微生物污染低水環(huán)境可用于低水環(huán)境可用于穩(wěn)定具有未知催化性質(zhì)的構(gòu)象異構(gòu)體穩(wěn)定具有未知催化性質(zhì)的構(gòu)象異構(gòu)體低水環(huán)境可用于低水環(huán)境可用于穩(wěn)定在水中壽命極短的酶反應(yīng)中間體穩(wěn)定在水中壽命極短的酶反應(yīng)中間體影響有機(jī)溶劑中酶催化活性的因素影響有機(jī)溶劑中酶催化活性的因素必需水必需水有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑酶酶緩沖液緩沖液鹽效應(yīng)鹽效應(yīng)配體、冷凍干燥劑、賦形劑配體、冷凍

4、干燥劑、賦形劑超聲輻射、抑制劑超聲輻射、抑制劑必需水必需水目的：目的：有機(jī)相酶催化必需微量的水維持有機(jī)相酶催化必需微量的水維持酶活性結(jié)構(gòu)酶活性結(jié)構(gòu)（氫鍵、疏水鍵、靜電作用、（氫鍵、疏水鍵、靜電作用、范德華力）范德華力）含水量表示方法：百分水含量含水量表示方法：百分水含量-熱力學(xué)水熱力學(xué)水活度活度aw原因：水解平衡時，各相的原因：水解平衡時，各相的aw值相等；值相等；體系的改變伴隨著水活度的變化，故從體系的改變伴隨著水活度的變化，故從aw值可以推斷酶的活性值可以推斷酶的活性水模擬物：水模擬物：對水比較敏感對水比較敏感的有機(jī)相酶促的有機(jī)相酶促反應(yīng)反應(yīng) （如（如:肽的合成）肽的合成）:甲醇、二甲基甲

5、酰甲醇、二甲基甲酰胺、四氫呋喃胺、四氫呋喃 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑 影響酶活原因：影響酶活原因： 有機(jī)溶劑影響酶反應(yīng)過程中底物和產(chǎn)物有機(jī)溶劑影響酶反應(yīng)過程中底物和產(chǎn)物擴(kuò)散擴(kuò)散，從而間接地影，從而間接地影響酶活性響酶活性 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑“剝奪剝奪”酶分子表面必需水導(dǎo)致酶活力下降酶分子表面必需水導(dǎo)致酶活力下降 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑直接與酶作用直接與酶作用，通過破壞酶蛋白活性構(gòu)型的氫鍵、，通過破壞酶蛋白活性構(gòu)型的氫鍵、疏水鍵作用等，抑制酶活性或使酶失活疏水鍵作用等，抑制酶活性或使酶失活 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑酶活的評價：酶活的評價：溶劑疏水性參數(shù)溶劑疏水性參數(shù)LogP值值：溶劑溶劑logP越高越高，其抑制其抑制酶

6、活酶活作用越強(qiáng)作用越強(qiáng)；溶劑的溶劑的疏水性增加疏水性增加，酶熱穩(wěn)定性降低酶熱穩(wěn)定性降低（添加劑添加劑-所使用的溶劑所使用的溶劑logP）酶的相對反應(yīng)速率與溶劑酶的相對反應(yīng)速率與溶劑LogP之間并不呈現(xiàn)線性關(guān)系之間并不呈現(xiàn)線性關(guān)系分配系數(shù)分配系數(shù)(P)：產(chǎn)物分配系數(shù)產(chǎn)物分配系數(shù)(Pp)與底物分配系數(shù)與底物分配系數(shù)(Ps)比率比率(Pp/Ps)與酶相對與酶相對反應(yīng)速率之間有良好的線性關(guān)系反應(yīng)速率之間有良好的線性關(guān)系（一定條件下）（一定條件下）-描述酶在有機(jī)介質(zhì)中活描述酶在有機(jī)介質(zhì)中活性是十分有效性是十分有效有機(jī)溶劑變性強(qiáng)度參數(shù)變性量有機(jī)溶劑變性強(qiáng)度參數(shù)變性量(DC)單一參數(shù)無法全面表征酶活性的變化

7、，因此，在選擇有機(jī)相酶催化的有單一參數(shù)無法全面表征酶活性的變化，因此，在選擇有機(jī)相酶催化的有機(jī)溶劑必須從不同方面來考慮。機(jī)溶劑必須從不同方面來考慮。酶酶 形式形式：酶粉、化學(xué)修飾酶和固定化酶酶粉、化學(xué)修飾酶和固定化酶 化學(xué)修飾：化學(xué)修飾酶由于改變了理化性質(zhì)，故對酶活性有化學(xué)修飾：化學(xué)修飾酶由于改變了理化性質(zhì)，故對酶活性有很大的影響：用糖脂修飾的很大的影響：用糖脂修飾的SOD在有機(jī)溶劑中的酶活性甚至在有機(jī)溶劑中的酶活性甚至比水中還高比水中還高 固定化酶：酶穩(wěn)定性增加；底物在載體與有機(jī)介質(zhì)中分配；固定化酶：酶穩(wěn)定性增加；底物在載體與有機(jī)介質(zhì)中分配；疏水性底物在載體周圍濃度較低；載體影響物質(zhì)傳遞疏水

8、性底物在載體周圍濃度較低；載體影響物質(zhì)傳遞緩沖液緩沖液 酶冷凍干燥時的緩沖液對有機(jī)相酶催化活性有極重要的影響，酶冷凍干燥時的緩沖液對有機(jī)相酶催化活性有極重要的影響，緩沖液有四個重要因子緩沖液有四個重要因子:pH、緩沖液類型緩沖液類型、緩沖液的量緩沖液的量、水水的濃度的濃度 有機(jī)溶劑中的酶有些能夠有機(jī)溶劑中的酶有些能夠“記憶記憶”它冷凍干燥或丙酮沉淀前所它冷凍干燥或丙酮沉淀前所在緩沖液中的在緩沖液中的pH，這種現(xiàn)象為，這種現(xiàn)象為“pH記憶記憶”（1）酶的反應(yīng)速度與其冷凍干燥前水溶液的）酶的反應(yīng)速度與其冷凍干燥前水溶液的pH密切相關(guān)密切相關(guān)（2）反應(yīng)的最適）反應(yīng)的最適pH接近于水溶液中的最適接近于

9、水溶液中的最適pH緩沖液緩沖液 緩沖溶液種類緩沖溶液種類：由于緩沖液對酶表面微弱的：由于緩沖液對酶表面微弱的物理效應(yīng)物理效應(yīng)；不同；不同的緩沖液在結(jié)晶和冷凍干燥過程中，冰凍水溶液的的緩沖液在結(jié)晶和冷凍干燥過程中，冰凍水溶液的相行為相行為的的差異；緩沖液與殘余水之間差異；緩沖液與殘余水之間相互作用相互作用的不同；不同緩沖液與的不同；不同緩沖液與酶或底物間存在相互作用。酶或底物間存在相互作用。 由于酶離子化基團(tuán)質(zhì)子化狀態(tài)與酶活性關(guān)系密切，因此可采由于酶離子化基團(tuán)質(zhì)子化狀態(tài)與酶活性關(guān)系密切，因此可采用適當(dāng)?shù)挠眠m當(dāng)?shù)挠袡C(jī)相緩沖液控制低水介質(zhì)中酶離子化狀態(tài)有機(jī)相緩沖液控制低水介質(zhì)中酶離子化狀態(tài)，進(jìn)而，進(jìn)

10、而影響酶活性。如：氨基酸影響酶活性。如：氨基酸-氨基酸氯鹽對氨基酸氯鹽對(如如Lys and Lys.HCI)固態(tài)緩沖液的研究表明合適的結(jié)晶固體能控制有機(jī)介質(zhì)中酸固態(tài)緩沖液的研究表明合適的結(jié)晶固體能控制有機(jī)介質(zhì)中酸-堿條件。堿條件。 鹽效應(yīng)鹽效應(yīng) 研究現(xiàn)象：研究現(xiàn)象：酶活性隨著酶活性隨著KCI濃度升高而急劇上升濃度升高而急劇上升 鹽誘導(dǎo)酶活性機(jī)理被認(rèn)為有兩個重要因素鹽誘導(dǎo)酶活性機(jī)理被認(rèn)為有兩個重要因素 鹽保護(hù)酶免受有機(jī)溶劑毒害鹽保護(hù)酶免受有機(jī)溶劑毒害 在冷凍干燥過程中，鹽可以保持酶的天然構(gòu)型在冷凍干燥過程中，鹽可以保持酶的天然構(gòu)型 鹽效應(yīng)鹽效應(yīng) Y.L.Khmelnitsky：鹽基質(zhì)對有機(jī)溶劑

11、致使酶失活提供一種保鹽基質(zhì)對有機(jī)溶劑致使酶失活提供一種保護(hù)效應(yīng)護(hù)效應(yīng)【當(dāng)當(dāng)鹽濃度較低鹽濃度較低時，冷凍干燥蛋白酶構(gòu)成的固體催化時，冷凍干燥蛋白酶構(gòu)成的固體催化顆粒具有顆粒具有疏松結(jié)構(gòu)疏松結(jié)構(gòu);當(dāng)當(dāng)鹽濃度較高鹽濃度較高時，催化顆粒象鹽晶體一樣，時，催化顆粒象鹽晶體一樣，具有剛性結(jié)構(gòu)，對酶起保護(hù)作用具有剛性結(jié)構(gòu)，對酶起保護(hù)作用】 Michael ：鹽誘導(dǎo)催化活性是由于鹽誘導(dǎo)催化活性是由于冷凍干燥時間與酶水含量冷凍干燥時間與酶水含量而決定的而決定的【酶活性隨冷凍干燥時間增加而增加，水含量低于酶活性隨冷凍干燥時間增加而增加，水含量低于最適含量，則迅速降低最適含量，則迅速降低】 顯然不同的催化效率是基于

12、鹽的結(jié)合與冷凍干燥過程雙重結(jié)顯然不同的催化效率是基于鹽的結(jié)合與冷凍干燥過程雙重結(jié)果?？梢?，鹽效應(yīng)機(jī)制有待進(jìn)一步研究果?？梢姡}效應(yīng)機(jī)制有待進(jìn)一步研究配體、冷凍干燥劑、賦形劑配體、冷凍干燥劑、賦形劑 酶在凍干前可用酶在凍干前可用配體、冷凍干燥劑配體、冷凍干燥劑為酶作印跡，使酶以一種為酶作印跡，使酶以一種高活性構(gòu)象形式高活性構(gòu)象形式而經(jīng)凍干在有機(jī)介質(zhì)中得以保持，這種現(xiàn)象而經(jīng)凍干在有機(jī)介質(zhì)中得以保持，這種現(xiàn)象稱之為稱之為“分子印跡分子印跡” 冷凍干燥劑冷凍干燥劑：山梨醇、木糖醇、海藻糖、甘露醇山梨醇、木糖醇、海藻糖、甘露醇 賦形劑與酶冷凍干燥后也極大地提高酶活性，賦形劑與酶冷凍干燥后也極大地提高酶活

13、性，但直接向有機(jī)但直接向有機(jī)溶劑中加賦形劑對反應(yīng)無大的影響溶劑中加賦形劑對反應(yīng)無大的影響 賦形劑賦形劑激發(fā)酶機(jī)理激發(fā)酶機(jī)理：賦形劑能賦形劑能緩解酶在冷凍干燥時失活緩解酶在冷凍干燥時失活，賦，賦形劑所激發(fā)的酶活性通過用無水有機(jī)溶劑洗掉賦形劑后消失，形劑所激發(fā)的酶活性通過用無水有機(jī)溶劑洗掉賦形劑后消失，這與配體作用機(jī)理有所不同這與配體作用機(jī)理有所不同超聲輻射、抑制劑超聲輻射、抑制劑在適宜的條件下，在適宜的條件下，低強(qiáng)度的超聲輻射對酶有一定的激活作用低強(qiáng)度的超聲輻射對酶有一定的激活作用，這種激活，這種激活作用隨著時間的增加而愈加明顯作用隨著時間的增加而愈加明顯超聲超聲處理處理酶處方式：一種是超聲預(yù)處

14、理，即首先在超聲介質(zhì)中對酶進(jìn)行酶處方式：一種是超聲預(yù)處理，即首先在超聲介質(zhì)中對酶進(jìn)行超聲處理，酶回收處理后再置于反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行酶促反應(yīng)；超聲處理，酶回收處理后再置于反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行酶促反應(yīng)；另一種是直另一種是直接對反應(yīng)介質(zhì)中的酶進(jìn)行超聲處理接對反應(yīng)介質(zhì)中的酶進(jìn)行超聲處理,超聲處理與酶促反應(yīng)同時進(jìn)行超聲處理與酶促反應(yīng)同時進(jìn)行脂肪酶的抑制劑脂肪酶的抑制劑(具有兩親特性的具有兩親特性的表面活性劑、膽汁鹽、金屬離子表面活性劑、膽汁鹽、金屬離子等等):表表面活性劑在合適的濃度下，能促進(jìn)酶的活性和穩(wěn)定性的提高，而采用膽面活性劑在合適的濃度下，能促進(jìn)酶的活性和穩(wěn)定性的提高，而采用膽汁鹽和金屬離子時，不僅酶活性

15、沒有提高，在濃度較高時，反而有顯著汁鹽和金屬離子時，不僅酶活性沒有提高，在濃度較高時，反而有顯著的抑制作用的抑制作用提高酶在有機(jī)溶劑中活性的策略影響酶活性的因素影響酶活性的因素 克服質(zhì)量傳遞的限制克服質(zhì)量傳遞的限制優(yōu)化優(yōu)化pH狀況狀況 必需水必需水有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑 酶酶影響酶活性的因素影響酶活性的因素+造成酶在有機(jī)溶劑中活性顯著下降主要原因造成酶在有機(jī)溶劑中活性顯著下降主要原因=提出提出使酶在有機(jī)介質(zhì)中的活性激活的一系列有效辦法能使酶反應(yīng)速度提高使酶在有機(jī)介質(zhì)中的活性激活的一系列有效辦法能使酶反應(yīng)速度提高102-105倍。倍。對應(yīng)策略對應(yīng)策略提高酶的分子柔性提高酶的分子柔性防止酶的變性防止酶的

16、變性 鹽效應(yīng)鹽效應(yīng) 緩沖液緩沖液 配體、冷凍干燥劑、賦形劑配體、冷凍干燥劑、賦形劑克服質(zhì)量傳遞的限制克服質(zhì)量傳遞的限制-部分原因部分原因 目前，用于有機(jī)溶劑的酶制劑通常是從水溶液里經(jīng)冷凍干燥目前，用于有機(jī)溶劑的酶制劑通常是從水溶液里經(jīng)冷凍干燥制備出來的粉末制備出來的粉末/顆粒，這些酶粉懸浮在有機(jī)相里顆粒，這些酶粉懸浮在有機(jī)相里，造成造成底物底物向酶的擴(kuò)散向酶的擴(kuò)散受到限制受到限制 酶分子互相疊合酶分子互相疊合，也容易造成一些酶分子的活性中心被周圍也容易造成一些酶分子的活性中心被周圍的酶分子封閉的酶分子封閉，使底物分子難以靠近使底物分子難以靠近 通過通過增加攪拌力度和減小酶粉顆粒增加攪拌力度和減

17、小酶粉顆粒來得到緩解來得到緩解優(yōu)化優(yōu)化pH狀況狀況 適當(dāng)?shù)倪m當(dāng)?shù)膒H處理可以使酶活性提高處理可以使酶活性提高100倍倍 pH記憶效應(yīng)記憶效應(yīng) -如果冷凍干燥前溶解酶的緩沖溶液具有酶在水如果冷凍干燥前溶解酶的緩沖溶液具有酶在水溶液的最適溶液的最適pH值值，那么酶在有機(jī)介質(zhì)中表現(xiàn)出來的活性也最那么酶在有機(jī)介質(zhì)中表現(xiàn)出來的活性也最大大 如果選用如果選用揮發(fā)性揮發(fā)性的的（如甲酸銨如甲酸銨）或或能溶于有機(jī)相能溶于有機(jī)相的的(如三異辛如三異辛胺及其鹽酸化物、三苯基乙酸及其鈉鹽胺及其鹽酸化物、三苯基乙酸及其鈉鹽）弱酸弱酸/弱堿緩沖溶液弱堿緩沖溶液，酶在有機(jī)溶劑中表現(xiàn)出來的酶在有機(jī)溶劑中表現(xiàn)出來的pH記憶效應(yīng)

18、就會消失記憶效應(yīng)就會消失，從而導(dǎo)致從而導(dǎo)致酶活性產(chǎn)生變化。酶活性產(chǎn)生變化。提高酶的分子柔性提高酶的分子柔性 有機(jī)溶劑取代水作為反應(yīng)介質(zhì)有機(jī)溶劑取代水作為反應(yīng)介質(zhì)，使酶分子因缺少水的潤滑作使酶分子因缺少水的潤滑作用而變得結(jié)構(gòu)更為剛性用而變得結(jié)構(gòu)更為剛性-酶活性降低主要因素酶活性降低主要因素 向反應(yīng)體系加入一定量的水分或把體系的熱力學(xué)水活度向反應(yīng)體系加入一定量的水分或把體系的熱力學(xué)水活度(aw)調(diào)節(jié)到最佳值調(diào)節(jié)到最佳值，可以使酶的反應(yīng)速度提高可以使酶的反應(yīng)速度提高100倍以上倍以上 水的這種潤滑劑作用可以被其它一些能水的這種潤滑劑作用可以被其它一些能形成氫鍵的溶劑形成氫鍵的溶劑(如甘如甘油、甘醇油

19、、甘醇)所取代所取代 用蛋白質(zhì)變性劑對酶進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚硪部赡苁姑傅牡鞍踪|(zhì)用蛋白質(zhì)變性劑對酶進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚硪部赡苁姑傅牡鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)因結(jié)構(gòu)因部分展開而變得更加柔韌靈活部分展開而變得更加柔韌靈活,從而達(dá)到提高酶活力的從而達(dá)到提高酶活力的效果。效果。 防止酶的變性防止酶的變性 誤認(rèn)為：誤認(rèn)為：酶在有機(jī)溶劑中活性下降的主要原因是酶的蛋白質(zhì)酶在有機(jī)溶劑中活性下降的主要原因是酶的蛋白質(zhì)構(gòu)型發(fā)生變化。構(gòu)型發(fā)生變化。 事實(shí)事實(shí)：蛋白質(zhì)變性作用并不是由于酶和溶劑的接觸所引起的蛋白質(zhì)變性作用并不是由于酶和溶劑的接觸所引起的,而是引入溶劑之前酶的脫水過程而是引入溶劑之前酶的脫水過程(如冷凍干燥如冷凍干燥)造成的造成的，而且而且由此產(chǎn)生的變性作用是可逆性由此產(chǎn)生的變性作用是可逆性的【的【先把酶溶解在少量水里先把酶溶解在少量水里，使已變性的蛋白質(zhì)構(gòu)型重新恢復(fù)使已變性的蛋白質(zhì)構(gòu)型重新恢復(fù)，然后再引入然后再引入有機(jī)溶劑】有機(jī)溶劑】防止酶的變性防止酶的變性 關(guān)關(guān)鍵是要避免或減少酶在