1、收稿日期:2008205209;修回日期:2008205213作者簡介:吳永強(qiáng)(19762男,博士研究生,助理研究員,主要從事噬菌體單克隆抗體的研究工作。人源化單克隆抗體研究進(jìn)展吳永強(qiáng)1綜述;董關(guān)木2審校(1中國生物技術(shù)集團(tuán)公司武漢生物制品研究所,武漢 430060;2中國藥品生物制品檢定所,北京 100050摘 要:盡管通過幾種展示文庫和轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)可以制備人源單克隆抗體,但是人源化鼠源單克隆抗體使之用于人體治療仍為抗體研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本文總結(jié)了單克隆抗體人源化的幾種方法,并對其將來的發(fā)展進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞:單克隆抗體;人源化;研究進(jìn)展中圖分類號(hào):文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):100525673

2、(2008022*通過免疫的、天然的以及合成的抗體庫展示技術(shù)112或者是利用轉(zhuǎn)基因小鼠122雖然可以獲得人源單克隆抗體,但是經(jīng)進(jìn)一步改造傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)所制備的大量鼠源單克隆抗體,仍然是目前開發(fā)用于人類疾病治療的一種可能途徑和源頭。如若將這些特異性和親和力較強(qiáng)的非人源單抗進(jìn)行人源化改造后,仍然比從頭開始以新的靶點(diǎn)來開發(fā)治療性單抗制劑更有應(yīng)用前景。早期的臨床試驗(yàn)證明鼠源性單抗為異種蛋白應(yīng)用于人體后132,可引起機(jī)體免疫系統(tǒng)對該異種蛋白的免疫排斥反應(yīng),產(chǎn)生人抗鼠抗體(H uman anti 2mouse an ti b ody ,HA MA 應(yīng)答,重復(fù)使用時(shí)甚至可導(dǎo)致病人嚴(yán)重的過敏性休克;其次鼠單

3、抗通常不能有效激活機(jī)體的生物效應(yīng)功能,如補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒及抗體依賴的細(xì)胞毒作用。此外,由于HA MA 反應(yīng)的存在,鼠單抗在人體內(nèi)往往被快速清除,其半衰期也較短。隨著對各類抗體結(jié)構(gòu)和氨基酸序列、及其變異的種屬和功能之間關(guān)系的深入了解,而能夠利用抗體工程技術(shù)對抗體結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。抗體的應(yīng)用經(jīng)歷了非人源抗體、人2鼠嵌合抗體、人源化抗體、Pri m a 2tiz ati o n14282,最終可到制備全人源單抗的轉(zhuǎn)基因小鼠和噬菌體展示文庫等不同的階段。其中將動(dòng)物來源的單克隆抗體人源化(Monoclonal human ization,以降低這些單抗的免疫原性使之可成為用于人類疾病的治療,仍然是目前研究的

4、一個(gè)熱點(diǎn)。本文就人源化單克隆抗體的研究進(jìn)展作一綜述。至今人源化單抗通常使用的方法主要有嵌合(Ch i m erization192、重構(gòu)(Reshap i n g和表面重塑(Resurf aci n g1102。1嵌合抗體用人源抗體恒定區(qū)取代鼠單抗恒定區(qū)而構(gòu)建的人2鼠嵌合抗體14,72,已被證實(shí)保留了其親本鼠單抗的特異性抗原結(jié)合能力并能夠降低免疫原性,目前美國正式批準(zhǔn)上市的4個(gè)人2鼠嵌合抗體產(chǎn)品在臨床應(yīng)用中取得良好效果。嵌合抗體就是將非人源抗體可變區(qū)移植到人抗體恒定區(qū),仍保留了原來鼠源抗體約30%左右的鼠源序列,其免疫原性雖有所降低,但仍可引起不同程度的HA M A 192142應(yīng)答。為了降低

5、在嵌合抗體中鼠源部分,只移植鼠抗體互補(bǔ)決定區(qū)(Co mple mentarity deter m ining re i g n,CDRs,而不移植整個(gè)抗體可變區(qū),所構(gòu)建的/嵌合0抗體隨后就成為了研究熱點(diǎn)1152。Roberto 等1162認(rèn)為抗體CD R 區(qū)中僅有部分與抗原相接觸的氨基酸殘基,決定該抗體的特異性,這被稱之為特異性決定殘基(Spec ific ity 2D eter m ining Resi d ues ,S DRs,Roberto 等在構(gòu)建嵌合抗體時(shí),僅僅移植CD R s 區(qū)內(nèi)這些必需的SD R s 到人抗體框架區(qū),成功地改造了一個(gè)抗癌胚抗原的鼠源單抗C OL 21,顯著地降低

6、了其免疫原性,臨床顯示了很好的治療效果。無論CDRs 或SD R s 移植所構(gòu)建的/嵌合0抗體與其親本非人源單抗相比,其抗原的親和力都有一定程度的降低,因?yàn)橛H本非人源單抗框架區(qū)的某些氨基酸位點(diǎn)參與了抗原結(jié)合或者對維持抗原結(jié)合區(qū)構(gòu)象具有重要作用1172。同時(shí)在對大量的嵌合抗體研究中發(fā)現(xiàn)有時(shí)其生物學(xué)效應(yīng)并不一定完全與預(yù)期設(shè)想相符1182。2抗體改型技術(shù)(An ti b ody r eshap ing的應(yīng)用每一抗體分子Fab段的輕、重鏈可變區(qū)具有6個(gè)抗原互補(bǔ)決定區(qū)(CD R。CDR1、CD R2和CDR3之間有一個(gè)起結(jié)構(gòu)穩(wěn)定作用的框架區(qū)(FR,即以FR分隔而起支架作用,共同形成CD R平面可直接接觸

7、抗原,決定抗體的特異性,FR只是作為支持CDR的支架,而且其立體構(gòu)象極為保守。改型抗體就是移植非人源抗體的CDR到人抗體骨架區(qū)(Fra me work region,FR,同時(shí)維持與親本非人源抗體相似的CDR構(gòu)象構(gòu)建而成的人源化抗體1192222。相對于親本非人源抗體和嵌合抗體,改型抗體僅有9%來源于親本非人源的單抗,經(jīng)臨床試驗(yàn)證明,其改型抗體的免疫原性得到顯著降低1232。在抗體改型試驗(yàn)中1192222,為了使改型抗體與其親本鼠單抗和抗原相結(jié)合的特異性及親和力盡可能一致,就必需保證改型抗體與其親本抗體有相似的抗原互補(bǔ)決定區(qū)立體構(gòu)象。眾多實(shí)驗(yàn)證明,在FR 區(qū)某些關(guān)鍵位點(diǎn)上保持原有的氨基酸殘基對

8、抗原互補(bǔ)決定區(qū)構(gòu)象至關(guān)重要,通常這些位點(diǎn)應(yīng)被同時(shí)移植到人抗體FR124,172。如果僅僅移植CDRs至人抗體FR而忽視這些關(guān)鍵位點(diǎn)上的氨基酸殘基,其抗原互補(bǔ)決定區(qū)的構(gòu)象會(huì)將發(fā)生較大的改變125,262。然而,CDR構(gòu)象的微小改變均可能導(dǎo)致抗原親和力降低117,262。多數(shù)情況下,僅僅移植CDRs到人抗體FR上產(chǎn)生的改型抗體將喪失全部或大部分抗原親和力,只有同時(shí)再移植某些關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸殘基(通常該位點(diǎn)的氨基酸殘基維持著高變區(qū)的構(gòu)象后才能保持改型抗體的抗原親和力。所以,如何識(shí)別這些影響CDRs構(gòu)象的框架區(qū)氨基酸殘基位點(diǎn)就顯得尤為重要,盡管Foote and W i n ter定義了單抗框架區(qū)關(guān)鍵

9、氨基酸位點(diǎn)的/游標(biāo)0區(qū)(Vernier z one1172,親本鼠單抗的這些位點(diǎn)氨基酸殘基應(yīng)當(dāng)保留在人源化抗體中,但是一般來說還是要通過更多的經(jīng)驗(yàn)分析或計(jì)算機(jī)模擬分析,并進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證才能更準(zhǔn)確的定位這些關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn),并將其保留在改型抗體中1272312,以維持改型抗體與抗原的親和力。3抗體表面重塑技術(shù)(An tibody r esurfa cing的應(yīng)用1991年P(guān)adlan提出了利用表面重塑的方法來改造非人源抗體,此方法的原則就是將非人源單抗可變區(qū)(Fv表面非人源的基酸殘基替換為人源性的氨基酸殘基132,332,使非人源抗體Fv區(qū)的表面人源化,降低其免疫原性,同時(shí)不影響Fv區(qū)的整體空間

10、構(gòu)象,從而保留其抗原結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)。這個(gè)方法的程序是首先模擬抗原結(jié)合區(qū)構(gòu)象,然后識(shí)別框架區(qū)非人源的氨基酸殘基,最后將非人源的氨基酸殘基人源化。表面重塑抗體應(yīng)用于人體時(shí)是否會(huì)引起免疫應(yīng)答,迄今尚未見有臨床報(bào)道。2006年Stae lens等用表面重塑的方法改造了抗血管假性血友病因子鼠單抗82D6A3,將抗體可變區(qū)10個(gè)鼠源氨基酸殘基替換為人源殘基,獲得了很好的結(jié)果1342。表面重塑技術(shù)優(yōu)于移植重構(gòu)技術(shù),在設(shè)計(jì)人源化抗體時(shí)更簡單一些,因?yàn)樵摷夹g(shù)僅需改變表面殘基即可,而保留了大量內(nèi)核的非人源殘基。所以重塑抗體中抗原結(jié)合區(qū)構(gòu)象及相對位置與原有抗體更為接近。另一方面,重構(gòu)抗體在用于人體感染、自身免疫疾病

11、、Neoplastic疾病治療時(shí)表明,仍有微弱的免疫原性,而重塑抗體目前仍未見有臨床實(shí)際應(yīng)用的報(bào)道。表面重塑技術(shù)的基本理論依據(jù)是,暴露于表面的氨基酸殘基在免疫原性方面起重要作用。然而與重構(gòu)抗體相比,重塑抗體中含有大量的非人源殘基,因此可能會(huì)導(dǎo)致更大的異源免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生,尤其考慮到抗原提呈過程1322。4利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù),對鼠源抗體的人源化改造計(jì)算機(jī)與生物技術(shù)的發(fā)展日臻成熟,使其應(yīng)用于抗體人源化改造成為可能,指導(dǎo)抗體改型和抗體的表面重塑,取得了很好的效果。通過對抗原2抗體相互作用的模擬,對抗體分子微觀構(gòu)象與一級(jí)序列之間關(guān)系的推測,減少了抗體人源化過程中的盲目性。在非人源抗體的表面重塑試驗(yàn)中

12、,以鼠源單抗為例,通過Kabat數(shù)據(jù)庫比對輕、重鏈各亞型的基因序列136,172,親本鼠源抗體可變區(qū)表面非保守氨基酸殘基應(yīng)予替換成人的氨基酸殘基124,32,332。如上所述,為了保持表面重塑抗體與親本抗體對抗原結(jié)合的特異性及親和力盡可能一致,因此需在某些關(guān)鍵位點(diǎn)保留其原有的氨基酸殘基1282312。識(shí)別親本鼠抗體可變區(qū)人鼠間非保守的氨基酸殘基,可通過計(jì)算機(jī)技術(shù)對抗體輕、重鏈基因序列的同源性結(jié)合共有序列(Consensus sequences法進(jìn)行比對132,37,412,該共有序列可以通過標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)庫搜索程序來完成1382402。在抗體重構(gòu)試驗(yàn)中,識(shí)別人源抗體框架區(qū)中影響CD R構(gòu)象的氨基酸

13、殘基位點(diǎn)非常關(guān)鍵?；趯乖?抗體相互作用的計(jì)算機(jī)模擬,并分析氨基酸殘基、CDR的幾何距離和分子間氫鍵作用力,可以推測出這些關(guān)鍵氨基酸殘基的位點(diǎn),指導(dǎo)抗體重構(gòu)試驗(yàn)1422。Zhang等1422通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù),成功地改造了抗hTNF2A的鼠單克隆抗體Z12。首先使用FAS2 TA、BL AS TP和蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB進(jìn)行同源性比對,確定了以親本鼠Z12抗體結(jié)構(gòu)和序列相似性最高的人抗體FV區(qū)序列作為其人源化的模板,用分子對接技術(shù)模擬Z12Fv/hT NF2A復(fù)合體的結(jié)構(gòu),找出抗體FR影響CD R s抗原結(jié)合構(gòu)象的關(guān)鍵氨基酸殘基。發(fā)現(xiàn)有4個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基參與抗原接觸,有5個(gè)位點(diǎn)的氨基酸

14、殘基對維持CD R s構(gòu)象起關(guān)鍵作用,所以在人源化抗體中保留了這9個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基,另有6個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn),通過建立噬菌體抗體庫的隨機(jī)篩選,完成了對抗體Z12可變區(qū)進(jìn)行表面重塑的人源化改造。5通過抗體庫技術(shù)對非人源抗體進(jìn)行人源化5.1用噬菌體展示抗體組合文庫技術(shù)優(yōu)化人源改型抗體在通過CDR移植構(gòu)建人源改型抗體時(shí),最為困難的關(guān)鍵步驟是確定可影響抗原結(jié)合活性的骨架區(qū)殘基,利用分子模建進(jìn)行立體構(gòu)象分析僅能大致提示選擇分子殘基,得到理想的改型抗體具有較大難度,往往需要經(jīng)過反復(fù)構(gòu)建、表達(dá)及測試才能獲得。由于抗體庫技術(shù)具有強(qiáng)大的可供篩選的能力,以確定其須要移植的骨架區(qū)殘基。先通過分子結(jié)構(gòu)分析找出可能影響

15、抗原結(jié)合部位立體結(jié)構(gòu)的骨架區(qū)殘基,將這些殘基的非人源副本和人源副本同時(shí)組合到一個(gè)抗體庫中,或?qū)⑦@些殘基隨機(jī)化,通過篩選過程尋找最佳組合,確定哪些位點(diǎn)須要保留親本鼠源殘基。如Rosok等1432對Le w i s Y鼠源單抗進(jìn)行人源化時(shí),通過分子模建選擇了7個(gè)骨架區(qū)殘基,在合成人源改型抗體可變區(qū)基因時(shí)將這些位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)成人源殘基和鼠源殘基兩種,這樣7個(gè)殘基共有128個(gè)組合,構(gòu)建了一個(gè)噬菌體抗體庫,通過篩選獲得了親和力與親本鼠單抗接近的組合,確定了需要保留的親本鼠單抗骨架區(qū)殘基。Baca等1442在對VEGF 鼠單抗進(jìn)行人源化時(shí)則選擇了13個(gè)殘基進(jìn)行隨機(jī)化,獲得了理想的結(jié)果。Tsur ush it

16、a等1452在對雞I L2 12單抗進(jìn)行人源化時(shí),通過結(jié)合計(jì)算機(jī)的模型模擬,選擇了11個(gè)框架區(qū)氨基酸殘基位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)篩選,獲得了與親本單抗親和力及特異性相似的人源化抗體。5.2噬菌體展示組合文庫對抗原表位定向選擇Jespers等1462以鼠單抗可變區(qū)為模板,利用噬菌體展示技術(shù),通過抗原導(dǎo)向,篩選能夠模擬鼠單抗可變區(qū),結(jié)合相同抗原決定簇的人源抗體,稱為抗原表位定向選擇,或表位印模選擇(E pitope i m printed se lecti o n,E I S。其基本過程如下:選擇親本鼠單抗的輕鏈可變區(qū)基因與人源抗體的重鏈可變區(qū)基因文庫配對構(gòu)成/鼠2人雜合抗體庫0,用相應(yīng)的抗原篩選有結(jié)合活性的

17、克隆,得到可與該鼠單抗可變區(qū)配對,組成具有特異結(jié)合活性的人源重鏈可變區(qū)基因,再將此重鏈可變區(qū)基因與人源輕鏈可變區(qū)基因文庫組合構(gòu)建成人源抗體庫,再次進(jìn)行篩選,得到特異性與親本鼠單抗完全相同的人源單抗。但這個(gè)方法有時(shí)所獲的人源化抗體與抗原的結(jié)合特異性會(huì)產(chǎn)生漂移,與親本鼠單抗有所不同。可變區(qū)CD R3是決定抗體特異性的關(guān)鍵部位,而由于CD R3巨大的多樣性,本身并不具有明顯的種屬特異性,因此將親本鼠單抗的CDR3預(yù)先重組到人源抗體可變區(qū)文庫中,取代人源抗體的CDR3,能夠克服抗原2抗體結(jié)合特異性漂移的問題。Bei2 boer等1472對抗EGP22腫瘤相關(guān)抗原的鼠抗體MOC2 31進(jìn)行人源化時(shí),先用

18、鼠Fd段與人J、K輕鏈組合文庫配對,構(gòu)建兩個(gè)雜合抗體庫,從對應(yīng)的人輕鏈J 庫中篩選到雜合Fab,進(jìn)而確定了人源化的輕鏈序列。再用所獲得的人輕鏈與移植有MOC231V H CDR3的人Fd文庫組合成人源抗體庫,篩選到多株人源化單抗,它們保留了親本鼠單抗的特異性,且親和力高于或等于親本鼠單抗。Rader等1482在對抗整合素A v B3鼠單抗人源化時(shí),對人輕鏈和重鏈文庫分別預(yù)先組合了親本鼠A v B3單抗的V L CDR3與V H CDR3,然后采用同樣的方法進(jìn)行篩選,獲得了比較滿意的結(jié)果。Da ll.A cqua等1492采取/Fra me work shu f fling0的方法進(jìn)一步簡化了抗

19、原表位定向選擇法,用來改造抗酪氨酸激酶受體EphA2的Mc Ab B233取得了成功,其基本原理是:由于抗體Fab段是由3個(gè)CDRs 與框架區(qū)序列間隔排列所組成的,Dall.A cqua等通過整理公開的數(shù)據(jù)信息,建立了一個(gè)人源框架區(qū)序列庫,將51個(gè)人J鏈框架區(qū)序列與Mc Ab B233的3個(gè)輕鏈CD R s連接,并與Mc Ab B233的重鏈組合構(gòu)建一個(gè)噬菌體展示Fab文庫,用EphA2進(jìn)行篩選,確定了/Fra me wor k shuffli n g0后的輕鏈序列;然后再將50個(gè)人重鏈框架區(qū)序列與M c Ab B233的3個(gè)重鏈CD R s相連接,并與篩選到的輕鏈相組合構(gòu)建了另一個(gè)文庫,用同

20、樣的目的抗原篩選得到/Fra m e2 wor k shuffling0后的重鏈序列。這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要事先對抗體結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì),可適用于任何其他抗體的人源化改造。改型抗體與表面重塑抗體相比較,是從不同角度解決人源化的問題,表面重塑抗體不必從一級(jí)序列上進(jìn)行人源化,而是僅僅從抗體2抗原識(shí)別的角度出發(fā),改變那些抗體識(shí)別的表面氨基酸殘基。從技術(shù)操作上,兩種線路展示了相同研制手段的兩個(gè)側(cè)面,都是先通過分子設(shè)計(jì)構(gòu)建可變區(qū)立體構(gòu)象;CDR 移植是在人可變區(qū)基礎(chǔ)上確定哪些氨基酸殘基必須保留具有抗原特異性的親本鼠源性,而表面重塑人源化則是在非人源可變區(qū)基礎(chǔ)上確定哪些殘基需要改為人源性。噬菌體展示技術(shù)能將特定

21、分子的基因型和表型統(tǒng)一在同一個(gè)病毒顆粒內(nèi),可同時(shí)提高其選擇能力和擴(kuò)增能力,作為抗體技術(shù)領(lǐng)域中令人矚目的新進(jìn)展,目前已顯示其取代雜交瘤技術(shù)的趨勢,特別在抗體人源化的應(yīng)用中已逐漸成為常規(guī)的實(shí)驗(yàn)手段。參考文獻(xiàn):112M c Caffert y J,G riffit h s A D,W i nter G,et a.l Phage anti bod ies:fil2 am entous ph age d is p layi ng anti body vari able do m ai n s1J2.Nature1990,348:5522554.122G reen L L.An ti body engi

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