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技術(shù)路線(xiàn) 雙光子激光建立斑馬魚(yú)脊髓損傷模型的探索 明場(chǎng)下對(duì)脊髓定位 利用雙光子強(qiáng)激光對(duì)脊髓進(jìn)行深度掃描切割損傷 12小時(shí)后做縱切切片 利用生物胞素抗體做免疫染色 判斷損傷的位置與大小是否與符合 前期實(shí)驗(yàn) 手術(shù)建模 手術(shù)組 n 68 假手術(shù)組 n 68 建模成功性分析 每周分析術(shù)后運(yùn)動(dòng)能力 連續(xù)跟蹤7周 基因芯片分析 提總RNA分析全部基因的表達(dá)水平 統(tǒng)計(jì)分析各個(gè)基因表達(dá)變化 定量PCR 提總RNA反轉(zhuǎn)錄檢測(cè)sema4e和plxnd1相對(duì)內(nèi)參GADPH表達(dá)水平的變化 原位雜交 制作切片制作探針檢測(cè)sema4e和plxnd1mRNA的表達(dá)水平變化及表達(dá)細(xì)胞 WestenBolt 提總蛋白檢測(cè)sema4e和plxnd1蛋白表達(dá)水平的變化 取脊髓 損傷位點(diǎn)以下1cm 術(shù)后4hour 12hour 6day 11day組 sema4e與plxnd1關(guān)系研究 sema4e活性片段DNA的擴(kuò)增 sema4e特異性肽段的設(shè)計(jì)與合成 sema4e表達(dá)載體的構(gòu)建 表達(dá)載體的導(dǎo)入 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選與培養(yǎng) 表達(dá)蛋白的提取 表達(dá)蛋白的活性檢測(cè) sema4e免疫磁珠的制作 sema4e與plxnd1免疫共沉淀 噬菌體展示技術(shù)淘選抗體 ELISA檢測(cè)抗體活性 ELISA檢測(cè)抗體專(zhuān)一性 sema4e與plxnd1免疫共定位 sema4e與plxnd1在斑馬魚(yú)脊髓損傷修復(fù)中的作用研究 前期結(jié)果 Beforelesion Red shamoperation n 10 Blue operation n 10 圖1 斑馬魚(yú)脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)能力的變化 RealtimePCR timepoints changefolds 10X 10X 10X 10X 10X anti senseprobessham4hour12hour11day 10X 10X 10X anti senseprobessham4hour12hour11day sema4e plxnd1 10X 10X 通過(guò)雙光子顯微鏡活體觀(guān)察斑馬魚(yú)脊髓內(nèi)的血管 plxnd1在血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá) 10X 20X 此課

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